Name: Utilizzo dellanalizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-01T12:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Scopri l'analisi metabolica in tempo reale degli osteoblasti per studiare la bioenergetica cellulare e la produzione di ATP. Questo metodo consente di valutare i meccanismi energetici ossei con precisione.

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Questo lavoro è stato supportato dal National Institute of Health (NIH) National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases (NIAMS) Grant AR072123 e National Institute on Aging (NIA) Grant AG069795 (a ERR).

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<li>Kam, Y., Jastromb, N., Clayton, J., Held, P., Dranka, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKam%2C+Y+%22Normalization+of+agilent+seahorse+XF+data+by+in-situ+cell+counting+using+a+BioTek+cytation+5+application+note%22">Normalization of agilent seahorse XF data by in-situ cell counting using a BioTek cytation 5 application note</a>. , (2017).</li>
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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale può essere utilizzato per esplorare l'energetica cellulare in diverse condizioni. Il protocollo illustra l'isolamento efficiente delle BMSC, la coltura delle cellule in piastre di coltura cellulare appropriate e la loro differenziazione in osteoblasti maturi, che possono essere utilizzati per vari saggi utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare. Inoltre, vengono spiegate in dettaglio anche le fasi critiche del test del flusso metabolico cellulare in ...

La formazione dell'osso da parte dell'osteoblasto è accompagnata da distruzione coordinata o riassorbimento delle ossa da parte degli osteoclasti. L'equilibrio tra formazione ossea osteoblastica e riassorbimento osteoclasto è un processo accoppiato che descrive il turnover osseo o il rimodellamento, che è essenziale per l'omeostasi scheletrica. La disfunzione degli osteoblasti porta a una compromissione della formazione ossea e provoca varie malattie, tra cui l'osteoporosi 1,2,3. La differenziazione ex vivo/in vitro delle cellule staminali stromali del midollo osseo (BMSC) in precursori di osteoblasti e osteoblasti maturi provoca la formazione e la deposizione della matrice ossea mineralizzata nel vaso di coltura nel tempo 4,5,6. Questa formazione ossea da parte dell'osteoblasto richiede una quantità significativa di energia cellulare. In particolare, la sintesi e la secrezione di collagene hanno dimostrato di fare molto affidamento sull'ATP cellulare: i rapporti ADP e, presumibilmente, il traffico e la secrezione di vescicole mineralizzate richiedono ulteriore ATP 7,8,9,10,11. Molti ricercatori hanno dimostrato che il processo di osteoblastogenesi e la funzione degli osteoblasti richiede un adeguato apporto di energia per soddisfare la domanda metabolica di formazione ossea 12,13,14,15,16. Pertanto, l'obiettivo di questo metodo è quello di caratterizzare lo stato bioenergetico delle cellule stromali murine primarie attraverso la differenziazione degli osteoblasti utilizzando l'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale. Queste tecniche aiutano a sviluppare una migliore comprensione dell'omeostasi scheletrica, che può alla fine portare allo sviluppo di nuove opzioni terapeutiche in grado di migliorare i disturbi scheletrici.
L'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale può essere utilizzato per misurare il tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) degli osteoblasti vivi, che corrisponde rispettivamente alla produzione di ATP mitocondriale e glicolitico. Fondamentale per questa metodologia è il fatto che uno ione H + per lattato viene rilasciato durante la glicolisi nella conversione del glucosio in lattato, che altera il pH del mezzo riflesso nei valori ECAR. Al contrario, durante il ciclo TCA (acido tricarbossilico), la fosforilazione ossidativa attraverso i mitocondri produce CO2 utilizzando o consumando ossigeno, e quindi il monitoraggio dell'OCR riflette questo processo metabolico. L'analizzatore misura sia l'OCR che l'ECAR nel microambiente extracellulare contemporaneamente e in tempo reale, il che consente un enorme potenziale quando si studia la bioenergetica cellulare 6,17. Inoltre, l'esecuzione di questi test è relativamente semplice e facilmente personalizzabile a seconda dell'obiettivo sperimentale. Tecniche simili sono state impiegate per comprendere ulteriormente la regolazione metabolica delle cellule T del sistema immunitario18,19, l'inizio del cancro e la progressione20, insieme a più altri tipi di cellule che contribuiscono alle sindromi metaboliche21,22.
I vantaggi dell'analizzatore di flusso metabolico in tempo reale rispetto alle tecniche alternative includono (1) la capacità di misurare la bioenergetica cellulare delle cellule vive in tempo reale, (2) la capacità di eseguire test con un numero relativamente piccolo di cellule (richiede un minimo di 5.000 cellule), (3) porte di iniezione per manipolare parallelamente più trattamenti in un sistema ad alto rendimento a 96 pozzetti, (4) l'uso di imager di cellule automatizzate prive di etichette radioattive per la normalizzazione18, 23,24. I seguenti metodi mirano a fornire una descrizione generalizzata ma dettagliata del monitoraggio della bioenergetica cellulare nelle BMSC murine durante la differenziazione degli osteoblasti utilizzando l'analizzatore. Includerà saggi eseguiti di routine; tuttavia, come per molte tecniche e metodi, è altamente incoraggiato che i singoli laboratori determinino dettagli specifici per i loro esperimenti.
Selezione di saggi e diversi tipi di saggi disponibili: È disponibile un'ampia varietà di kit di analisi e reagenti per studiare la bioenergetica delle cellule, garantendo al contempo l'affidabilità e la coerenza dei risultati sperimentali. Inoltre, il software desktop offre anche modelli di analisi che possono essere facilmente personalizzati. Il test può essere definito in base alle esigenze dell'utente di misurare diversi parametri metabolici. Questi saggi possono essere modificati in vari modi in base all'obiettivo sperimentale e/o alla domanda scientifica. Ad esempio, con quattro porte di iniezione, è possibile iniettare più composti nel mezzo di analisi per analizzare la risposta cellulare specifica per ciascuna via metabolica.
Test del fenotipo dell'energia cellulare: Questo test misura il fenotipo metabolico e il potenziale metabolico delle cellule vive. Questo test è anche raccomandato come primo passo per avere un'idea generalizzata del metabolismo specifico del percorso. Una miscela di oligomicina A-an inibitore di ATP sintasi e Carbonil cianuro 4-(trifluorometoossi) fenilidrazone (FCCP) - un agente di disaccoppiamento mitocondriale viene iniettato per comprendere il potenziale energetico cellulare. L'iniezione di oligomicina A inibisce la sintesi di ATP, con conseguente aumento del tasso di glicolisi (ECAR) per consentire alle cellule di soddisfare le loro richieste energetiche; d'altra parte, l'iniezione di FCCP si traduce in un OCR più elevato a causa della depolarizzazione della membrana mitocondriale. Essenzialmente, questo test raffigura la respirazione metabolica basale e, a seguito delle doppie iniezioni, spinte o stress, la risposta metabolica. Sulla base di questi parametri, il software traccia quindi OCR ed ECAR delle cellule classificando le cellule come stato aerobico, quiescente, glicolitico o energetico nel tempo25,26.
Saggio del tasso di produzione in tempo reale ATP: Questo misura la produzione cellulare di ATP contemporaneamente dalla glicolisi e dalla respirazione mitocondriale. Questo test misura quantitativamente i cambiamenti metabolici dalle due vie energetiche e fornisce dati sui tassi di produzione di ATP mitocondriale e glicolitico nel tempo. Il test ottiene dati basali OCR ed ECAR seguiti dal calcolo del tasso di produzione di ATP mitocondriale attraverso l'iniezione di oligomicina A e il tasso di produzione di ATP glicolitico attraverso l'iniezione di rotenone + antimicina A miscela (inibizione totale della funzione mitocondriale), con conseguente acidificazione mitocondriale17,27.
Test da sforzo dei mitocondri cellulari (o test da sforzo mito cellulare): Questo misura la funzione mitocondriale attraverso la respirazione legata all'ATP, quantifica la bioenergetica cellulare, identifica la disfunzione mitocondriale e misura la risposta delle cellule allo stress. Vari parametri, tra cui la capacità respiratoria basale e di riserva, la respirazione legata all'ATP, la respirazione massima e il consumo di ossigeno non mitocondriale, possono essere ottenuti in un unico test. Questo test prevede iniezioni sequenziali di oligomicina A, FCCP (agente di disaccoppiamento mitocondriale), una miscela di inibitori del rotenone/antimicina A per analizzare in modo efficiente l'effetto di questi sulla funzione mitocondriale28.
Flessibilità mito fuel flex test: Questo misura il tasso di respirazione mitocondriale dall'ossidazione dei tre combustibili mitocondriali primari dalla presenza e dall'assenza dei loro inibitori. L'inibizione sequenziale di glucosio, glutammina e acidi grassi aiuta a misurare la dipendenza, la capacità e la flessibilità delle cellule e la dipendenza delle cellule in vari percorsi cellulari per soddisfare la domanda di energia. Quando i mitocondri non possono soddisfare le richieste del percorso bloccato di interesse ossidando altri combustibili, le cellule entrano in uno stato di dipendenza. La capacità delle cellule è calcolata dall'inibizione delle altre due vie alternative seguite dall'inibizione della via di interesse. La flessibilità delle cellule aiuta a comprendere la capacità dei mitocondri di compensare e soddisfare il fabbisogno di carburante della via inibita. Viene calcolato sottraendo la dipendenza delle cellule dalla capacità delle celle. Tre diversi inibitori vengono utilizzati indipendentemente o come miscela di due per calcolare efficacemente i parametri del saggio. L'acido 2-ciano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoico (UK5099) inibisce l'ossidazione del glucosio bloccando il vettore piruvato nella glicolisi. Bis-2-(5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazol-2-il) (BPTES) solfuro di etile inibisce la via di ossidazione della glutammina ed etomoxir inibisce l'ossidazione degli acidi grassi a catena lunga29.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig01.jpg"> Figura 1: Rappresentazione schematica della metodologia per la coltivazione e la preparazione degli osteoblasti per l'analisi. I BMSC murini sono isolati dalle ossa lunghe, coltivati e seminati in piastre a 96 pozzetti a 25.000 cellule / densità del pozzo. La coltura di queste cellule in mezzi specifici per osteoblasti viene avviata quando raggiungono l'80% -100% di confluenza per iniziare la loro differenziazione. I saggi vengono eseguiti in diverse fasi di differenziazione. Le piastre della cartuccia vengono idratate un giorno prima del test. Il giorno del test, diversi inibitori vengono iniettati nelle porte delle cartucce del sensore in base ai requisiti del test e un buffer di calibrazione viene aggiunto alla piastra di calibrazione a 96 pozzetti. Dopo la calibrazione, viene eseguito il test del flusso metabolico cellulare in tempo reale, seguito dall'imaging della micropiastra di coltura cellulare utilizzando l'imager a micropiastre per normalizzare i dati dell'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale con il conteggio cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63142/63142fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,25% Tripsina EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>2-ciano-3-(1-fenil-1H-indol-3-il)-2-propenoico</td><td>acido Sigma - Aldrich</td><td>PZ0160</td><td>UK5099</td></tr><tr><td>Antimicina A Sigma</td><td>- Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Acido ascorbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bis-2-(5-fenilacetamido-1,3,4-tiadiazolo-2-il)solfuro di etile</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>SML0601</td><td>BPTES</td></tr><tr><td>Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP</td></tr><tr><td>Cytation 5 lettore di immagini</td><td>BioTek</td><td>N/A Imager</td><td>per micropiastre</td></tr><tr><td>Etomoxir sale di sodio idrato</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>E1905</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Soluzione (20 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>Acido oleico-Albumina da siero bovino</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>O3008</td><td></td></tr><tr><td>Oligomicina A - 5 mg</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma - Aldrich</td><td>R8875-1G</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 1.0 M Soluzione di glucosio</td><td>Agilent Technologies</td><td>103577-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 100mM Piruvato Soluzione</td><td>Agilent Technologies</td><td>103578-100</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF 200mM Soluzione di glutammina</td><td>Agilent Technologies</td><td>103579-100</td><td></td></tr><tr><td>Terreni DMEM Seahorse XF</td><td>Agilent Technologies</td><td>103575-100</td><td>Terreni per test DMEM con 5mM HEPES, pH 7,4, senza rosso fenolo, bicarbonato di sodio, glucosio, piruvato e L-glutammina</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 Analyzer</td><td>Agilent Technologies</td><td>S7800B</td><td>Analizzatore di flusso metabolico in tempo reale Seahorse</td></tr><tr><td>XFe96 FluxPak</td><td>Agilent Technologies</td><td>102416-100</td><td>Include cartucce per sensori XFe96, micropiastre per colture cellulari e soluzione calibrante Seahorse XF</td></tr><tr><td>Il software per l'imaging cellulare 1.1.0.11</td><td>Agilent Technologies - Software BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wave 2.6.1</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&beta;-glicerolo fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422-50G</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Using Real-Time Cell Metabolic Flux Analyzer to Monitor Osteoblast Bioenergetics

La formazione ossea da parte degli osteoblasti è un processo essenziale per una corretta acquisizione ossea e il turnover osseo per mantenere l'omeostasi scheletrica e, in definitiva, prevenire la frattura. Nell'interesse sia di ottimizzare la massa ossea di picco che di combattere varie malattie muscoloscheletriche (ad esempio, osteoporosi post-menopausale, anoressia nervosa, diabete mellito di tipo 1 e 2), sono stati fatti sforzi incredibili nel campo della biologia ossea per caratterizzare completamente gli osteoblasti durante tutto il loro processo di differenziazione. Dato il ruolo primario degli osteoblasti maturi per secernere proteine della matrice e vescicole di mineralizzazione, è stato notato che questi processi richiedono un'incredibile quantità di energia cellulare, o adenosina trifosfato (ATP). Lo stato energetico cellulare complessivo è spesso indicato come bioenergetica cellulare e include una serie di reazioni metaboliche che rilevano la disponibilità del substrato a derivare ATP per soddisfare le esigenze cellulari. Pertanto, l'attuale metodo descrive in dettaglio il processo di isolamento delle cellule stromali primarie del midollo osseo murino (BMSC) e il monitoraggio del loro stato bioenergetico utilizzando l'analizzatore del flusso metabolico cellulare in tempo reale in varie fasi della differenziazione degli osteoblasti. È importante sottolineare che questi dati hanno dimostrato che il profilo metabolico cambia drasticamente durante la differenziazione degli osteoblasti. Pertanto, è necessario utilizzare questo tipo di cellula fisiologicamente rilevante per apprezzare appieno come lo stato bioenergetico di una cellula possa regolare la funzione complessiva.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63142/63142fig06.jpg"> Figura 6: Grafici rappresentativi per i saggi eseguiti di routine per comprendere il profilo bioenergetico cellulare del gruppo di controllo rispetto al gruppo di trattamento con i rispettivi errori standard. (A) Il test del fenotipo dell'energia cellulare. Il grafico rappresenta la glicolisi (ECAR) vs. respirazione mitocondr...

Il saggio del flusso metabolico cellulare in tempo reale misura il tasso di consumo di ossigeno e il tasso di acidificazione extracellulare, che corrisponde alla produzione di adenosina trifosfato mitocondriale e glicolitica, utilizzando sensori di pH e ossigeno. Il manoscritto spiega un metodo per comprendere lo stato energetico degli osteoblasti e la caratterizzazione e l'interpretazione dello stato bioenergetico cellulare.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

Bone formation by osteoblasts is an essential process for proper bone acquisition and bone turnover to maintain skeletal homeostasis, and ultimately, ...

Questo metodo è utile per determinare l'energetica cellulare, come il tasso di produzione di ATP, e anche per determinare la preferenza cellulare verso un particolare metabolita in tempo reale. Per iniziare, aggiungere 200 microlitri di calibrante XF e incubare la piastra di utilità per almeno un'ora prima del test. Preparare 80 millilitri di supporti di analisi XF utilizzando XF DMEM integrato.Scongelare oligomicina A, rotenone e antimicina A sul ghiaccio. Pipettare i composti su e giù per solubilizzarli prima dell'uso. Aggiungere tre millilitri di mezzo di saggio preparato a ciascun tubo, etichettati A e B.Aggiungere 26,4 microlitri di oligomicina A da 2,5 millimolari nel tubo A e 3,1 microlitri di 12,67 millimolare rotenone, 4,1 microlitri di antimicina A millimolare e 30 microlitri la colorazione di Hook nel tubo B.Caricare una concentrazione 10x di questi inibitori nella porta di iniezione corrispondente.E infine, 20 microlitri di questi composti saranno caricati nelle cellule in 200 microlitri di mezzi di analisi. Rimuovere la micropiastra di coltura cellulare dall'incubatore a 37 gradi Celsius e osservare le cellule al microscopio. Rimuovere il mezzo di analisi dal bagno d'a

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Biologia

Una descrizione di un metodo per la profilatura funzione mitocondriale nelle cellule è fornito. Il profilo mitocondriale generato fornisce quattro parametri della funzione mitocondriale, che può essere misurata in un esperimento: frequenza respiratoria basale, ATP-linked respirazione, perdita protonica, e la capacità di riserva.

Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

Questo protocollo fornisce un approccio biochimico per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) delle cellule leucemiche primarie con saggio del flusso extracellulare. La valutazione del profilo metabolico di queste cellule aiuta a caratterizzare le loro richieste, portando a una terapia personalizzata.

Saggio del flusso extracellulare: un metodo per misurare il profilo metabolico delle cellule

Fonte:Elettra Leo1, Luiza H.D. Cardoso1, Sabine Schmitt1, Erich Gnaiger11Strumenti OroborosQuesto video spiega come il flusso di ossigeno viene utilizzato per valutare la respirazione mitocondriale nelle cellule di mammifero viventi e permeabilizzate. Dimostra l'uso sequenziale della digitonina, dei substrati metabolici, dell'ADP, di un disaccoppiatore e di un inibitore per caratterizzare diversi stati respiratori. Il profilo del flusso di ossigeno risultante rivela la funzione mitocondriale e...

Misure del flusso di ossigeno per valutare la respirazione mitocondriale in cellule viventi e permeabilizzate

Questo video dimostra il metodo per analizzare il metabolismo energetico nelle cellule NK umane attivate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Diversi inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni influenzano la sintesi di ATP, che viene misurata attraverso il tasso di consumo di ossigeno o OCR, fornendo informazioni sul metabolismo cellulare e sulla bioenergetica.

Monitoraggio in tempo reale del metabolismo energetico nelle cellule NK umane utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

La riprogrammazione metabolica è una caratteristica e un prerequisito per la polarizzazione dei macrofagi M1 e M2. Questo manoscritto descrive un test per la misurazione dei parametri fondamentali della glicolisi e della funzione mitocondriale nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo. Questo strumento può essere applicato per studiare come particolari fattori influenzano il metabolismo e il fenotipo del macrofago.

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

Lo stato metabolico delle cellule epiteliali pigmentate retiniche umane (H-RPE) riflette la loro salute e funzione. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per esaminare il flusso metabolico in tempo reale di H-RPE utilizzando respirometria ad alta risoluzione.

Analisi in tempo reale della bioenergetica in cellule epiteliali pigmentate primarie della retina umana mediante respirometria ad alta risoluzione

Descriviamo protocolli graduali che misurano la respirazione mitocondriale di neutrofili di topo e umani e cellule HL60 utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare metabolico.

Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Presentiamo un protocollo per permeabilizzare selettivamente la membrana plasmatica, consentendo la somministrazione mirata di substrati e inibitori per valutare la fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) nelle cellule coltivate, superando le barriere di trasporto della membrana plasmatica che tipicamente ostacolano tale analisi. Utilizzando questa tecnica, abbiamo dimostrato come la funzione di OXPHOS sia modulata da agonisti muscarinici e antagonisti.

Modulazione colinergica dipendente dal ligando dell'accoppiamento fosforilazionale ossidativo nelle cellule neuroblastoma BE(2)-C permeabilizzate dalla digitonina

Vi presentiamo un nuovo e potente integrazione di nanofotonica (QD-FRET) e microfluidica per studiare la formazione di polyplexes polielettrolita, che si prevede di fornire un migliore controllo e la sintesi di polyplexes uniforme e personalizzabili per i futuri nucleici terapie a base di acido.

Combinando QD-FRET e microfluidica per il monitoraggio Nanocomplex DNA di auto-assemblaggio in tempo reale

Scopri l'analisi metabolica in tempo reale degli osteoblasti per studiare la bioenergetica cellulare e la produzione di ATP. Questo metodo consente di valutare i meccanismi energetici ossei con precisione.

Utilizzo dell'analizzatore di flusso metabolico cellulare in tempo reale per monitorare la bioenergetica degli osteoblasti

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