Name: Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Impara a isolare RNA specifici del tipo cellulare da tessuti eterogenei congelati senza selezione cellulare. Questo metodo utilizza il modello murino NuTRAP e pull-down GLP per estrarre RNA di alta qualità da popolazioni cellulari piccole.

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Questo lavoro è stato parzialmente supportato da NIH R00HD082686. Ringraziamo la Endocrine Society Summer Research Fellowship a H.S.Z. Ringraziamo anche il Dr. Yuan Kang per aver allevato e mantenuto la colonia di topi.

Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti hanno seguito i protocolli approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) dell'Università di Auburn.
NOTA: Il seguente protocollo utilizza un testicolo (circa 100 mg) a P28 da Gli1-CreERT2; Topi NuTRAP (Mus musculus). Potrebbe essere necessario regolare i volumi dei reagenti in base ai tipi di campioni e al numero di tessuti.
1. Raccolta dei tessuti
<ol><li>Eutanasia i topi usando una camera CO2 , disinfettare la superficie dell'addome con etanolo al 70%.</li>
	<li>Aprire l'addome inferiore con le forbici e rimuovere i testicoli. Utilizzare azoto liquido (LN2) per congelare immediatamente i testicoli.</li>
	<li>Conservare i campioni nella fase vapore di LN2 fino all'uso.</li>
</ol>2. Preparazione di reagenti e perline
<ol><li>Preparare la soluzione madre di omogeneizzazione: aggiungere 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl, 1% NP-40 e 1 mg/mL di eparina. Conservare la soluzione a 4 °C fino all'uso (fino a 1 mese).</li>
	<li>Preparare il tampone di lavoro di omogeneizzazione dalla soluzione madre (fase 2.1) fresco prima dell'uso: aggiungere DTT (concentrazione finale: 1 mM), cicloeximide (concentrazione finale: 100 μg/ml), ribonucleasi ricombinante (concentrazione finale: 200 unità/ml) e cocktail inibitore della proteasi (concentrazione finale: 1x) alla soluzione madre di omogeneizzazione per ottenere la quantità necessaria del tampone di lavoro di omogeneizzazione. Conservare il tampone di lavoro appena preparato su ghiaccio fino all'uso.</li>
	<li>Preparare i tamponi di lavaggio a basso contenuto di sale e ad alto contenuto di sale:<ol><li>Per preparare tamponi di lavaggio a basso contenuto di sale miscelare 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 100 mM KCl e 1% NP-40. Aggiungere DTT (concentrazione finale: 1 mM) e cicloeximide (concentrazione finale: 100 μg/ml) prima dell'uso.</li>
		<li>Per preparare la miscela tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale 50 mM Tris (pH 7,4), 12 mM MgCl2, 300 mM KCl, 1% NP-40. Aggiungere DTT (concentrazione finale: 2 mM) e Cycloheximide (concentrazione finale: 100 μg/mL) prima dell'uso.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare le perle di proteina G (tabella dei materiali):<ol><li>Ogni campione avrà bisogno di 50 μL di perle di proteina G. Posizionare la quantità necessaria di sfere in una provetta da centrifuga da 1,5 ml e separare le sfere dalla soluzione utilizzando un rack magnetico lasciando il tubo sul rack per 30-60 s.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante mediante pipettaggio. Lavare le perline tre volte con 1 mL di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale ghiacciato ogni volta.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Lisi tissutale e omogeneizzazione
<ol><li>Aggiungere 2 ml di tampone di lavoro per omogeneizzazione ghiacciato (preparato al momento dal punto 2.2) a un set di smerigliatrice di tessuto di vetro. Posizionare rapidamente il campione congelato nel macinino e omogeneizzare il tessuto con 30 colpi sul ghiaccio usando un pestello sciolto.</li>
	<li>Trasferire l'omogenato in una provetta a fondo tondo da 2 mL e centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 2 ml. Risparmiare 100 μL in un tubo da 1,5 mL come "input".</li>
	<li>Incubare il surnatante nella provetta da 2 mL con l'anticorpo anti-GFP (5 μg/mL; 1:400) a 4 °C su un rotatore end-over-end (24 rpm) durante la notte.</li>
</ol>4. Immunoprecipitazione
<ol><li>Trasferire la miscela omogenato/anticorpo in un nuovo tubo a fondo tondo da 2 mL contenente le sfere di proteina G lavate dal punto 2.4. Incubare a 4 °C su un rotatore end-over-end (24 rpm) per 2 ore.</li>
	<li>Separare le sfere magnetiche dal surnatante usando un rack magnetico. Salva il surnatante come "frazione negativa". La frazione negativa contiene (1) RNA nelle cellule EGFP-negative e (2) RNA nelle cellule EGFP-positive che non sono legate ai ribosomi.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio ad alto contenuto di sale alle perline e ruotare brevemente il tubo per lavare le perline. Posizionare il tubo in un rack magnetico.</li>
	<li>Rimuovere il tampone di lavaggio. Ripetere la fase di lavaggio altre due volte. Le perle ora contengono il complesso beads-ribosoma-RNA da cellule EGFP-positive.</li>
</ol>5. Estrazione dell'RNA
NOTA: I seguenti passaggi sono adattati dal kit di isolamento dell'RNA (Tabella dei materiali). Trattare ogni frazione (cioè input, positivo e negativo) come un campione indipendente e isolare gli RNA in modo indipendente.
<ol><li>Incubare le sfere dal punto 4.4 con 50 μL di tampone di estrazione (dal kit di isolamento dell'RNA) in un termomiscelatore (42 °C, 500 rpm) per 30 minuti per rilasciare RNA dalle perle.</li>
	<li>Separare le perle con un rack magnetico, trasferire il surnatante che contiene il complesso perline-ribosoma-RNA in un tubo da 1,5 ml.</li>
	<li>Centrifugare il tubo a 3000 x g per 2 minuti, quindi pipettare il surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Questo tubo contiene la "frazione positiva" del passo TRAP. NOTA: Per le frazioni in ingresso e negative, estrarre l'RNA da 25 μL di campioni utilizzando 1 mL di tampone di estrazione. Incubare in un termomiscelatore (42 °C, 500 giri/min) per 30 min.</li>
	<li>Pre-condizionare la colonna di purificazione dell'RNA: pipettare 250 μL di tampone di condizionamento sulla colonna di purificazione. Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Centrifugare la colonna a 16.000 x g per 1 min.</li>
	<li>Pipet uguale volume del 70% di EtOH nel surnatante dal passo 5.3 (circa 50 μL di 70% EtOH per la frazione positiva e 1 mL di 70% EtOH per la frazione in ingresso e la frazione negativa). Mescolare bene pipettando su e giù.</li>
	<li>Pipettare la miscela nella colonna dal punto 5.4.</li>
	<li>Centrifugare la colonna a 100 x g per 2 minuti per consentire il legame dell'RNA alla membrana nella colonna, quindi continuare la centrifuga a 16.000 x g per 30 s immediatamente. Eliminare il flusso in corso. NOTA: Per le frazioni in ingresso e negative, aggiungere ogni volta 250 μL della miscela alla colonna. Ripetere i punti 5.6 e 5.7 fino a utilizzare tutte le miscele.</li>
	<li>Pipettare 100 μL di tampone di lavaggio 1 (W1) nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 1 minuto. Eliminare il flusso in corso.</li>
	<li>Pipetta 75 μL di soluzione di DNasi miscelare direttamente nella membrana della colonna di purificazione. Incubare a RT per 15 min.</li>
	<li>Pipettare 40 μL di W1 nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 30 s. Eliminare il flusso in corso.</li>
	<li>Pipettare 100 μL di Wash Buffer 2 (W2) nella colonna e centrifugare a 8.000 x g per 1 min. Eliminare il flusso in corso.</li>
	<li>Pipettare 100 μL di W2 nella colonna e centrifugare a 16.000 x g per 2 minuti. Eliminare il flusso in corso. Centrifugare nuovamente la stessa colonna a 16.000 x g per 1 minuto per rimuovere tutte le tracce di tampone di lavaggio prima della fase di eluizione.</li>
	<li>Trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml.</li>
	<li>Pipettare 12 μL di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana della colonna di purificazione. La punta del pipet non deve toccare la membrana. Incubare a RT per 1 min e centrifugare a 1000 x g per 1 min. Quindi continuare la centrifugazione a 16.000 x g per 1 minuto per eluire l'RNA.</li>
</ol>6. Concentrazione e qualità dell'RNA
<ol><li>Utilizzare un bioanalizzatore per valutare la qualità e la quantità dell'RNA estratto10.</li>
</ol>7. Conservazione e ulteriori analisi
<ol><li>Conservare l'RNA a -80 °C (fino a 1 anno) fino a ulteriori analisi (ad esempio, microarray, PCR quantitativa (qPCR) e RNA-seq, ecc.). NOTA: Per i dettagli dell'analisi qPCR, inclusa la sintesi del cDNA, fare riferimento a Lyu et al.11. I primer per qPCR sono elencati nella tabella dei materiali.</li>
</ol>

<ol><li>Yang, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+RNA+sequencing+reveals+dynamic+regulation+of+myocardial+noncoding+RNAs+in+failing+human+heart+and+remodeling+with+mechanical+circulatory+support%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Deep RNA sequencing reveals dynamic regulation of myocardial noncoding RNAs in failing human heart and remodeling with mechanical circulatory support.</a> Circulation. 129 (9), 1009-1021 (2014).</li>
<li>Soumillon, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+source+and+mechanisms+of+high+transcriptome+complexity+in+the+mammalian+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cellular source and mechanisms of high transcriptome complexity in the mammalian testis.</a> Cell Reports. 3 (6), 2179-2190 (2013).</li>
<li>Lake, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+subtypes+and+diversity+revealed+by+single-nucleus+RNA+sequencing+of+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neuronal subtypes and diversity revealed by single-nucleus RNA sequencing of the human brain.</a> Science. 352 (6293), 1586-1590 (2016).</li>
<li>Heiman, M., Kulicke, R., Fenster, R. J., Greengard, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+mRNA+purification+by+translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific mRNA purification by translating ribosome affinity purification (TRAP).</a> Nature Protocols. 9 (6), 1282-1291 (2014).</li>
<li>Bertin, B., Renaud, Y., Aradhya, R., Jagla, K., Junion, G. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAP-rc%2C+translating+ribosome+affinity+purification+from+rare+cell+populations+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">TRAP-rc, translating ribosome affinity purification from rare cell populations of Drosophila embryos.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (103), e52985(2015).</li>
<li>Thellmann, M., Andersen, T. G., Vermeer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28trap%29+to+investigate+Arabidopsis+thaliana+root+development+at+a+cell+type-specific+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (trap) to investigate Arabidopsis thaliana root development at a cell type-specific scale.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60919(2020).</li>
<li>Moran, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+ribosome+affinity+purification+%28TRAP%29+for+RNA+isolation+from+endothelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Translating ribosome affinity purification (TRAP) for RNA isolation from endothelial cells in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59624(2019).</li>
<li>Roh, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+transcriptional+and+epigenomic+profiling+from+specific+cell+types+within+heterogeneous+tissues+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Simultaneous transcriptional and epigenomic profiling from specific cell types within heterogeneous tissues in vivo.</a> Cell Reports. 18 (4), 1048-1061 (2017).</li>
<li>Varjosalo, M., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog%3A+functions+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog: functions and mechanisms.</a> Genes & Development. 22 (18), 2454-2472 (2008).</li>
<li>Mueller, O., Lightfoot, S., Schroeder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+integrity+number+%28RIN%29-standardization+of+RNA+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Agilent+Technologies%22%5BJournal%5D)">RNA integrity number (RIN)-standardization of RNA quality control.</a> Agilent Technologies. , Application Note 1 1-8 (2004).</li>
<li>Lyu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+reveals+sub-zones+in+mouse+adrenal+zona+fasciculata+and+the+sexually+dimorphic+responses+to+thyroid+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">RNA-seq reveals sub-zones in mouse adrenal zona fasciculata and the sexually dimorphic responses to thyroid hormone.</a> Endocrinology. 161 (9), (2020).</li>
<li>King, P., Paul, A., Laufer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shh+signaling+regulates+adrenocortical+development+and+identifies+progenitors+of+steroidogenic+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Shh signaling regulates adrenocortical development and identifies progenitors of steroidogenic lineages.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21185-21190 (2009).</li>
<li>Huang, C. C., Miyagawa, S., Matsumaru, D., Parker, K. L., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+expansion+and+organ+size+of+mouse+adrenal+is+regulated+by+sonic+hedgehog%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell expansion and organ size of mouse adrenal is regulated by sonic hedgehog.</a> Endocrinology. 151 (3), 1119-1128 (2010).</li>
<li>Benton, L., Shan, L. -X., Hardy, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+adult+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Steroid+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Differentiation of adult Leydig cells.</a> The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology. 53 (1-6), 61-68 (1995).</li>
<li>Monder, C., Hardy, M., Blanchard, R., Blanchard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+aspects+of+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase.+Testicular+11%CE%B2-hydroxysteroid+dehydrogenase%3A+development+of+a+model+for+the+mediation+of+Leydig+cell+function+by+corticosteroids%5BTitle%5D)+AND+%22Steroids%22%5BJournal%5D)">Comparative aspects of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase. Testicular 11β-hydroxysteroid dehydrogenase: development of a model for the mediation of Leydig cell function by corticosteroids.</a> Steroids. 59 (2), 69-73 (1994).</li>
<li>Bitgood, M. J., Shen, L., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sertoli+cell+signaling+by+Desert+hedgehog+regulates+the+male+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Sertoli cell signaling by Desert hedgehog regulates the male germline.</a> Current Biology. 6 (3), 298-304 (1996).</li>
<li>Beverdam, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox9-dependent+expression+of+Gstm6+in+Sertoli+cells+during+testis+development+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Sox9-dependent expression of Gstm6 in Sertoli cells during testis development in mice.</a> Reproduction. 137 (3), 481(2009).</li>
<li>Gross, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+single-cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Technologies for single-cell isolation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 16897-16919 (2015).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Molecular Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
<li>Nguyen, Q. H., Pervolarakis, N., Nee, K., Kessenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+considerations+for+single-cell+rna+sequencing+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Experimental considerations for single-cell rna sequencing approaches.</a> Frontiers in Cell and Development Biology. 6, 108(2018).</li>
<li>Chucair-Elliott, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+cell-specific+mouse+models+for+paired+epigenetic+and+transcriptomic+studies+of+microglia+and+astroglia%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Inducible cell-specific mouse models for paired epigenetic and transcriptomic studies of microglia and astroglia.</a> Communications Biology. 3 (1), 693(2020).</li>
<li>Barsoum, I., Yao, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundant+and+differential+roles+of+transcription+factors+Gli1+and+Gli2+in+the+development+of+mouse+fetal+Leydig+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Redundant and differential roles of transcription factors Gli1 and Gli2 in the development of mouse fetal Leydig cells.</a> Biology of Reproduction. 84 (5), 894-899 (2011).</li>
<li>Mori, H., Shimizu, D., Fukunishi, R., Christensen, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+analysis+of+testicular+Leydig+cells+in+normal+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Morphometric analysis of testicular Leydig cells in normal adult mice.</a> The Anatomical Record. 204 (4), 333-339 (1982).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

L'utilità dell'analisi del trascrittoma dell'intero tessuto potrebbe essere smorzata, specialmente quando si studiano tessuti eterogenei complessi. Come ottenere RNA specifici del tipo di cellula diventa una necessità urgente per scatenare la potente tecnica RNA-seq. L'isolamento degli RNA specifici del tipo di cellula di solito si basa sulla raccolta di un tipo specifico di cellule mediante micromanipolazione, selezione cellulare attivata da fluorescente (FACS) o microdissezione a cattura laser (LCM)18...

Gli approcci ad alto rendimento, tra cui il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) e il microarray, hanno reso possibile interrogare i profili di espressione genica a livello dell'intero genoma. Per tessuti complessi come cuore, cervello e testicolo, i dati specifici del tipo di cellula forniranno maggiori dettagli confrontando l'uso di RNA dall'intero tessuto 1,2,3. Per superare l'impatto dell'eterogeneità cellulare, il metodo Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) è stato sviluppato fin dai primi anni 20104. TRAP è in grado di isolare RNA legati al ribosoma da specifici tipi di cellule senza dissociazione tissutale. Questo metodo è stato utilizzato per l'analisi del translatoma (mRNA che vengono reclutati nel ribosoma per la traduzione) in diversi organismi, incluso il targeting di una popolazione estremamente rara di cellule muscolari negli embrioni di Drosophila5, lo studio di diverse cellule radicali nella pianta modello Arabidopsis thaliana6 e l'esecuzione dell'analisi del trascrittoma delle cellule endoteliali nei mammiferi7.
La TRAP richiede una modificazione genetica per marcare il ribosoma di un organismo modello. Evan Rosen e colleghi hanno recentemente sviluppato un modello murino chiamato Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) mouse8, che è disponibile attraverso il Jackson Laboratory dal 2017. Incrociando con una linea murina Cre, i ricercatori possono utilizzare questo modello murino NuTRAP per isolare gli RNA legati al ribosoma e i nuclei cellulari dalle cellule che esprimono Cre senza ordinamento cellulare. Nelle cellule che esprimono Cre, che trasportano anche l'allele NuTRAP , il ribosoma marcato EGFP/L10a consente l'isolamento degli mRNA traduttori mediante saggi di pulldown di affinità. Nella stessa cellula, la membrana nucleare marcata con peptide di riconoscimento della biotina ligasi (BLRP), che è anche mCherry positiva, consente l'isolamento nucleare utilizzando la purificazione basata sull'affinità o sulla fluorescenza. Lo stesso team di ricerca ha anche generato una linea di topi simile in cui la membrana nucleare è etichettata solo con mCherry senza biotina8. Queste due linee di topi geneticamente modificati danno accesso alla caratterizzazione di profili epigenomici e trascrittomici accoppiati di specifici tipi di cellule in interesse.
La via di segnalazione del riccio (Hh) svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo dei tessuti9. GLI1, un membro della famiglia GLI, agisce come attivatore trascrizionale e media la segnalazione Hh. Le cellule Gli1+ possono essere trovate in molti organi secernenti ormoni, tra cui la ghiandola surrenale e il testicolo. Per isolare DNA e RNA specifici del tipo di cellula dalle cellule Gli1+ utilizzando il modello murino NuTRAP, i topi Gli1-CreERT2 sono stati incrociati con i topi NuTRAP. I topi Shh-CreERT2 sono stati anche incrociati con i topi NuTRAP per isolare le cellule che esprimono il riccio sonico (Shh). Il seguente protocollo mostra come utilizzare Gli1-CreERT2; Topi NuTRAP per isolare gli RNA legati al ribosoma dalle cellule Gli1+ nei testicoli di topo adulto.

<table><tbody><tr><td>Actb</td><td>eurofins</td><td>primer qPCR</td><td>ATGGAGGGGAATACAGCCC / TTCTTTGCAGCTCCTTTTT (primer diretto/primer inverso)</td></tr><tr><td>Bioanalyzer</td><td>Agilent</td><td>2100 Bioanalyzer Instrument</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Millipore</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>cicloesimmide</td><td>Millipore</td><td>239764-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Cyp11a1</td><td>eurofins</td><td>primer qPCR</td><td>CTGCCTCCAGACTTCTTTCG / TTCTTGAAGGGCAGCTTGTT (primer diretto/primer inverso)</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>DTT, Ditiotreitolo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 magnete</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Provette Falcon 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>GFP anticorpo</td><td>Abcam</td><td>ab290</td><td></td></tr><tr><td>Set di smerigliatrici per vetro</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357542</td><td></td></tr><tr><td>eparina</td><td>BEANTOWN CHEMICAL</td><td>139975-250MG</td><td></td></tr><<tr><td>em>Hsd3b</td><td>eurofins</td><td>primer qPCR</td><td>GACAGGAGCAGGGTTTGTG / CACTGGGCATCCAGAATGTCTC (primer diretto/primer inverso)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Biosciences</td><td>R005</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biosciences</td><td>R004</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga 2 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-707-354</td><td></td></tr><tr><td>Microarray per test Clariom S di topo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Servizio di microarray</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Millipore</td><td>492018-50 Ml</td><td></td></tr><tr><td>oligo (dT)20</td><td>Kit</td> di isolamento <td>dell'RNA</td> Invitrogen 18418020 <td></td></tr><tr><td>PicoPure</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>KIT0204</td><td></td></tr><tr><td>Protein G Dynabead</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>Cellule di crescita</td><td>in acqua senza RNasi</td><td>NUPW-0500</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Inibitore ribonucleasico ricombinante</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>Sox9</td><td>eurofins</td><td>primer qPCR</td><td>TGAAGAACGGACAAGCGGAG / CTGAGATTGCCCAGAGTGCT (primer diretto/primer inverso</td></tr><tr><td>Superscript IV trascrittasi inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Sycp3</td><td>eurofins</td><td>primer</td> <td>qPCRGAATGTGTTGCAGCAGTGGGA /GAACTGCTCGTGTATCTGTTTGA (innesco avanti/innesco inverso)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Alfa Aesar</td><td>J62848</td><td></td></tr></tbody></table>

isolare rna specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare

Isolate Cell-Type-Specific RNAs from Snap-Frozen Heterogeneous Tissue Samples without Cell Sorting

L'eterogeneità cellulare pone sfide alla comprensione della funzione dei tessuti complessi a livello di trascrittoma. L'uso di RNA specifici del tipo di cellula evita potenziali insidie causate dall'eterogeneità dei tessuti e scatena la potente analisi del trascrittoma. Il protocollo qui descritto dimostra come utilizzare il metodo TRAP (Translating Ribosome Affinity Purification) per isolare gli RNA legati al ribosoma da una piccola quantità di cellule che esprimono EGFP in un tessuto complesso senza selezione cellulare. Questo protocollo è adatto per isolare RNA specifici del tipo di cellula utilizzando il modello murino NuTRAP recentemente disponibile e potrebbe anche essere utilizzato per isolare gli RNA da qualsiasi cellula che esprime EGFP.

Il topo Gli1-CreERT2 (Jackson Lab Stock Number: 007913) è stato prima incrociato con il topo reporter NuTRAP (Jackson Lab Stock Number: 029899) per generare topi a doppio mutante. I topi portatori di entrambi gli alleli genici geneticamente modificati (cioè Gli1-CreERT2 e NuTRAP) sono stati iniettati con tamoxifene una volta al giorno, a giorni alterni, per tre iniezioni. I campioni di tessuto sono stati raccolti il 7 ° giorno dopo il 1° giorno dell'i...

Questo protocollo mira a isolare mRNA ribosomiali traslatori specifici per tipo cellulare utilizzando il modello murino NuTRAP.

Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare

Cellular heterogeneity poses challenges to understanding the function of complex tissues at a transcriptome level. Using cell-type-specific RNAs avoids ...

Questo protocollo mira a ottenere RNA specifici di tipi cellulari di alta qualità da un piccolo numero di cellule in un tessuto complesso senza selezione cellulare. Impiega un modello murino recentemente disponibile che consente ai ricercatori di isolare un RNA legato al ribosoma utilizzando il pull down GLP. Il metodo è adatto anche per isolare gli RNA legati al ribosoma da qualsiasi cellula che esprime EGFP.Per iniziare, aggiungere due millilitri di tampone di lavoro per omogeneizzazione ghiacciata a un set di smerigliatrici di tessuto di vetro. Posizionare rapidamente il campione congelato nel macinino e omogeneizzare il tessuto con 30 colpi sul ghiaccio usando un pestello sciolto. trasferire l'omogenato in un tubo inferiore rotondo da due millilitri e centrifugare a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo da due millilitri senza disturbare il pellet, riservando 100 microlitri come input. Incubare il surnatante con l'anticorpo anti-GFP a quattro gradi Celsius su un rotatore terminale durante la notte. Trasferire la miscela omogenato e anticorpale in un nuovo tubo inferiore rotondo da due millilitri contenente perle di proteine g lavate e incubato di quattro gradi Celsius su rotatore a 24 RPM per due ore.Separare le sfere magnetiche dal surnatante usando un rack magnetico. Salvare il surnatante come frazione negativa che contiene gli RNA nelle cellule EGFP negative e gli RNA nelle cellule EGFP positive che non sono legate ai ribosomi. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio ad alto sale alle perline e ruotare brevemente il tubo per lavare le perline.Quindi posizionare il tubo in un rack magnetico. Rimuovere il tampone di lavaggio e ripetere i passaggi di lavaggio altre due volte per ottenere il complesso RNA ribosoma delle perle dalle cellule EGFP positive. Incubare le perle con 50 microlitri di tampone di estrazione dal kit di isolamento dell'RNA in un ThermoMixer per 30 minuti per rilasciare RNA dalle perle.Separare le perline con un rack magnetico e trasferire il surnatante in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 3000 g per due minuti. Quindi pipettare il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.Per pre-condizionare la colonna di purificazione dell'RNA, pipettare 250 microlitri di tampone di condizionamento sulla colonna di purificazione e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi centrifugare la colonna a 16.000 g per un minuto. Pipettare un volume uguale di etanolo al 70% nell'estratto cellulare e mescolare bene mediante pipettaggio.Pipettare fino a 200 microlitri della miscela nella colonna di purificazione dell'RNA precondizionata. Per ridurre la perdita di campioni non riempire la colonna più dell'80% della sua capacità. Ripeti questo passaggio più volte fino a quando tutti gli RNA vengono raccolti nella stessa colonna di ogni frazione.Centrifugare la colonna per due minuti per legare l'RNA alla membrana nella colonna. Quindi continuare la centrifugazione per 30 secondi. Eliminare il flusso attraverso e pipettare 100 microlitri di tampone di lavaggio uno nella colonna.Centrifugare per un minuto, quindi scartare il flusso attraverso. Pipetta 75 microlitri di soluzione di DNA si mescolano direttamente nella membrana della colonna di purificazione. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.Quindi, pipettare 40 microlitri di tampone di lavaggio uno nella colonna e centrifugare per altri 30 secondi. Scartare il flusso attraverso. Pipettare 100 microlitri di tampone di lavaggio due nella colonna e centrifugare a 8.000 g per un minuto.Scartare il flusso attraverso. Acquista PET 100 microlitri di tampone di lavaggio due nella colonna e centrifugare a 16.000 g per due minuti. Scartare il flusso attraverso e centrifugare nuovamente la stessa colonna a 16.000 g per un minuto per rimuovere tutte le tracce di tampone di lavaggio.Trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. pipettare 12 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana della colonna di purificazione assicurandosi che la punta della pipetta non tocchi la membrana. Incubare a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare a 1000 g per un minuto.Quindi a 16.000 G per un minuto per eluire l'RNA. Utilizzare un bioanalizzatore per valutare la qualità e la quantità dell'RNA estratto. Conservare gli RNA in un congelatore a 80 gradi o inviarli per ulteriori analisi.Topi portatori di entrambi gli alleli genici geneticamente modificati, Gli1-CreERT2 e NuTRAP ci viene iniettato tamoxifene una volta al giorno, a giorni alterni per tre iniezioni. L'analisi di immunofluorescenza dei tessuti raccolti mostra che l'EGFP era espresso nelle cellule interstiziali nei testicoli. EGFP è stato trovato anche nelle cellule capsulari surrenali nei topi Gli1-CreERT2, NuTRAP.In Sonic Hedgehog-CreERT2, topi NuTRAP La popolazione cellulare positiva all'EGFP risiede nella corteccia esterna della ghiandola surrenale sotto la capsula, confermando l'espressione delle cellule pre-esprimenti EGFP. Dopo l'estrazione degli RNA specifici del tipo cellulare, l'RNA estratto è stato inviato per l'analisi dei microarray. I risultati hanno mostrato che circa 3000 geni sono stati arricchiti nella frazione positiva, rispetto ai geni nella frazione negativa, mentre circa 4.000 geni sono stati arricchiti nella frazione negativa.Tra i geni differenziali espressi, i geni associati alle cellule di Leydig Hsd11b1 e Hsd3b6 sono stati arricchiti nella frazione positiva. Nella frazione negativa, i geni associati alla cellula di Sertoli Desert Hedgehog e Gstm6 sono stati arricchiti. Solo pochi geni differenzialmente espressi sono stati identificati confrontando la frazione negativa con l'input.La RT-PCR quantitativa in tempo reale è stata utilizzata per confermare l'espressione di geni chiave nelle frazioni positiva e negativa. Analogamente a quanto riscontrato nel test microarray, gli enzimi steroidogenici 3-beta idrossi steroide deidrogenasi e l'enzima di scissione della catena laterale del colesterolo sono stati arricchiti nella frazione positiva. Nel frattempo, il fattore di trascrizione nove del marcatore cellulare Sertoli SRY box e la proteina tre del complesso sinaptonemale del marcatore delle cellule germinali sono stati arricchiti nella frazione negativa.Quando si tenta questo protocollo, è importante preparare un tampone di lavoro di omogeneizzazione fresco Aggiungere DTT, ribonucleasi ricombinante cicloeximide e cocktail inibitore della proteinasi alla soluzione madre di omogeneizzazione solo prima dell'uso. È anche importante preparare i tamponi freschi a basso contenuto di sale e i tamponi di lavaggio ad alto contenuto di sale prima dell'uso.

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Impara a isolare RNA specifici del tipo cellulare da tessuti eterogenei congelati senza selezione cellulare. Questo metodo utilizza il modello murino NuTRAP e pull-down GLP per estrarre RNA di alta qualità da popolazioni cellulari piccole.

Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare

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