Isolare RNA specifici del tipo di cellula da campioni di tessuto eterogeneo congelati a scatto senza selezione cellulare
8 dicembre 2021
Questo protocollo mira a isolare mRNA ribosomiali traslatori specifici per tipo cellulare utilizzando il modello murino NuTRAP.
Questo protocollo mira a ottenere RNA specifici di tipi cellulari di alta qualità da un piccolo numero di cellule in un tessuto complesso senza selezione cellulare. Impiega un modello murino recentemente disponibile che consente ai ricercatori di isolare un RNA legato al ribosoma utilizzando il pull down GLP. Il metodo è adatto anche per isolare gli RNA legati al ribosoma da qualsiasi cellula che esprime EGFP.
Per iniziare, aggiungere due millilitri di tampone di lavoro per omogeneizzazione ghiacciata a un set di smerigliatrici di tessuto di vetro. Posizionare rapidamente il campione congelato nel macinino e omogeneizzare il tessuto con 30 colpi sul ghiaccio usando un pestello sciolto. trasferire l'omogenato in un tubo inferiore rotondo da due millilitri e centrifugare a 12.000 g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi trasferire il surnatante in un nuovo tubo da due millilitri senza disturbare il pellet, riservando 100 microlitri come input. Incubare il surnatante con l'anticorpo anti-GFP a quattro gradi Celsius su un rotatore terminale durante la notte. Trasferire la miscela omogenato e anticorpale in un nuovo tubo inferiore rotondo da due millilitri contenente perle di proteine g lavate e incubato di quattro gradi Celsius su rotatore a 24 RPM per due ore.
Separare le sfere magnetiche dal surnatante usando un rack magnetico. Salvare il surnatante come frazione negativa che contiene gli RNA nelle cellule EGFP negative e gli RNA nelle cellule EGFP positive che non sono legate ai ribosomi. Aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio ad alto sale alle perline e ruotare brevemente il tubo per lavare le perline.
Quindi posizionare il tubo in un rack magnetico. Rimuovere il tampone di lavaggio e ripetere i passaggi di lavaggio altre due volte per ottenere il complesso RNA ribosoma delle perle dalle cellule EGFP positive. Incubare le perle con 50 microlitri di tampone di estrazione dal kit di isolamento dell'RNA in un ThermoMixer per 30 minuti per rilasciare RNA dalle perle.
Separare le perline con un rack magnetico e trasferire il surnatante in un tubo da 1,5 millilitri. Centrifugare il tubo a 3000 g per due minuti. Quindi pipettare il surnatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri.
Per pre-condizionare la colonna di purificazione dell'RNA, pipettare 250 microlitri di tampone di condizionamento sulla colonna di purificazione e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi centrifugare la colonna a 16.000 g per un minuto. Pipettare un volume uguale di etanolo al 70% nell'estratto cellulare e mescolare bene mediante pipettaggio.
Pipettare fino a 200 microlitri della miscela nella colonna di purificazione dell'RNA precondizionata. Per ridurre la perdita di campioni non riempire la colonna più dell'80% della sua capacità. Ripeti questo passaggio più volte fino a quando tutti gli RNA vengono raccolti nella stessa colonna di ogni frazione.
Centrifugare la colonna per due minuti per legare l'RNA alla membrana nella colonna. Quindi continuare la centrifugazione per 30 secondi. Eliminare il flusso attraverso e pipettare 100 microlitri di tampone di lavaggio uno nella colonna.
Centrifugare per un minuto, quindi scartare il flusso attraverso. Pipetta 75 microlitri di soluzione di DNA si mescolano direttamente nella membrana della colonna di purificazione. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti.
Quindi, pipettare 40 microlitri di tampone di lavaggio uno nella colonna e centrifugare per altri 30 secondi. Scartare il flusso attraverso. Pipettare 100 microlitri di tampone di lavaggio due nella colonna e centrifugare a 8.000 g per un minuto.
Scartare il flusso attraverso. Acquista PET 100 microlitri di tampone di lavaggio due nella colonna e centrifugare a 16.000 g per due minuti. Scartare il flusso attraverso e centrifugare nuovamente la stessa colonna a 16.000 g per un minuto per rimuovere tutte le tracce di tampone di lavaggio.
Trasferire la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. pipettare 12 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente sulla membrana della colonna di purificazione assicurandosi che la punta della pipetta non tocchi la membrana. Incubare a temperatura ambiente per un minuto e centrifugare a 1000 g per un minuto.
Quindi a 16.000 G per un minuto per eluire l'RNA. Utilizzare un bioanalizzatore per valutare la qualità e la quantità dell'RNA estratto. Conservare gli RNA in un congelatore a 80 gradi o inviarli per ulteriori analisi.
Topi portatori di entrambi gli alleli genici geneticamente modificati, Gli1-CreERT2 e NuTRAP ci viene iniettato tamoxifene una volta al giorno, a giorni alterni per tre iniezioni. L'analisi di immunofluorescenza dei tessuti raccolti mostra che l'EGFP era espresso nelle cellule interstiziali nei testicoli. EGFP è stato trovato anche nelle cellule capsulari surrenali nei topi Gli1-CreERT2, NuTRAP.
In Sonic Hedgehog-CreERT2, topi NuTRAP La popolazione cellulare positiva all'EGFP risiede nella corteccia esterna della ghiandola surrenale sotto la capsula, confermando l'espressione delle cellule pre-esprimenti EGFP. Dopo l'estrazione degli RNA specifici del tipo cellulare, l'RNA estratto è stato inviato per l'analisi dei microarray. I risultati hanno mostrato che circa 3000 geni sono stati arricchiti nella frazione positiva, rispetto ai geni nella frazione negativa, mentre circa 4.000 geni sono stati arricchiti nella frazione negativa.
Tra i geni differenziali espressi, i geni associati alle cellule di Leydig Hsd11b1 e Hsd3b6 sono stati arricchiti nella frazione positiva. Nella frazione negativa, i geni associati alla cellula di Sertoli Desert Hedgehog e Gstm6 sono stati arricchiti. Solo pochi geni differenzialmente espressi sono stati identificati confrontando la frazione negativa con l'input.
La RT-PCR quantitativa in tempo reale è stata utilizzata per confermare l'espressione di geni chiave nelle frazioni positiva e negativa. Analogamente a quanto riscontrato nel test microarray, gli enzimi steroidogenici 3-beta idrossi steroide deidrogenasi e l'enzima di scissione della catena laterale del colesterolo sono stati arricchiti nella frazione positiva. Nel frattempo, il fattore di trascrizione nove del marcatore cellulare Sertoli SRY box e la proteina tre del complesso sinaptonemale del marcatore delle cellule germinali sono stati arricchiti nella frazione negativa.
Quando si tenta questo protocollo, è importante preparare un tampone di lavoro di omogeneizzazione fresco Aggiungere DTT, ribonucleasi ricombinante cicloeximide e cocktail inibitore della proteinasi alla soluzione madre di omogeneizzazione solo prima dell'uso. È anche importante preparare i tamponi freschi a basso contenuto di sale e i tamponi di lavaggio ad alto contenuto di sale prima dell'uso.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per isolare gli mRNA ribosomiali in fase di traduzione specifici per tipo cellulare, utilizzando il modello murino NuTRAP, consentendo l'estrazione di RNA di alta qualità da piccole popolazioni cellulari senza la necessità di un ordinamento cellulare. Il metodo è particolarmente utile per lo studio di cellule che esprimono EGFP e per l'identificazione di geni espressi in modo differenziale associati a specifici tipi cellulari.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
Sfondo
- Il modello murino NuTRAP consente l'isolamento dell'RNA legato ai ribosomi.
- Questo approccio evita le complicazioni associate al sorting cellulare in tessuti eterogenei.
Metodi Utilizzati
- Recupero mediante pull-down GLP per l'isolamento dell'RNA legato ai ribosomi
- Modello murino NuTRAP
- Analisi con microarray e RT-PCR per la validazione dell'espressione genica
Risultati principali
- Circa 3000 geni sono risultati arricchiti nella frazione positiva di RNA, mentre 4000 geni sono risultati arricchiti nella frazione negativa.
- Sono stati identificati geni specifici associati alle cellule di Leydig e alle cellule di Sertoli nelle rispettive frazioni di RNA.
- I geni delle principali enzimi hanno mostrato un arricchimento in linea con i risultati ottenuti con microarray.
Conclusioni
- Lo studio dimostra un metodo affidabile per isolare RNA specifici per tipo cellulare.
- I risultati contribuiscono alla comprensione dell'espressione genica in diversi tipi cellulari testicolari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'isolamento di RNA specifici per tipo cellulare da tessuti eterogenei senza ricorrere al sorting cellulare affronta una sfida fondamentale nella validazione degli target e nella riduzione del rischio meccanicistico. Il metodo NuTRAP basato su TRAP consente un profilo trascrittomico quantitativo e riproducibile di popolazioni cellulari definite, supportando una maggiore affidabilità predittiva nelle fasi iniziali della scoperta. Questo approccio riduce il rumore biologico e migliora la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche in tipi cellulari specifici all'interno di tessuti complessi.
- Valore operativo: Evita artefatti derivanti dal sorting cellulare, preservando gli stati nativi dell'RNA per una validazione affidabile delle target.
- Valore predittivo: Favorisce la scoperta di biomarcatori e la chiarificazione di percorsi in sistemi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera input di RNA legati ai ribosomi standardizzati per lo sviluppo di saggi successivi.
- Valore operativo: Fornisce output riproducibili e quantitativi, adatti per la predisposizione a schermate ad alto rendimento.
- Scalabilità: Compatibile con quantità limitate di materiale iniziale, consentendo il riutilizzo in diversi modelli esprimenti EGFP.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza per la patologia catturando trascrittomi specifici per tipo cellulare in contesti tissutali nativi.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta fino alla validazione preclinica, utilizzando una logica coerente di isolamento dell'RNA.
- Controllo del rischio: Riduce l'ambiguità meccanicistica nei risultati dell'interazione con il bersaglio e nei test fenotipici.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dall'identificazione del bersaglio all'ottimizzazione del composto iniziale, in particolare quando è fondamentale disporre di una risoluzione a livello di tipo cellulare per ottenere informazioni meccanicistiche. Supporta la verifica di ipotesi e la riduzione dei rischi biologici prima di avviare campagne di screening di composti.
- Biologia della scoperta: Permette test di ipotesi precisi in tessuti eterogenei isolando gli RNA in fase di traduzione da popolazioni cellulari definite.
- Screening: Produce pool standardizzati di RNA associati ai ribosomi, adatti per la validazione degli assay e per test di riproducibilità.
- Analisi: Fornisce dati quantitativi sull'espressione genica (ad esempio, microarray, RT-PCR) che consentono il confronto tra diverse condizioni e la priorizzazione di bersagli.
- Ricerca traslazionale: Collega la fase iniziale della scoperta al lavoro preclinico preservando i segnali specifici del tipo cellulare in organi complessi come testicolo e ghiandola surrenale.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile a molteplici linee con driver Cre e linee NuTRAP, posizionandosi come piattaforma scalabile per analisi omiche specifiche per tipo cellulare.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia nella validazione dell'obiettivo riducendo i segnali di confondimento derivanti da tessuti eterogenei.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori grazie a passaggi standardizzati di lisi, immunoprecipitazione e recupero dell'RNA.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati trascrittomici più puliti e interpretabili per la selezione del portafoglio.
- Impatto sul portafoglio: Consente un avanzamento proporzionato al rischio isolando segnali veramente specifici del tipo cellulare, riducendo i falsi positivi nella validazione successiva.
Considerazioni sull'Implementazione
- Richiede competenze nel trattamento dei tessuti, nell'immunoprecipitazione e nelle tecniche di conservazione dell'RNA.
- Richiede l'accesso a rastrelliere magnetiche, ThermoMixers, centrifughe e colonne per la purificazione dell'RNA.
- Necessita della preparazione standardizzata di tamponi (omogeneizzazione, lavaggio, eluizione) appena prima dell'uso per prevenire l'attività delle RNasi.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la validazione dei livelli di espressione di EGFP e dell'efficienza di legame ai ribosomi in nuovi modelli con promotore Cre.
- I limiti pratici includono i vincoli sulla quantità di tessuto in ingresso e la necessità di concentrazioni ottimizzate di anticorpi e microsferette.
