Drosophila melanogaster Protocollo di iniezione della larva
19 ottobre 2021
Le mosche adulte Drosophila melanogaster sono state ampiamente utilizzate come organismi modello per studiare i meccanismi molecolari alla base delle risposte immunitarie innate antimicrobiche dell'ospite e delle strategie di infezione microbica. Per promuovere lo stadio larvale di D. melanogaster come sistema modello aggiuntivo o alternativo, viene descritta una tecnica di iniezione larvale.
Questo protocollo affronta le difficoltà e le sfide con la microiniezione della larva descrivendo un metodo preciso che consentirà l'uso della larva di Drosophila melanogaster come modello per vari studi immunitari e molecolari. Questa è una semplice tecnica di iniezione che presenta un metodo efficiente, economico e rapido per fornire ripetutamente una varietà di sostanze in modo uniforme, il che consente risultati coerenti e affidabili. Inizia selezionando le larve del terzo stadio instar e lavandole con la soluzione di Ringer in una piccola capsula di Petri.
Mettere una carta da filtro in una capsula di Petri e inumidirla con 5 ml di soluzione di Ringer. Quindi posizionare le larve sulla carta da filtro. Preparare i capillari utilizzando tubi capillari di vetro da 3,5 "in un estrattore di micropipette.
Aprire il capillare di vetro con l'aiuto di pinze dritte a punto medio seghettato. Riempire il capillare aperto con olio minerale usando una siringa monouso di plastica. Quindi, espellere l'olio dal tubo capillare con un iniettore nanoliter.
Riempire il capillare con la preparazione batterica desiderata per l'iniezione. Trasferire le larve anestetizzate su una carta da filtro inumidita con la soluzione di Ringer. Usando la pinza, applicare una forte pressione sul lato dorsale dell'estremità posteriore delle larve, dove sono evidenti gli spiracoli tracheali.
Quindi, inserire l'ago orizzontalmente, verso l'estremità posteriore delle larve, e iniettare le scorte batteriche. Rimuovere la pinza per evitare fuoriuscite di emolinfa o intestino. Quindi, prelevare l'ago precedentemente inserito nelle larve.
Infettare 20 larve per ogni condizione sperimentale. Usando un pennello, trasferire delicatamente le larve iniettate su una carta da filtro umida separata. Aggiungere la soluzione di Ringer se necessario per evitare l'essiccazione.
Incubare la capsula di Petri in un'incubatrice a 25 C.Le larve di Drosophila melanogaster infettate da Photorhabdus asymbiotica hanno mostrato un tasso di sopravvivenza del 57% per 24 ore dopo l'iniezione, mentre la larva iniettata con Escherichia coli ha mostrato un tasso di sopravvivenza dell'85% nello stesso momento. L'importanza di questo metodo è che l'ago è tenuto approssimativamente parallelo alla larva. La pressione applicata per trattenere la larva è molto piccola, il che riduce la possibilità di perdite di emolinfa, lesioni mortali o consegna inadeguata della sostanza desiderata.
Questa tecnica può essere perfezionata con la pratica.
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Panoramica
Questo protocollo descrive una tecnica di iniezione larvale per Drosophila melanogaster, finalizzata a facilitare l'uso delle larve in studi immunologici e molecolari. Il metodo affronta le difficoltà associate alla microiniezione delle larve e fornisce un approccio affidabile per la somministrazione di sostanze.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Microbiologia
- Immunologia
Sfondo
- Drosophila melanogaster è un organismo modello ampiamente utilizzato.
- Comprendere le risposte immunitarie innate antimicrobiche è fondamentale.
- Le fasi larvali offrono ulteriori informazioni sulle strategie di infezione microbica.
- Le tecniche di microiniezione sono essenziali per la coerenza sperimentale.
Scopo dello studio
- Promuovere i larve di D. melanogaster come sistema modello.
- Fornire un metodo dettagliato per la microiniezione delle larve.
- Migliorare l'affidabilità degli studi immunologici e molecolari.
Metodi Utilizzati
- Selezionare larve del terzo stadio per l'iniezione.
- Lavare le larve con soluzione di Ringer.
- Preparare capillari utilizzando tubi capillari di vetro.
- Iniettare sostanze in modo uniforme nelle larve.
Risultati principali
- La tecnica consente una consegna efficiente delle sostanze.
- I risultati sono coerenti e affidabili tra un esperimento e l'altro.
- Metodo economico adatto a diversi tipi di studio.
- Permette l'esplorazione delle risposte immunitarie nei larvi.
Conclusioni
- La tecnica di iniezione nei larve è uno strumento prezioso per i ricercatori.
- Amplia l'utilità di D. melanogaster negli studi scientifici.
- La ricerca futura potrà sfruttare questo metodo per ottenere approfondimenti più dettagliati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I larve di Drosophila melanogaster offrono un modello economico e facilmente manipolabile dal punto di vista genetico per lo studio dell'immunità innata e delle interazioni ospite-patogeno, consentendo la validazione precoce di bersagli con un ridotto onere etico ed economico. Il protocollo di iniezione larvale migliora la riproducibilità nei saggi di risposta immunitaria, supportando la riduzione del rischio meccanicistico di candidati antimicrobici e immunomodulatori. Questo approccio collega la biologia della scoperta con la valutazione preclinica fornendo risultati quantificabili sulla sopravvivenza e sull'infezione in un sistema rilevante per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo di Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative ai percorsi immunitari innati e ai meccanismi di virulenza.
- Valore operativo: Fornisce un sistema scalabile per la validazione funzionale di target mediante modelli di sfida microbica.
- Valore predittivo: Supporta la selezione di portafoglio generando dati quantitativi su infezione e sopravvivenza per la valutazione dei composti principali.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Fornisce procedure standardizzate di preparazione e iniezione delle larve per un'esposizione costante alle sostanze.
- Output quantitativo: Consente la misurazione dei tassi di sopravvivenza e del carico patogeno come variabili dipendenti nelle campagne di screening.
- Riproducibilità: Riduce la variabilità tecnica grazie a meccanismi di iniezione controllati e a condizioni ambientali standardizzate.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per le malattie: Modella le risposte immunitarie innate rilevanti per l'uomo nei confronti di patogeni batterici come Photorhabdus asymbiotica ed Escherichia coli.
- Continuità traslazionale: Facilita il passaggio dalla validazione del bersaglio all'analisi dell'efficacia preclinica in un contesto di organismo intero.
- De-risking meccanicistico: Chiarisce le vie di difesa dell'ospite e il contributo dei fattori di virulenza prima degli studi nei mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo di iniezione larvale si inserisce nel percorso iniziale della scoperta, supportando la validazione degli obiettivi guidata da ipotesi e consentendo formati di saggio riproducibili per lo screening di composti prima dell'ottimizzazione del capostipite.
- Biologia della scoperta: Supporta la validazione funzionale di bersagli legati al sistema immunitario attraverso la sfida controllata con patogeni nei larve.
- Screening: Genera dati di risposta in funzione della dose e dati di sopravvivenza adatti allo screening ad alto contenuto di agenti immunomodulatori o antimicrobici.
- Analisi: Fornisce metriche quantitative di sopravvivenza (ad esempio, tassi di sopravvivenza a 24 ore) che consentono il confronto tra diverse condizioni sperimentali e trattamenti.
- Ricerca traslazionale: Stabilisce un sistema rilevante per la malattia per valutare l'impatto terapeutico sugli esiti dell'infezione prima del passaggio ai modelli rodentici.
- Riutilizzo aziendale: Rappresenta una piattaforma standardizzata e a basso costo applicabile a più progetti nella ricerca in immunologia e nelle malattie infettive.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle interazioni ospite-patogeno.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione tra laboratori attraverso parametri di iniezione definiti e controlli ambientali.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza delle decisioni di avanzamento o interruzione fornendo precoci segnali di efficacia e tossicità in un modello animale completo.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati in base al rischio, basandosi su dati di sopravvivenza e di eliminazione dell'infezione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel manipolaggio delle larve, nell'anestesia e nelle tecniche di microiniezione.
- Presuppone l'accesso a estrattori di micropipette, iniettori nanolitri e strumenti per la preparazione di capillari di vetro.
- Necessita della preparazione standardizzata di soluzione di Ringer e dell'incubazione in condizioni ambientali controllate a 25°C per ottenere risultati costanti.
- Richiede considerazioni adattative quando si testano ceppi microbici diversi o viscosità differenti delle sostanze.
- È limitato dalle dimensioni delle larve e dai vincoli relativi al volume di iniezione, che possono ostacolare il rilascio di molecole di grandi dimensioni o di particolati.
