Name: Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Impara il protocollo NEPTUNE per la nano-iniezione di lentivirus nella cavità amniotica murina a E7.5, consentendo la trasduzione uniforme della placca neurale con effetti minimi sullo sviluppo embrionale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo Bettina Semsch e Jia Sun (Infinigene) per la cura esperta dei topi; Florian Salomons e Göran Månsson di Biomedicum Imaging Core (BIC) per l'assistenza nell'acquisizione e nella consultazione delle immagini. Finanziamento: Ringraziamo i seguenti finanziatori per il loro sostegno a questo progetto: The Swedish Research Council, Karolinska Institutet (KI Foundations, Career Development Grant, Ph.D. student KID funding e SFO StratNeuro funding, Center of Innovative Medicine), The Ollie and Elof Ericssons Foundation, the Tornspiran Foundation, the Jeansssons Foundation, Sven and Ebba-Christina Hagbergs Prize and research Grant, Knut e Alice Wallenberg Project Grant, Fredrik and Ingrid Thurings Foundation, Lars Hiertas Minne, The Childhood Cancer Foundation (Barncancerfonden), The Åhlen Foundation, Åke Wibergs Foundation, Tore Nilssons Foundation e le fondazioni svedesi Starting Grant to ERA. Figura 4D,E sono stati creati con BioRender.com.

<ol><li>Theiler, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTheiler%2C+K+%22The+House+mouse.+Atlas+of+embryonic+development%22">The House mouse. Atlas of embryonic development</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1989).</li>
<li>Barresi, M. J. F., Gilbert, S. F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBarresi%2C+MJF+%22Developmental+biology%22">Developmental biology</a>. , Sinauer Associates Inc. Publishers. Sunderland, Massachusetts. (2016).</li>
<li>Taylor, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+success+of+clinical+genome+sequencing+across+a+broad+spectrum+of+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Factors influencing success of clinical genome sequencing across a broad spectrum of disorders.</a> Nature Genetics. 47 (7), 717-726 (2015).</li>
<li>Pizzo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+variants+in+the+genetic+background+modulate+cognitive+and+developmental+phenotypes+in+individuals+carrying+disease-associated+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rare variants in the genetic background modulate cognitive and developmental phenotypes in individuals carrying disease-associated variants.</a> Genetics in Medicine. 21 (4), 816-825 (2019).</li>
<li>Sakai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurulation+in+the+mouse%3A+Manner+and+timing+of+neural+tube+closure%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Neurulation in the mouse: Manner and timing of neural tube closure.</a> The Anatomical Record. 223 (2), 194-203 (1989).</li>
<li>Schoenwolf, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+and+bending+of+the+avian+neuroepithelium%3A+Morphometric+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Shaping and bending of the avian neuroepithelium: Morphometric analyses.</a> Developmental Biology. 109 (1), 127-139 (1985).</li>
<li>Smith, J. L., Schoenwolf, G. C., Quan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analyses+of+neuroepithelial+cell+shapes+during+bending+of+the+mouse+neural+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analyses of neuroepithelial cell shapes during bending of the mouse neural plate.</a> Journal of Comparative Neurology. 342 (1), 144-151 (1994).</li>
<li>Katahira, T., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+silencing+in+chick+embryos+with+a+vector-based+small+interfering+RNA+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Gene silencing in chick embryos with a vector-based small interfering RNA system.</a> Development Growth and Differentiation. 45 (4), 361-367 (2003).</li>
<li>Muramatsu, T., Mizutani, Y., Ohmori, Y., Okumura, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+nonviral+transfection+methods+for+foreign+gene+expression+in+early+chicken+embryos+in+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Comparison of three nonviral transfection methods for foreign gene expression in early chicken embryos in ovo.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 230 (2), 376-380 (1997).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Beronja, S., Livshits, G., Williams, S., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+dissection+of+genetic+networks+via+tissue-specific+transduction+and+RNAi+in+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Rapid functional dissection of genetic networks via tissue-specific transduction and RNAi in mouse embryos.</a> Nature Medicine. 16 (7), 821-827 (2010).</li>
<li>Pierfelice, T. J., Gaiano, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-guided+microinjection+into+the+mouse+forebrain+in+utero+at+E9.5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-guided microinjection into the mouse forebrain in utero at E9.5.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (45), e2047(2010).</li>
<li>Gaiano, N., Kohtz, J. D., Turnbull, D. H., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+rapid+gain-of-function+studies+in+the+mouse+embryonic+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A method for rapid gain-of-function studies in the mouse embryonic nervous system.</a> Nature Neuroscience. 2 (9), 812-819 (1999).</li>
<li>Slevin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+ultrasound-guided+microinjection+for+interventional+studies+of+early+embryonic+and+placental+development+in+vivo+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">High resolution ultrasound-guided microinjection for interventional studies of early embryonic and placental development in vivo in mice.</a> BMC Developmental Biology. 6, 10(2006).</li>
<li>Mangold, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+manipulation+of+nervous+system+gene+expression+with+NEPTUNE%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly efficient manipulation of nervous system gene expression with NEPTUNE.</a> Cell Reports Methods. 1, 100043(2021).</li>
<li>Kameneva, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+of+human+embryos+identifies+multiple+sympathoblast+lineages+with+potential+implications+for+neuroblastoma+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics of human embryos identifies multiple sympathoblast lineages with potential implications for neuroblastoma origin.</a> Nature Genetics. 53 (5), 694-706 (2021).</li>
<li>Kaiser, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEIS-WNT5A+axis+regulates+development+of+fourth+ventricle+choroid+plexus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MEIS-WNT5A axis regulates development of fourth ventricle choroid plexus.</a> Development. 148 (10), (2021).</li>
<li>Haddad, M. R., Donsante, A., Zerfas, P., Kaler, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+brain-directed+AAV+gene+therapy+results+in+rapid%2C+robust%2C+and+persistent+transduction+of+mouse+choroid+plexus+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Fetal brain-directed AAV gene therapy results in rapid, robust, and persistent transduction of mouse choroid plexus epithelia.</a> Molecular Therapy. Nucleic Acids. 2 (6), 101(2013).</li>
<li>Heavner, W., Pevny, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eye+development+and+retinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Eye development and retinogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (12), 008391(2012).</li>
<li>Swamynathan, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ocular+surface+development+and+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Ocular surface development and gene expression.</a> Journal of Ophthalmology. 2013, 103947(2013).</li>
<li>Amano, O., Mizobe, K., Bando, Y., Sakiyama, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+histology+of+rodent+and+human+major+salivary+glands%3A+-overview+of+the+Japan+Salivary+Gland+Society-sponsored+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Histochemica+et+Cytochemica%22%5BJournal%5D)">Anatomy and histology of rodent and human major salivary glands: -overview of the Japan Salivary Gland Society-sponsored workshop.</a> Acta Histochemica et Cytochemica. 45 (5), 241-250 (2012).</li>
<li>Liu, H. X., Komatsu, Y., Mishina, Y., Mistretta, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+contribution+to+lingual+mesenchyme%2C+epithelium+and+developing+taste+papillae+and+taste+buds%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest contribution to lingual mesenchyme, epithelium and developing taste papillae and taste buds.</a> Developmental Biology. 368 (2), 294-303 (2012).</li>
<li>Marmigère, F., Ernfors, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+and+connectivity+of+neuronal+subtypes+in+the+sensory+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Specification and connectivity of neuronal subtypes in the sensory lineage.</a> Nature Reviews. Neuroscience. 8 (2), 114-127 (2007).</li>
<li>Zirlinger, M., Lo, L., McMahon, J., McMahon, A. P., Anderson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+expression+of+the+bHLH+factor+neurogenin-2+marks+a+subpopulation+of+neural+crest+cells+biased+for+a+sensory+but+not+a+neuronal+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Transient expression of the bHLH factor neurogenin-2 marks a subpopulation of neural crest cells biased for a sensory but not a neuronal fate.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (12), 8084-8089 (2002).</li>
<li>Portales-Casamar, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+toolbox+of+MiniPromoters+to+drive+selective+expression+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A regulatory toolbox of MiniPromoters to drive selective expression in the brain.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (38), 16589-16594 (2010).</li>
<li>Tervo, D. G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designer+AAV+variant+permits+efficient+retrograde+access+to+projection+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A designer AAV variant permits efficient retrograde access to projection neurons.</a> Neuron. 92 (2), 372-382 (2016).</li>
<li>Loganathan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rare+driver+mutations+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinomas+converge+on+NOTCH+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling.</a> Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ci sono diversi passaggi in questo protocollo che influenzano la sopravvivenza embrionale, la qualità delle iniezioni e la lettura. L'età gestazionale degli embrioni è definita come E0,5 a mezzogiorno del giorno del tappo vaginale dopo l'accoppiamento notturno. L'esecuzione del controllo ecografico per la gravidanza a E6.5 nel tardo pomeriggio / sera assicura che gli embrioni siano abbastanza sviluppati da essere identificati mediante ultrasuoni. Il controllo (1) consente lo screening preliminare di quanti topi plug-positivi sono effettivamente gravidi, (2) assicura che nessun virus venga scongelato inutilmente e sprecato nel caso in cui i topi plug-positivi non siano incinta e (3) riduce gli interventi non necessari sui topi (evita interventi chirurgici su femmine non gravide).
A E7.5, gli embrioni sono sensibili alle forze esterne e devono essere maneggiati con cura. Ad esempio, tirare le corna uterine o spremere le decidue può portare al riassorbimento dell'embrione. Il tessuto uterino deve essere sempre mantenuto umido quando si trova all'esterno dell'addome femminile per evitare che il tessuto si secchi. La maggior parte delle decidue dovrebbe rimanere all'interno dell'addome femminile, con solo 3-4 esposti per iniezioni. La nitidezza dell'ago è un altro fattore determinante per iniezioni di successo. Le punte degli aghi smussate o rotte provocano ripetuti colpi di decidue o compressione contro l'argilla modellante prima di entrare nell'AC, il che può aumentare il tasso di riassorbimento. Pertanto, gli aghi ben macinati e affilati devono essere sempre conservati in modo sicuro e sostituiti dopo un massimo di 2 femmine.
Questo protocollo descrive come indirizzare la piastra neurale con una singola iniezione di lentivirus. Inoltre, mostra come l'efficacia della trasduzione possa essere adattata da cloni monocellulari all'intero cervello. Tuttavia, anche altri tessuti non neurali, tra cui la pelle e l'epitelio orale, sono presi di mira. Inoltre, tutti i tipi di cellule (progenitori e cellule differenziate) vengono trasdotti, rendendo questo approccio efficiente ma non specifico. L'uso di MiniPromoters nel costrutto virale porta all'espressione specifica del transgene nei neuroni o negli astrociti15. Ciò ha il vantaggio di evitare l'uso di animali Cre transgenici dedicati e quindi riduce la quantità di lavoro (mantenimento dello sforzo e genotipizzazione) e i costi.
I limiti di NEPTUNE includono la sua difficoltà tecnica, le sfide nell'ottenere donne incinte a un ritmo prevedibile e coerente e i costi di acquisizione di strumentazione specializzata. Inoltre, il targeting non selettivo delle cellule da parte del lentivirus può essere visto sia come un vantaggio che come una limitazione della tecnica. L'iniezione di volumi maggiori nell'AC provoca l'enencefalia13, sebbene le malformazioni cerebrali e l'enencefalia siano evitate con i volumi descritti qui15. Un impatto negativo sullo sviluppo del cervello è quindi un rischio con nano-iniezioni in utero che devono essere accuratamente evitate iniettando volumi corretti adattati allo stadio embrionale e alle dimensioni dell'AC.
I futuri adattamenti della tecnica potrebbero concentrarsi sul tropismo virale. I virus adeno-associati (AAV) hanno sierotipi diversi, che hanno dimostrato di colpire in modo robusto diversi tipi di cellule nel SNC17,26. Tuttavia, gli AAV non si integrano nel genoma della cellula ospite e quindi possono essere persi in cellule con un alto tasso di divisione. Sebbene ci siano diversi modi per aumentare la specificità di NETTUNO, gli animali transgenici sono ancora il gold standard quando si tratta di manipolazione genica in vivo. I topi Cas9 e il lentivirus codificante l'sgRNA sono stati utilizzati per lo screening genetico nell'epidermide embrionale27 e possono anche essere adattati al SNC in via di sviluppo.
Le iniezioni nell'AC a E7.5 colpiscono in modo efficiente le cellule del neuroectoderma prima dell'inizio della neurulazione e colpiscono il cervello in via di sviluppo in modo più efficiente rispetto all'elettroporazione in utero . Ciò consente lo studio di segnali genetici importanti per lo sviluppo del cervello da un punto temporale precedente. A differenza dei classici modelli genetici murini, NEPTUNE offre un approccio flessibile per eseguire l'analisi genica funzionale. I fenotipi che seguono la sovraespressione o la delezione genica possono essere studiati in pochi giorni o settimane rispetto a mesi o anni. Le iniezioni di più costrutti virali consentono la manipolazione di diversi geni all'interno di un embrione ed evitano la generazione di animali knockout doppi o tripli. Pertanto, NEPTUNE non solo consente di risparmiare tempo, ma può anche ridurre il numero di animali utilizzati nella ricerca.

Il cervello e il midollo spinale sono tra i primi organi ad avviare la formazione durante l'embriogenesi 1,2. Sebbene i geni associati ai disturbi dello sviluppo neurologico siano stati identificati, l'interrogazione funzionale delle varianti genetiche è rimasta indietrorispetto a 3,4. Poiché la generazione di topi knockout condizionali può richiedere mesi o anni, una tecnica alternativa per studiare rapidamente la funzione genica nel cervello in via di sviluppo è interessante. Negli embrioni di topo, la neurulazione - il processo morfogenetico mediante il quale la piastra neurale si trasforma nel tubo neurale per dare origine al sistema nervoso centrale (SNC) - avviene tra i giorni 8 e 10 dopo il concepimento5. Prima dell'inizio della neurulazione, la piastra neurale, come parte dell'ectoderma, è costituita da un singolo strato di cellule colonnari che proliferano e si differenziano nei numerosi tipi di cellule neuronali e gliali all'interno del SNC 6,7. Pertanto, per indurre sperimentalmente alterazioni durature all'espressione genica nel SNC, il targeting della piastra neurale offre ovvi vantaggi, tra cui l'accessibilità di tutte le cellule progenitrici.
Nelle neuroscienze, nell'ovo l'elettroporazione 8,9 e la trasduzione virale di embrioni di topo sono stati utilizzati per manipolare l'espressione genica embrionale del SNC. L'embrione di pulcino in via di sviluppo è stato un modello di scelta per studiare la funzione genica durante lo sviluppo del midollo spinale a causa dell'accessibilità dell'embrione di pulcino nell'uovo e della conseguente facilità di manipolazione dell'espressione genica. In particolare, l'elettroporazione plasmidica in ovo genera condizioni sperimentali e di controllo in ogni midollo spinale di pulcino. L'elettroporazione provoca la permeabilizzazione della membrana cellulare e dirige il DNA caricato negativamente lontano dal catodo (negativo) verso l'anodo (positivo) applicando un impulso elettrico tramite due elettrodi all'embrione. Nei topi, l'elettroporazione in utero è stata generalmente limitata agli stadi embrionali in cui la neurulazione è stata completata e il cervello o il midollo spinale sono già costituiti da diversi strati cellulari, con conseguente bassa efficienza di elettroporazione10. L'elettroporazione plasmidica provoca un'espressione genica transitoria e generalmente colpisce poche cellule.
La microiniezione in utero guidata da ultrasuoni è stata utilizzata per manipolare diverse strutture embrionali come la pelle e il cervello11,12,13,14. Tuttavia, le iniezioni mirate al SNC murino in via di sviluppo hanno mostrato una bassa efficacia o hanno avuto un impatto negativo sulla sopravvivenza embrionale12,13,14. Pertanto, è stato sviluppato un protocollo migliorato per la somministrazione di lentivirus ad alto titolo nella cavità amniotica (AC) a E7.5, che è stato soprannominato NEPTUNE per l'argeting in uteronano-inj e ction 15. Le iniezioni hanno portato a un'efficacia mirata di lunga durata del >95% dell'intero cervello a E13.5. Inoltre, è stata introdotta una fase di stadiazione durante la verifica ecografica della gravidanza per ordinare le femmine e le gravidanze in base allo stadio di sviluppo per ridurre al minimo le procedure non necessarie sugli animali da ricerca e massimizzare il successo dell'iniezione. L'efficienza e la sopravvivenza dell'iniezione sono strettamente legate all'aumento delle dimensioni del condizionatore. Pertanto, questo documento descrive come misurare le dimensioni dell'AC prima dell'iniezione per fornire un volume adeguato all'AC che non causi il riassorbimento dell'embrione. NEPTUNE è una robusta alternativa agli attuali approcci in utero e può essere adattato per diversi usi, inclusi, ma non limitati a, studi di guadagno e perdita di funzione, tracciamento del lignaggio o screening15,16.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 ml</td><td>BD Bioscience</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 27 G</td><td>BD Bioscience</td><td>300635</td><td></td></tr><tr><td>capillari da 3,5 pollici</td><td>Drummond Scientific</td><td>3000203G/X</td><td>Sono stati utilizzati per estrarre in casa gli aghi Trasduttore</td></tr><tr><td>della serie MS da 70 MHz</td><td>Visual Sonics</td><td>MS700</td><td></td></tr><tr><td>Aquasonic gel per ultrasuoni trasparente</td><td>Parker Laboratories</td><td>Mar-50</td><td></td></tr><tr><td>Autoclip Applier 9 mm</td><td>Angthos</td><td>12020-09</td><td></td></tr><tr><td>CD1 topi</td><td>Charles River, Germania</td><td>Crl:CD1(ICR)</td><td>Femmine: a partire da 8 settimane di età Maschi: a partire da 12 settimane</td></tr><tr><td>Cotton Swab</td><td>OneMed Sverige AB</td><td>120788</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190094</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per medicazione delicate dritte 13 cm</td><td>Agnthos</td><td>08-032-130</td><td></td></tr><tr><td>EG-400 Narishige Micropipette Grinder</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>EZ clip 9 mm</td><td>Angthos</td><td>59027</td><td>clip</td></tr><tr><td>Iris Scissors, Super Cut, dritto, 9 cm</td><td>Agnthos</td><td>307-336-090</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane</td><td>Baxter Medical AB</td><td>EAN: 50085412586613</td><td>Acquistato dalla farmacia svedese</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clarke</td><td>7557</td><td></td></tr><tr><td>Nastro a membrana</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11053</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Strumento Sutter</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Modellazione Clay</td><td>Sense AB</td><td>10209</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo per la manipolazione del mouse</td><td>Visual Sonics</td><td>50249</td><td></td></tr><tr><td>Kit iniettore automatico Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-205A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Piastra di Petri Bemis</td><td>HS234526C</td><td></td></tr><tr><td>con apertura centrale (muretto)</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11620</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri, (&Oslash; xH): 92 x 16 mm</td><td>Sarstedt</td><td>82.1472.001</td><td></td></tr><tr><td>Rely+On Virkon</td><td>DuPont</td><td>130000132037</td><td>disinfettante</td></tr><tr><td>Membrana siliconica</td><td>Visual Sonics</td><td>SA-11054</td><td></td></tr><tr><td>Steri 250, sterilizzatore a cordoni caldi</td><td>Angthos</td><td>31100</td><td></td></tr><tr><td>Nastro chirurgico (1,25 cm x 9,14 m)</td><td>Medicarrier</td><td>67034</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Compact Dual (Med. Aria & O2) Sistema di anestesia</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-12055</td><td></td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station 2</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-11983</td><td></td></tr><tr><td>Vevo2100</td><td>Visual Sonics</td><td>VS-20047</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 6-0; Ago C-3, filamento viola da 45 cm</td><td>Agnthos</td><td>J384H</td><td></td></tr></tbody></table>

targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (neptune) al giorno embrionale 7.5

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

La manipolazione dell'espressione genica nel cervello di topo in via di sviluppo in utero ha un grande potenziale per gli studi di genetica funzionale. Tuttavia, in precedenza è stato in gran parte limitato alla manipolazione degli stadi embrionali post-neurulazione. È stato sviluppato un protocollo per iniettare la cavità amniotica al giorno embrionale (E) 7.5 e fornire lentivirus, codificando cDNA o shRNA, mirando al >95% della piastra neurale e delle cellule della cresta neurale, contribuendo al futuro cervello, midollo spinale e sistema nervoso periferico. Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere una trasduzione di successo, tra cui la macinazione degli aghi capillari di vetro, la verifica della gravidanza, la stadiazione dello sviluppo mediante imaging ad ultrasuoni e volumi di iniezione ottimali abbinati agli stadi embrionali. 
Seguendo questo protocollo, è possibile ottenere la trasduzione del >95% del cervello in via di sviluppo con lentivirus ad alto titolo e quindi eseguire la manipolazione genetica dell'intero cervello. Al contrario, è possibile ottenere la trasduzione del mosaico utilizzando titoli virali più bassi, consentendo lo screening genetico o il tracciamento del lignaggio. L'iniezione a E7.5 colpisce anche l'ectoderma e la cresta neurale che contribuiscono a compartimenti distinti dell'occhio, della lingua e del sistema nervoso periferico. Questa tecnica offre quindi la possibilità di manipolare l'espressione genica nei tessuti derivati da piastre neurali ed ectodermi di topo fin dalle fasi di preneurulazione, con il vantaggio di ridurre il numero di topi utilizzati negli esperimenti.

Gli embrioni iniettati a E7.5 con hPGK-H2B-GFP lentivirus11,12 sono stati raccolti a E13.5 ed esaminati al microscopio a dissezione fluorescente (Figura 5A). La trasduzione riuscita della piastra neurale si traduce in embrioni con forte espressione di un reporter fluorescente nel cervello principalmente e in altri tessuti derivati dall'ectoderma, ad esempio la pelle (Figura 5A,B). L'iniezione di un volume eccessivamente elevato (superiore ai volumi qui raccomandati, ad esempio ≥500 nL) aumenta la pressione nel condizionatore e può provocare un riassorbimento completo (dati non mostrati) o difetti del tubo neurale come l'encefalia (Figura 5A). Le iniezioni riuscite a E7.5 determinano una trasduzione uniforme dal proencefalo al cervello posteriore (Figura 5C-J).
I titoli lentivirali intorno a 2 × 10 10 unità infettive (IFU) raggiungono oltre il 95% di targeting, mentre titoli di ~ 1 ×10 9 IFU raggiungono il 15% di efficienza di targeting15. Inoltre, sono prese di mira anche strutture che in precedenza erano difficili da colpire usando l'elettroporazione, come il plesso coroideo17,18 (Figura 5 E,F). L'efficacia della trasduzione può essere modificata regolando il titolo virale erogato nell'AC. Le iniezioni di basso titolo provocano la trasduzione di cloni a singola cellula (Figura 5C, Figura 5E e Figura 5G, H) mentre l'uso del virus ad alto titolo trasduce quasi il 100% dell'intero cervello (Figura 5D, Figura 5F, Figura 5H e Figura 5J ). Pertanto, NEPTUNE può essere utilizzato per la trasduzione clonale, il tracciamento del lignaggio e gli approcci di screening genetico o per studiare gli effetti globali della sovraespressione genica o della downregulation nell'intero cervello.
Lo sviluppo dell'occhio dei mammiferi è il risultato di una comunicazione ben organizzata tra tre derivati dell'ectoderma embrionale: la retina neurale (NR) e l'epitelio pigmentato retinico (RPE) derivano dal neuroepitelio del proencefalo ventrale, mentre l'ectoderma superficiale dà origine al futuro cristallino e all'epitelio corneale. Tuttavia, lo stroma centrale e l'endotelio posteriore, gli altri due strati della cornea, derivano dalle cellule della cresta neurale del mesenchima perioculare19,20. Le sezioni coronali attraverso embrioni E13.5, iniettati a E7.5 con lentivirus ad alto titolo, hanno mostrato, simile al cervello, un'elevata e uniforme trasduzione del tessuto neurale dell'occhio, così come del cristallino, della cornea e del mesenchima (Figura 5K). Con il progredire della neurulazione, le iniezioni a E8.5 ed E9.5 determinano il continuo targeting del cristallino e dell'epitelio corneale (Figura 5L e Figura 5N), mentre la trasduzione dei tessuti dell'occhio derivati dal neuroectoderma è meno efficiente a E8.5 (Figura 5L,M) o non mirata a E9.5 (Figura 5N).
Mentre la maggior parte delle particelle virali infetta i tessuti esposti dopo l'iniezione, alcune particelle trasducono tessuti derivati non ectodermici che si sviluppano successivamente (Figura 6A). Le ghiandole e i dotti salivari si sviluppano intorno a E11.5 dall'epitelio orale21 e sono mirati a NEPTUNE (Figura 6B). Dopo iniezioni a E9.5, l'epitelio linguale della lingua è ben trasdotto; tuttavia, il mesenchima sottostante è negativo (Figura 6C; le parentesi indicano cellule trasdotte; gli asterischi indicano il segnale di autofluorescenza non le cellule trasdotte). Inoltre, ci sono gruppi positivi all'interno dell'epitelio linguale, separati da sezioni negative (Figura 6C, punte di freccia bianche), suggerendo la trasduzione della superficie della papilla. Le cellule della cresta neurale sono state descritte nel mesenchima della lingua sottostante e all'interno dell'epitelio linguale, dove sono coinvolte nello sviluppo delle papille gustative e delle papille gustative22. Infatti, le iniezioni a E7.5 provocano una trasduzione diffusa del mesenchima della lingua a E13.5 (Figura 6D), suggerendo che le iniezioni precoci colpiscono le cellule della cresta neurale, contribuendo al mesenchima nella lingua.
Nei vertebrati, i gangli delle radici dorsali (DRG) sono un componente centrale del sistema nervoso periferico (PNS), poiché tutti gli input somatosensoriali dalla periferia del corpo (temperatura, dolore, pressione) vengono trasmessi al cervello tramite l'attivazione dei neuroni DRG23. Sia i neuroni che le cellule gliali del DRG derivano dalle cellule della cresta neurale del tronco24. L'iniezione lentivirale, in cui l'onnipresente promotore hPGK controlla l'espressione del reporter fluorescente, porta a un targeting diffuso del sistema nervoso centrale e periferico (Figura 7A), trasducendo sia i neuroni che i progenitori nel midollo spinale (Figura 7B), così come il DRG (Figura 7C). L'uso di un MiniPromoter per la doppia cortina25 consente di limitare l'espressione di GFP ai soli neuroni (15 e Figura 7D,E).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3.jpg"> Figura 5: Alta efficienza o trasduzione clonale con NETTUNO. (A) embrioni E13.5 al microscopio da dissezione illuminato con illuminazione standard (pannello di sinistra) e stessi embrioni illuminati per GFP (pannello di destra). Embrione non iniettato all'estrema sinistra, embrione iniettato con successo all'estrema destra, che produce un segnale positivo nel cervello (embrione più a destra). Embrione encefalico dovuto all'eccesso di volume iniettato (embrione medio). (B) Targeting della pelle e del cervello con iniezione di E7.5. Barra di scala = 50 μm. (C, D) E13.5 immagini confocali del proencefalo con bassa trasduzione clonale (C) o trasduzione ad alta efficienza (D). (C, E, G, I) Trasduzione clonale di diverse regioni del cervello. (D, F, H, J) Trasduzione ad alta efficienza di diverse regioni del cervello. Barre della scala = 200 μm. Diverse efficaci di trasduzione sono rappresentative di altre aree del SNC. (E, F) Targeting del plesso coroideo, clonale (E) o ad alta efficienza (F). Barre di scala = 200 μm. (G, H) Targeting clonale (G) e targeting ad alta efficienza (H) del cervello posteriore, ingrandito in (I, J). Barre di scala = 200 μm. (K) Espressione del reporter GFP nell'occhio a E13.5 dopo iniezione in utero a E7.5 (L, M) Espressione del reporter GFP nell'occhio a E15.5 dopo iniezione in utero a E8.5 (L), regione in scatola ingrandita in (M) o a E9.5 (N). I vasi sanguigni autofluorescenti sono contrassegnati da stelle bianche. Barre della scala = 100 μm. Abbreviazioni: NEPTUNE = neural plate targeting with in uteronano-injection; C = Cornea; LE = epitelio del cristallino; LF = fibre di lenti; M = Mesenchima; NR = Retina neurale; ON = nervo ottico; RPE = epitelio pigmentato retinico; GFP = proteina fluorescente verde; SNC = sistema nervoso centrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig5v3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a> 
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig06.jpg"> Figura 6: Trasduzione in utero di tessuti non neurali. (A) Immagine confocale della cavità orale E15.5. All'embrione è stato iniettato il lentivirus reporter fluorescente a E9.5. Barra di scala = 200 μm. (B, C) (B) Ingrandimento del pannello inserito; epitelio del dotto salivare trasdotto con virus. (C) Ingrandimento del pannello inserito; epitelio linguale dorsale trasdotto con GFP reporter virus (parentesi bianca). Il mesenchima sottostante derivato dalle cellule della cresta neurale è negativo. Le punte di freccia bianche indicano papille con cellule della cresta neurale negative circondate da cellule epiteliali trasdotte da virus (le cellule / vasi sanguigni autofluorescenti sono contrassegnati con stelle bianche). Barre della scala = 50 μm. (D) Immagine schematica e confocale del mesenchima della lingua E13.5 dopo iniezioni con virus reporter fluorescente a E7.5. Barra di scala = 50 μm. Abbreviazioni: D = dorsale; M = Mesenchima; N = rinofaringe; SLD = dotto sublinguale; SMD = dotto sottomandibolare; T = lingua; V = ventrale; GFP = proteina fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63148/63148fig07.jpg"> Figura 7: Trasduzione delle cellule gangliari della radice dorsale derivate dalla cresta neurale. (A) Il targeting di NETTUNO a E7.5 consente di colpire sia il SNC che il PNS. (B) L'immagine confocale del midollo spinale E13.5 e dei DRG iniettati con lentivirus reporter hPGK-H2B-GFP a E7.5 mostra la trasduzione sia dei progenitori neurali SOX2+ che dei neuroni NeuN+. Barra di scala = 100 μm. (C) Regione in scatola di B che mostra il DRG con espressione GFP nelle popolazioni cellulari SOX2+ (frecce bianche) e NeuN+ (punte di freccia bianche). Barra della scala = 20 μm. (D) Immagine confocale del midollo spinale E13.5 e DRG iniettato con lentivirus DCX-H2B-GFP a E7.5, mirato solo alle cellule DCX+. Barra di scala = 100 μm. (E) Regione in scatola di D che mostra DRG con espressione GFP limitata ai neuroni DCX+ (punte di freccia bianche). Le celle DCX sono negative per GFP (frecce bianche). Barra della scala = 20 μm. Abbreviazioni: NEPTUNE = neural plate targeting with in utero nano-injection; SNC = sistema nervoso centrale; PNS = sistema nervoso periferico; DRG = gangli della radice dorsale; GFP = proteina fluorescente verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63148/63148fig07large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

In questo protocollo, descriviamo come iniettare lentivirus nella cavità amniotica del topo a E7.5, portando a una trasduzione uniforme dell'intera piastra neurale, con effetti dannosi minimi sulla sopravvivenza o sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Manipulating gene expression in the developing mouse brain in utero holds great potential for functional genetics studies. However, it has previously ...

NEPTUNE consente il targeting e la manipolazione genetica del sistema nervoso embrionale del topo dal giorno embrionale 7.5 e consente la generazione di modelli di knockdown o lineage tracing in giorni. Questo protocollo è adattabile, flessibile e veloce. Siamo in grado di fornire librerie virali shRNA, cdRNA o codici a barre per rispondere a diverse domande in giorni anziché mesi o anni.Ci aspettiamo che NEPTUNE fornirà approfondimenti nelle neuroscienze, ma può anche essere adattato ad altri sistemi di organi. Identificare la cavità amniotica può essere piuttosto impegnativo, quindi prenditi il tuo tempo per guardare l'immagine ecografica e magari avere un libro di testo o un'altra risorsa di anatomia a portata di mano. Per iniziare a caricare l'ago, far scorrere l'ago di vetro sullo stantuffo metallico, mantenendo la pinza attaccata ma leggermente allentata.Quindi, spingere l'ago capillare insieme allo stantuffo metallico attraverso la guarnizione anteriore fino a raggiungere il distanziatore. Premere Svuota per spingere lo stantuffo nell'ago ed espellere l'olio dalla punta dell'ago. Quindi premere Fill per creare una bolla d'aria, dividendo l'olio e la soluzione.Infine, abbassare l'ago, immergere la punta nella soluzione e premere nuovamente Fill per caricare l'ago. Dopo aver fissato un topo femmina anestetizzato con cavità amniotiche di dimensioni ideali sul tavolo riscaldante, applicare il gel per gli occhi su entrambi gli occhi per prevenire l'essiccazione corneale e iniettare un antidolorifico per via sottocutanea. Quindi, sterilizzare l'addome inferiore strofinando con un panno imbevuto di 0,5 milligrammi per millilitro di soluzione di clorexidina e asciugare la pelle.Successivamente, usando le forbici chirurgiche, eseguire un'incisione cutanea verticale mediana da 1,5 a 2 centimetri nell'addome inferiore. Quindi sollevare delicatamente la pelle e liberarla dallo strato muscolare sottostante di circa un centimetro attorno al punto di incisione per facilitare la sutura dopo l'intervento chirurgico. Quindi, fai un'incisione verticale della linea mediana di un centimetro nello strato muscolare.Usando un paio di pinze, solleva un lato della pelle e dello strato muscolare e, con un altro paio, cerca le corna uterine. Quindi, usando una pinza, tenere il tessuto tra gli embrioni e estrarre con cura entrambe le corna uterine dall'addome. Contare e numerare gli embrioni, dall'ovaio alla cervice o dalla cervice all'ovaio, su entrambi i lati.Successivamente, con un batuffolo di cotone umido, spingere delicatamente tutti gli embrioni nella cavità addominale, tranne i primi tre da iniettare. Quindi, posizionare una goccia di PBS su una membrana elastica incollata all'apertura centrale rotonda di una capsula di Petri modificata disponibile in commercio e tenerla immediatamente sopra gli embrioni. Inserire una pinza chiusa nell'incisione dell'elastico, quindi rilasciare la pinza per aprire l'incisione elastica, facendo cadere il liquido sugli embrioni.Usando una pinza, tirare la sezione dell'utero corrispondente ai tre embrioni attraverso l'elastico e appollaiare delicatamente la piastra di Petri sull'addome del topo. Utilizzando quattro piedi di argilla, fissare e fissare la capsula di Petri sopra l'addome per ridurre la pressione sul topo e ridurre anche la sensibilità dell'imaging alla respirazione e al battito cardiaco del topo. Successivamente, utilizzando una pinza e un batuffolo di cotone umido, regolare l'utero e l'elastico per garantire che l'elastico sia sigillato intorno alla pelle del topo, evitando perdite di PBS.Successivamente, per fissare l'utero, premere il cilindro di argilla modellante verso il basso a destra degli embrioni o dell'utero e aggiungere PBS alla piastra di Petri fino a quando gli embrioni e l'utero sono interamente coperti con il PBS. Per facilitare la registrazione delle iniezioni, immergere la sonda ecografica nel PBS e regolare il mouse o il tavolo chirurgico in modo che il primo embrione sia allineato con la sonda ad ultrasuoni. Scansiona tutti e tre gli embrioni e ispeziona le cavità amniotiche.Quindi, utilizzando la macchina ad ultrasuoni, misurare il diametro della cavità amniotica per determinare il volume di iniezione appropriato. Utilizzando il controller di iniezione, impostare i volumi di iniezione determinati e la velocità di iniezione su slow, con una velocità di iniezione di 23 nanolitri al secondo. Dopo aver abbassato l'ago nel PBS, utilizzando le ruote principali sul sistema di binari, premere Svuota sul controller del nanoiniettore fino a quando il liquido raggiunge la punta dell'ago.Quindi, sollevare l'ago dal PBS e premere Inject per verificare che venga scaricata una goccia del volume approssimativo desiderato. Abbassare nuovamente l'ago nel PBS e spostare il nanoiniettore con la ruota Y-plane sul micromanipolatore per allineare l'ago con la sonda ad ultrasuoni e l'embrione. Regolare l'angolo dell'ago con la ruota dell'angolo di iniezione per garantire un angolo di iniezione quasi perpendicolare rispetto alla parete uterina.Quindi, utilizzando la ruota di iniezione sul micromanipolatore, inserire l'ago nella cavità amniotica con un solo movimento. Se la punta dell'ago scompare dall'immagine ecografica, spostare la sonda in avanti o indietro per riportare l'ago a fuoco. Quindi, iniettare il volume desiderato premendo Inject per il numero appropriato di volte.Dopo aver iniettato il volume richiesto, attendere da 5 a 10 secondi prima di ritrarre l'ago con un movimento delicato. Spostare lo stadio all'embrione successivo e ripetere l'iniezione per gli altri due embrioni come dimostrato. Quindi, sollevare la sonda ad ultrasuoni e l'ago dal PBS utilizzando il micromanipolatore, allontanando l'ago dall'operatore per evitare danni e lesioni.Usando una pinza, rimetti il primo e il secondo embrione nell'addome spingendoli delicatamente attraverso l'elastico. Quindi, afferrare delicatamente il tessuto adiacente al terzo embrione e tirare l'utero verso l'estremità superiore dell'incisione elastica. Tirare delicatamente dal quarto al sesto embrione con una pinza e lasciare che il terzo embrione rientri nell'addome.Dopo che tutti gli embrioni con cavità amniotiche ottimali sono stati iniettati, spingere delicatamente gli embrioni e l'utero nell'addome del topo. La trasduzione riuscita della piastra neurale si traduce in embrioni con una forte espressione di un reporter fluorescente nel cervello e in altri tessuti derivati dall'ectoderma, come la pelle. L'iniezione di volumi eccessivamente elevati può causare difetti del tubo neurale, come l'encefalia.Le iniezioni riuscite al giorno embrionale 7.5 determinano una trasduzione uniforme dal proencefalo al cervello posteriore, compreso il plesso coroideo. Le iniezioni di titoli bassi provocano la trasduzione di cloni unicellulari, mentre il virus ad alto titolo traduce quasi il 100% dell'intero cervello. Le sezioni coronali fino al giorno embrionale 13,5 embrioni hanno mostrato una trasduzione elevata e uniforme del tessuto neurale dell'occhio, del cristallino, della cornea e del mesenchima.Dopo l'iniezione al giorno embrionale 9.5, le ghiandole salivari e i dotti si sviluppano intorno al giorno embrionale 11,5 dall'epitelio orale. L'epitelio linguale della lingua è ben trasdotto, mentre il mesenchima sottostante è negativo. Inoltre, i cluster positivi all'interno dell'epitelio linguale sono separati da sezioni negative, suggerendo la trasduzione della superficie papillare.Le iniezioni al giorno embrionale 7.5 provocano una trasduzione diffusa del mesenchima della lingua al giorno embrionale 13.5, suggerendo che le iniezioni precoci colpiscono le cellule della cresta neurale, contribuendo al mesenchima nella lingua. Le iniezioni lentivirali portano anche a un bersaglio diffuso del sistema nervoso centrale e periferico, trasducendo sia i neuroni che i progenitori nel midollo spinale, così come i gangli della radice dorsale. Una buona preparazione è essenziale.Assicurarsi che non vi siano perdite e che gli embrioni siano ben fissati, in modo da potersi concentrare interamente sulle iniezioni nella cavità del ratto. Dopo NEPTUNE, l'analisi può essere eseguita con vari metodi, come l'analisi immunofluorescente del cervello, il sequenziamento dell'RNA a singola cellula o la nascita degli embrioni iniettati per l'analisi comportamentale.

murine-neural-plate-targeting-utero-nano-injection-neptune-at

Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Nella chirurgia in utero sopravvivenza in topi permette la manipolazione molecolare dell'espressione genica durante lo sviluppo. Qui si descrive l'utilizzo di alta frequenza ecografia per guidare l'iniezione di vettori retrovirali nel cervello di topo al giorno embrionale (E) 9.5.

Ultrasound-Guided Microiniezione nel proencefalo mouse In Utero A E9.5

Elettroporazione in utero è un metodo prezioso per trasfezione delle cellule progenitrici neuronali in vivo. A seconda del posizionamento degli elettrodi e la timepoint sviluppo di elettroporazione, alcuni sottoinsiemi di cellule corticali può essere mirati. Cellule bersaglio può quindi essere analizzato in vivo o in vitro per gli effetti di alterazione genetica.

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

Elettroporazione in utero permette per la consegna rapida in un gene-spazialmente e temporalmente modo controllato nello sviluppo del sistema nervoso centrale (SNC). Qui descriviamo altamente adattabile a protocollo di elettroporazione utero che possono essere usati per fornire costruisce espressione in più domini embrionale del SNC, tra cui il diencefalo telencefalo, e della retina.

Gene consegna efficiente in più territori SNC utilizzo In Utero Elettroporazione

Un metodo di trasferimento genico nel cervello del mouse di sviluppo è descritta utilizzando un metodo unico chirurgico e la forma speciale di elettrodi. Questa tecnica unica consente la trasfezione di DNA plasmidico temporalmente e spazialmente, che aiuterà molti neuroscienziati a studiare lo sviluppo del cervello.

Mouse in Utero elettroporazione: controllato Transefection Gene spazio-temporale

Un metodo che consente la manipolazione diretta farmacologica di embrioni di topo durante neurulazione che aggira il metabolismo materno è descritto. La tecnica può essere adattata per studiare diversi aspetti della neurulazione variando il punto di tempo e agente farmacologico.

La chiusura del tubo neurale in Cultura embrione di topo intero

Fonte: Mangold, K., H el. al., Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra il metodo di nano-iniezione in utero per il targeting della piastra neurale in un modello murino embrionale. Una soluzione lentivirale ad alto titolo viene iniettata nella cavità amniotica, dove si integra nelle cellule della placca neurale, consentendo una manipolazione genica stabile per la ricerca sullo sviluppo...

Manipolazione delle cellule della placca neurale attraverso la nanoiniezione in utero in un modello murino embrionale

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere un in perdita e guadagno-di metodo di funzione che è applicabile per identificare neogenin come un recettore specifico stadio che porta a trophectoderm e la differenziazione massa cellulare interna di embrioni preimpianto mouse.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare mappe del destino e traccianti di lignaggio per indirizzare le iniezioni nei singoli blastomeri che danno origine al rene degli embrioni di Xenopus laevis.

Tecnica a Target microiniezione per lo sviluppo<em&gt; Xenopus</em&gt; Kidney

La combinazione di microscopia elettronica di trasmissione e trasduzione nell'utero è un approccio potente per studiare i cambiamenti morfologici nell'ultrastruttura bene del sistema nervoso durante lo sviluppo. Questo metodo combinato consente approfondimenti cambiamenti nei dettagli strutturali sottostanti la neuroplasticità rispetto alla loro rappresentazione topografica.

Valutazione dei parametri di neuroplasticità ultrastrutturali dopo In Utero trasduzione del Mouse cervello e midollo spinale

Le cellule staminali neurali/progenitrici mostrano varie dinamiche di espressione dei componenti di segnalazione di Notch che portano a diversi risultati di eventi cellulari. Tale espressione dinamica può essere rivelata dal monitoraggio in tempo reale, non dall'analisi statica, utilizzando un sistema di imaging a bioluminescenza altamente sensibile che consente la visualizzazione di rapidi cambiamenti nelle espressioni geniche.

Risonanza in tempo reale sulla bioluminescenza delle dinamiche di segnalazione di nota durante la neurogenesi di Murine

Presentato qui è un protocollo per eseguire la manipolazione genetica nel cervello furetto embrionale utilizzando in utero elettroporazione. Questo metodo consente di indirizzare le cellule progenitrici neurali nella neocorteccia in vivo.

In Vivo Targeting di cellule progenitrici neurali in Ferret Neocortex di In Utero Electroporation

Impara il protocollo NEPTUNE per la nano-iniezione di lentivirus nella cavità amniotica murina a E7.5, consentendo la trasduzione uniforme della placca neurale con effetti minimi sullo sviluppo embrionale.

Targeting della placca neurale murina mediante nano-iniezione in utero (NEPTUNE) al giorno embrionale 7.5

Esplora altri video