Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule
4 novembre 2021
Viene presentato un metodo per la microdissezione dell'ovidotto di topo che consente la raccolta dei singoli segmenti mantenendo l'integrità dell'RNA. Inoltre, viene descritta la procedura di dissociazione delle cellule oviduttali non enzimatiche. I metodi sono appropriati per la successiva analisi genica e proteica dei segmenti oviduttali funzionalmente diversi e delle cellule oviduttali dissociate.
Diversi segmenti dell'ovidotto hanno funzioni fisiologiche distinte e sono differenzialmente suscettibili al cambiamento patologico. L'identificazione dei diversi segmenti in un ovidotto di topo molto piccolo è impegnativa, così come la produzione di una buona resa di cellule ben differenziate mediante dissociazione tissutale. In questo video, dimostreremo come srotolare l'ovidotto del topo, riconoscere i diversi segmenti in modo che possano essere analizzati individualmente e, infine, come produrre una resa relativamente alta di cellule dissociate differenziate.
Una migliore comprensione dell'ambiente specifico dell'ampolla può migliorare le tecniche di fecondazione in vitro. Inoltre, confrontando l'infundibulum con altri segmenti, possiamo comprendere meglio la propensione dell'infundibulum alla trasformazione maligna. La procedura di dissociazione a singola cellula libera le cellule stromali ed epiteliali dall'ovidotto.
Il nostro metodo offre anche l'opportunità di analizzare separatamente i contributi immunitari, muscolari lisci ed epiteliali alla fisiologia e alla patologia dell'ovidotto. Lavorare al microscopio di dissezione può essere difficile all'inizio. Consiglierei di esercitarsi con un tubo più grande come l'utero per garantire che i tuoi strumenti siano adeguati per la microdissezione dell'ovidotto.
Inizia apponendo un pezzo di cera dentale su una capsula di Petri con adesivo e lasciandolo asciugare. Quindi disinfettare il piatto con il 70% di etanolo. La superficie è ora pronta per la dissezione.
Immobilizzare la capsula di Petri contenente la cera dentale sulla piattaforma fredda sotto un microscopio di dissezione quando è pronta per la dissezione. Disinfettare la superficie ventrale dell'animale con il 70% di etanolo. Quindi aprire la cavità addominale e pelvica con forbici di dissezione sterili.
Spostare il tratto gastrointestinale su un lato per individuare l'utero bihornale dorsale. Seguire ogni corno uterino rostralmente per individuare ogni ovidotto e ovaio che sono avvolti nel cuscinetto di grasso uterino appena sotto il rene. Quindi asportare entrambi gli ovidotti laterali con le ovaie e una porzione del corno uterino distale ancora attaccato usando le forbici di dissezione.
Tagliare ogni corno uterino laterale con circa uno o due centimetri del corno ancora attaccato all'ovidotto e all'ovaio arrotolati. Immergere immediatamente il tessuto in due millilitri di mezzo di dissezione a freddo, quindi apporre il tessuto uterino alla cera dentale con un ago sterile da 25 gauge per fissare il tessuto per la dissezione. Pulire e sezionare il cuscinetto di grasso ovarico e il tessuto connettivo per visualizzare chiaramente l'ovidotto.
Utilizzare una siringa da un millilitro per erogare una o due gocce di soluzione sterile di colorante blu toluidina all'1% e incubare per 30 secondi a un minuto. Risciacquare con DPBS freddo e quindi rimuovere tutto il liquido. Tirare leggermente l'ovaio dall'ovidotto arrotolato.
Tagliare la membrana borsale nel legamento largo per rimuovere l'ovaio dall'ovidotto senza compromettere il tessuto tubarico. Individuare l'estremità fimbriale distale dell'ovidotto che si trova lateralmente alla giunzione tubarica uterina. Tirare delicatamente il tubo e tagliare via il mesosalpinx con micro-forbici a molla per srotolare l'ovidotto.
Tagliare il tubo per produrre la regione infundibolare. Quindi asportare la regione ampollare tagliando tra i giri due e tre. Infine, tagliare la porzione rimanente alla giunzione tubarica uterina che è la regione istmica.
Congelare immediatamente i segmenti di tessuto sezionati in azoto liquido e quindi aggiungere 200 microlitri di reagente di estrazione dell'RNA freddo e miscela di perline di omogeneizzazione one-to-one al tessuto per l'isolamento dell'RNA. Partendo dalla regione fibriale, tagliare longitudinalmente il tubo con forbici a molla e utilizzare la pinza come leva per esporre l'epitelio luminale. Tritare le porzioni aperte a fessura e l'ovidotto rimanente in segmenti di circa uno o due millimetri.
Quindi aggiungere cinque millilitri di tampone di dissociazione caldo non enzimatico al tessuto e incubare a 37 gradi Celsius. Qui vengono mostrate immagini fluorescenti e a contrasto di fase di un cluster cellulare positivo per occludina, nuclei e tubulina acetilata. Il rosso denota occludina, il blu denota nuclei e il verde denota tubulina acetilata.
Il bordo apicale ciliato rimane intatto per tutto il protocollo e resiste a un'ulteriore digestione alle singole cellule. In queste immagini rappresentative vengono mostrati i canali uniti, rosso, blu, contrasto di fase e verde. Dopo una breve incubazione della pronasi, la maggior parte delle cellule sono singole.
La colorazione dello ioduro di propidio mostra una vitalità di circa il 93% in Brightfield, pi positivo del canale rosso e fusione. L'inserto all'unione mostra un bordo ciliato intatto su una singola cella dissociata. Tali cellule hanno attivamente battendo le ciglia.
L'RNA intero è stato valutato per la resa e la qualità mediante spettrofotometro a microvolume e bioanalizzatore. I risultati mostrano che questo metodo produce da 800 a 1.200 nanogrammi di RNA per segmento, ad eccezione dei campioni infundibolari in cui può essere necessario il pooling di due animali per una resa appropriata per i saggi a valle. I risultati presentati per l'infundibulum sono raggruppati da due animali, per un totale di quattro regioni infundibolari.
Questo protocollo raggiunge con successo l'RNA puro analizzato con uno spettrofotometro a microvolume e un bioanalizzatore. I campioni hanno un rapporto di assorbimento di 260 per 280 nanometri tra 1,8 e 2, tipico delle specie di nucleotidi di RNA puro. La bioanalisi dei campioni ha mostrato un'elevata integrità dell'RNA con un numero di integrità dell'RNA valutato superiore a sette, appropriato per l'espressione a valle e l'analisi di sequenziamento.
Ricorda di trattenere uno o due centimetri del corno uterino per fissare il sistema tubarico alla piattaforma di dissezione. Inoltre, l'uso del colorante blu toluidina aiuta nello srotolamento rapido dell'ovidotto. Più veloce è lo srotolamento, migliore è la conservazione e la minima quantità di degradazione dell'RNA.
Questo metodo è sufficiente per ottenere RNA di qualità appropriata per il sequenziamento dell'RNA che consente il sequenziamento dei singoli segmenti. La dissociazione cellulare è appropriata per il sequenziamento a singola cellula o la citometria a flusso che consente un'analisi più precisa del segmento e della cellula. Il metodo aiuterà a spostare il campo oltre l'analisi dell'intero tubo che maschera le differenze a livello di segmento o singola cella.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per la microdissezione della tuba uterina del topo, che consente il prelievo di singoli segmenti preservando l'integrità dell'RNA. Inoltre, descrive una procedura non enzimatica per la dissociazione delle cellule della tuba uterina, adatta all'analisi di geni e proteine.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Biologia della riproduzione
Sfondo
- I diversi segmenti dell'ovidotto hanno funzioni fisiologiche uniche.
- Questi segmenti variano nella loro suscettibilità ai cambiamenti patologici.
- L'identificazione dei segmenti negli ovidotti piccoli del topo è difficoltosa.
- La produzione di cellule ben differenziate mediante dissociazione del tessuto è difficile.
Scopo dello studio
- Dimostrare lo srotolamento dell'ovidotto del topo.
- Identificare e analizzare singolarmente i diversi segmenti dell'ovidotto.
- Migliorare la comprensione dell'ambiente dell'ampolla al fine di ottimizzare le tecniche di fecondazione in vitro.
Metodi Utilizzati
- Microdissezione dell'ovidotto del topo.
- Identificazione dei segmenti distinti dell'ovidotto.
- Dissociazione non enzimatica delle cellule oviduttali.
- Analisi delle cellule stromali ed epiteliali.
Risultati principali
- Identificazione riuscita dei singoli segmenti delle tube di Falloppio.
- Elevata resa di cellule dissociate differenziate ottenute.
- Approfondimenti sul ruolo dell'infundibolo nella trasformazione maligna.
- Potenziali miglioramenti delle tecniche di fecondazione in vitro.
Conclusioni
- I metodi presentati facilitano un'analisi dettagliata dei segmenti oviduttali.
- Comprendere le funzioni specifiche dei segmenti può migliorare la ricerca riproduttiva.
- Studi futuri potrebbero concentrarsi sulle implicazioni per i trattamenti della fertilità.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente un'analisi molecolare e cellulare precisa dell'ovidutto murino superando le barriere tecniche legate alle sue ridotte dimensioni e alla complessa anatomia. Supporta la validazione degli bersagli e la riduzione del rischio meccanicistico in biologia della riproduzione, oncologia e immunologia, permettendo l'analisi specifica per segmento di processi fisiologici e patologici. L'approccio aumenta la fiducia predittiva nei modelli preclinici preservando l'integrità dell'RNA e fornendo cellule singole vitali e differenziate per applicazioni successive come RT-qPCR, RNAseq e citometria a flusso.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle funzioni fisiologiche specifiche per segmento e della diversa suscettibilità a modificazioni patologiche, come la trasformazione maligna nell'infundibolo.
- Valore operativo: Fornisce rese di RNA puro comprese tra 800 e 1.200 ng per segmento, sufficienti per RT-qPCR e RNAseq, sostenendo flussi di lavoro affidabili per la validazione degli obiettivi.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Facilita la preparazione di sistemi biologici validati per saggi successivi isolando cellule oviduttali completamente differenziate con bordi cigliati integri e alta vitalità (circa il 93%).
- Valore operativo: Utilizza un buffer di dissociazione prevalentemente non enzimatico che preserva l'integrità cellulare, consentendo un isolamento riproducibile di singole cellule per citometria a flusso e RNAseq a singola cellula.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta l'analisi di sistemi rilevanti per le malattie consentendo la valutazione separata dei contributi delle cellule immunitarie, muscolari lisce ed epiteliali alla fisiologia e patologia delle tube di Eustachio.
- Valore operativo: Garantisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica fornendo dati molecolari e cellulari risolti per segmento, allineati con le origini embriologiche e i rapporti tra i tipi cellulari epiteliali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla biologia iniziale all'identificazione del composto attivo, consentendo la verifica delle ipotesi a livello di segmento delle tube di Falloppio e supportando la riduzione dei rischi meccanicistici mediante una preparazione precisa del sistema biolog游戏副本
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi biologici consentendo l'analisi individuale dei quattro segmenti funzionali dell'ovidutto, caratterizzati da rapporti distinti tra i tipi cellulari epiteliali.
- Screening: Permette la prontezza per saggi grazie a una dissociazione standardizzata che fornisce cellule vitali e differenziate, adatte ad analisi quantitative nelle piattaforme di screening.
- Analisi: Fornisce RNA di alta integrità (RIN >7) e dati quantificabili a livello singola cellula, consentendo il confronto tra condizioni diverse all'interno dei vari segmenti e tipi cellulari.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo l'analisi della suscettibilità segmento-specifica alle malattie, come le lesioni precursori derivate dall'infundibolo nei carcinomi sierosi intraepiteliali.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per la ricerca sull'ovidutto in programmi di riproduzione, fertilità, oncologia e immunologia, riducendo la dipendenza dall'analisi dell'intero ovidutto, che maschera le differenze a livello segmentario.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Conferma predittiva attraverso la validazione del bersaglio specifica per segmento e riduzione dell'ambiguità meccanicistica in sistemi tissutali complessi.
- Valore operativo: Standardizzazione, riproducibilità e scalabilità mediante un protocollo definito di microdissezione e dissociazione che minimizza la degradazione dell'RNA.
- Valore strategico: Decisioni più efficaci di avvio/cessazione, maggiore efficienza del capitale e riduzione del rischio biologico in fasi avanzate, consentendo la rilevazione precoce di suscettibilità patologiche specifiche per segmento.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione e decisioni di avanzamento corrette per rischio basate su approfondimenti meccanicistici derivanti dai singoli segmenti dell'ovidotto e dalle popolazioni cellulari.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze in microscopia per dissezioni e manipolazione dei tessuti, con pratica iniziale consigliata su strutture più grandi come l'utero.
- Necessita di strumentazione inclusa microscopi per dissezioni, forbici microchirurgiche a molla, aghi da 25 gauge e attrezzature per l'estrazione dell'RNA e l'analisi cellulare.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per i tempi di dissezione, la colorazione con blu di toluidina e la manipolazione dei tessuti in condizioni di freddo, al fine di garantire coerenza tra diversi operatori e esperimenti.
- Comporta considerazioni di adattamento per diversi sistemi modello, poiché il protocollo è ottimizzato per le dimensioni delle ovidutti murine (diametro di 200–400 μm).
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di raggruppare campioni infundibolari da due animali per ottenere un rendimento sufficiente di RNA per saggi successivi.
