Preparazione biologica e tecnica meccanica per la determinazione delle proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari

L'importanza del nostro metodo sta nella sua capacità di rispondere alla domanda, quali sono le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari, le fibre che sospendono la lente all'interno dell'occhio? Il vantaggio principale della nostra tecnica è che può quantificare le proprietà viscoelastiche delle piccole e delicate fibre zonulari di topi con e senza modificazioni geniche mirate. Le mutazioni nei geni che codificano per le proteine delle microfibrille sono alla base di diverse condizioni sindromiche ereditarie.

Utilizzando la nostra tecnica, possiamo studiare come mutazioni specifiche alterano le proprietà biomeccaniche delle microfibrille. Per iniziare, dopo l'eutanasia del mouse, rimuovere gli occhi usando una pinza fine. Inserire la punta di un ago di fissaggio attraverso la parete dell'occhio e posizionarla al centro dell'umore vitreo, facendo attenzione a non danneggiare la lente.

Trasferire con attenzione l'occhio impalato in un tubo riempito con 4% di paraformaldeide e soluzione salina tamponata con fosfato. Aprire la valvola che collega l'ago a un serbatoio fissato situato a 25 centimetri sopra il campione che mantiene una pressione positiva equivalente a 15-20 millimetri di mercurio all'interno dell'occhio durante il periodo di fissazione e lasciare il campione da fissare durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere l'ago di fissazione e lavare l'occhio per 10 minuti in soluzione salina tamponata con fosfato.

Impiegando forbici chirurgiche oftalmiche e uno stereomicroscopio, eseguire un'incisione a tutto spessore nella parete dell'occhio vicino alla testa del nervo ottico. Estendere il taglio in avanti verso l'equatore e poi intorno alla circonferenza equatoriale dell'occhio risparmiando attentamente i delicati processi ciliari e le fibre zonulari associate. Esporre la superficie posteriore della lente rimuovendo il retro del globo.

Rimuovere l'occhio sezionato dalla soluzione tampone usando una pinza e posizionarlo su una salvietta asciutta con la cornea rivolta verso il basso. Trascinare delicatamente la cornea sulla superficie della salvietta per asciugarla. Applicare una goccia di colla istantanea sul fondo di una capsula di Petri da 50 millimetri e fissare la piattaforma ad essa.

Posizionare il piatto sulla piastra del palco dello stereomicroscopio in modo che il pozzo con la colla sia in vista. Per accogliere l'occhio nei pozzetti della piattaforma della capsula di Petri, aggiungere tre microlitri di colla istantanea. Posizionalo con attenzione nel pozzetto e regolalo rapidamente in modo che la parte posteriore dell'obiettivo sia rivolta verso l'alto.

Asciugare il lato esposto della lente tamponando delicatamente con l'angolo di una salvietta asciutta. Per misurare la risposta viscoelastica zonulare, accendere la bilancia, posizionare la capsula di Petri sulla bilancia, quindi avviare il programma di registrazione della bilancia e il software della fotocamera. Accendere il controller del servomotore.

Avviare l'applicazione controller sul computer e impostare i parametri di movimento con incrementi di 50 micrometri. Create una piegatura di 90 gradi in un'asta capillare. Far scivolare il capillare piegato nel portasonda capillare e stringere le viti di fissaggio.

Alla punta capillare, aggiungere una piccola perla di colla per polimerizzazione UV. Spostare la punta della sonda capillare utilizzando le regolazioni manuali sul manipolatore e posizionarla direttamente sopra la parte superiore dell'obiettivo. Attraverso l'ispezione visiva frontale e la vista laterale utilizzando una telecamera al microscopio, esaminare che la parte inferiore della colla UV appaia centrata sulla parte superiore dell'obiettivo.

Mentre si guarda attraverso la fotocamera, abbassare la punta della sonda fino a quando la colla UV non entra in contatto con l'obiettivo e copre da 1/3 a 1/2 della sua superficie superiore. Polimerizzare la colla utilizzando una sorgente di luce UV direzionale quasi visibile di lunghezza d'onda da 380 a 400 nanometri e un'intensità di circa un milliwatt. Aggiungere la soluzione PBS alla capsula di Petri fino a coprire l'occhio ad una profondità di almeno due millimetri.

Posizionare una lente cilindrica davanti al microscopio e in modo vicino alla capsula di Petri senza toccarla. Allo stesso tempo, avviare la registrazione in un programma timer. Scatta una foto dell'occhio e della sonda usando la fotocamera.

Dopo 60 secondi, iniziare uno spostamento di 50 micrometri. Ripeti ogni 60 secondi fino al completamento dell'esperimento come indicato dalla rottura di tutte le fibre zonulari. Salva i dati di registrazione della scala al termine di un'esecuzione ed esportali in un formato di foglio di calcolo compatibile.

Inoltre, salvare le immagini dell'obiettivo ottenute durante la corsa. Importare i dati in un foglio di calcolo. Usando la prima e l'ultima lettura in scala, interpolare la deriva nella lettura di fondo nel tempo a causa dell'evaporazione, quindi sottrarre lo sfondo interpolato dalla lettura in ogni punto temporale.

Dopo aver eseguito il test e la correzione per l'evaporazione, il grafico dei dati viscoelastici viene invertito. L'entità delle forze istantanee e rilassate aumenta ad ogni passo fino a circa 1.000 secondi, quindi diminuisce quando le fibre zonulari iniziano a rompersi fino a raggiungere il punto temporale di 1.500 secondi quando tutte le fibre sono rotte. Per questa dimostrazione, è stata confrontata anche la risposta viscoelastica per topi wild type e con deficit di MAGP-1.

Al tempo iniziale da zero a 600 secondi, i grafici si assomigliano suggerendo che le proprietà viscoelastiche delle fibre zonulari non sono state significativamente alterate. Tuttavia, nel topo knockout MAGP-1, le fibre si rompono prematuramente. Le forze di rottura delle fibre zonulari sono state ottenute con il metodo pull-up per MAGP-1 rispetto a topi selvatici a un mese e un anno di vita.

I risultati hanno indicato che la forza delle fibre aumenta con l'età per i topi selvatici. Qualsiasi contatto accidentale con la capsula di Petri durante questi passaggi può causare lo spostamento della parete oculare rispetto alla lente dell'occhio, danneggiando potenzialmente le fibre zonulari. Questo test di pull-up aiuta a identificare le proteine che contribuiscono alla resistenza alla trazione delle microfibrille.

Useremo queste informazioni per costruire modelli più realistici dell'interno delle fibre zonulari.