Name: Una solida piattaforma di scoperta per lidentificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Scopri un flusso di lavoro standardizzato per valutare i mediatori delle metastasi del melanoma utilizzando modelli in vivo robusti. Questo metodo facilita la scoperta di bersagli terapeutici e migliora la riproducibilità dei dati.

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Ringraziamo la Division of Advanced Research Technologies (DART) della NYU Langone Health, e in particolare, il Experimental Pathology Research Laboratory, il Genome Technology Center, il Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, che sono parzialmente supportati dal Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH/NCI 5P30CA016087. Ringraziamo il NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) per aver fornito l'accesso alle colture a breve termine di melanoma derivate dal paziente + (10-230BM e 12-273BM), che sono state ottenute attraverso protocolli approvati dall'IRB (Universal Consent study #s16-00122 e Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group study #10362). Ringraziamo il Dr. Robert Kerbel (Università di Toronto) per aver fornito le linee cellulari di melanoma 113/6-4L e 131/4-5B1* e il Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) per aver fornito colture a breve termine di melanoma WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2**. E.H. è supportato da NIH/NCI R01CA243446, P01CA206980, un American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award e un NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). La Figura 1 è stata creata con Biorender.com.

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<li>Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+biological+determinants+of+melanoma+progression%3A+Should+all+be+considered+for+clinical+management%5BTitle%5D)+AND+%22Australasian+Journal+of+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management.</a> Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).</li>
<li>Plebanek, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-metastatic+cancer+exosomes+induce+immune+surveillance+by+patrolling+monocytes+at+the+metastatic+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche.</a> Nature Communications. 8 (1), 1319(2017).</li>
<li>Orgaz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+pigment+epithelium-derived+factor+enables+migration%2C+invasion+and+metastatic+spread+of+human+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma.</a> Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).</li>
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<li>Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+melanoma+cell-stroma+interaction+in+cell+motility%2C+invasion%2C+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine+-+Dermatology%22%5BJournal%5D)">The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis.</a> Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307(2018).</li>
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<li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+mouse+melanoma+cell+lines+by+their+mortal+malignancy+using+an+experimental+metastatic+model%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model.</a> Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).</li>
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<li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+inhibitor+vemurafenib+improves+the+antitumor+activity+of+adoptive+cell+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy.</a> Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).</li>
<li>Jenkins, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+murine+BRaf%28V600E%29+melanoma+cell+lines+with+sensitivity+to+PLX4032%5BTitle%5D)+AND+%22Pigment+Cell+Melanoma+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032.</a> Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).</li>
<li>Tuncer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SMAD+signaling+promotes+melanoma+metastasis+independently+of+phenotype+switching%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching.</a> The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).</li>
<li>Schwartz, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incipient+Melanoma+Brain+Metastases+Instigate+Astrogliosis+and+Neuroinflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation.</a> Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).</li>
<li>Perez-Guijarro, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodel+preclinical+platform+predicts+clinical+response+of+melanoma+to+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy.</a> Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).</li>
<li>Krepler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Patient-Derived+Xenograft+Collection+Representing+the+Heterogeneity+of+Melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma.</a> Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).</li>
<li>Agrawal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systems+biology+approach+identifies+FUT8+as+a+driver+of+melanoma+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis.</a> Cell. 31 (6), 804-819 (2017).</li>
<li>Hanniford, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+silencing+of+CDR1as+drives+IGF2BP3-mediated+melanoma+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis.</a> Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Lo scopo di questo rapporto tecnico è quello di offrire un flusso di lavoro standardizzato, dall'alto verso il basso per lo studio di potenziali attori nelle metastasi del melanoma. Poiché gli esperimenti in vivo possono essere costosi e dispendiosi in termini di tempo, le strategie per massimizzare l'efficienza e aumentare il valore delle informazioni ottenute sono fondamentali.
È imperativo utilizzare approcci complementari per incrociare i risultati all'interno dello stesso esperim...

L'elevata mortalità associata al melanoma metastatico combinata con una crescente incidenza di melanoma in tutto il mondo1 (un aumento stimato del 7,86% entro il 2025) richiede nuovi approcci terapeutici. I progressi nella scoperta del target dipendono da modelli riproducibili di metastasi, un processo altamente complesso. Durante le fasi della cascata metastatica, le cellule di melanoma devono superare innumerevoli barriere per raggiungere l'evasione del sistema immunitario e la colonizzazione di tessuti distanti2. La resilienza e l'adattabilità delle cellule di melanoma derivano da una moltitudine di fattori, tra cui il loro elevato carico genetico mutazionale3 e la loro origine della cresta neurale, che conferiscono plasticità fenotipica cruciale 3,4,5. Ad ogni fase, i programmi trascrizionali consentono alle cellule di melanoma metastatizzante di passare da uno stato all'altro in base a segnali provenienti dalla diafonia con il microambiente, comprendente il sistema immunitario6, l'ambiente extracellulare 7,8 e l'architettura cellulare delle barriere fisiche9 con cui entrano in contatto. Ad esempio, le cellule di melanoma sfuggono alla sorveglianza immunitaria sottoregolando l'espressione di importanti fattori secreti dal tumore immuno-priming6.
Gli studi descrivono una "nicchia premetastatica", in cui le cellule di melanoma secernono chemochine e citochine per innescare l'organo "bersaglio" distante per le metastasi10. Questi risultati sollevano importanti domande sul tropismo d'organo delle cellule di melanoma metastatico e sul percorso anatomico che intraprendono per accedere a tessuti distanti. Dopo l'intravaso, è noto che le cellule di melanoma metastatizzano attraverso i linfatici (diffusione linfatica) e i vasi sanguigni (diffusione ematogena)2,11. Mentre la maggior parte dei pazienti presenta una malattia localizzata, un piccolo sottogruppo di casi presenta una malattia metastatica a distanza e nessuna disseminazione linfatica (coinvolgimento linfonodale negativo)11, suggerendo l'esistenza di percorsi metastatici alternativi per il melanoma.
Quando colonizzano un sito metastatico, le cellule di melanoma subiscono adattamenti epigenetici e metabolici12,13. Per accedere e invadere nuovi compartimenti, le cellule di melanoma impiegano proteasi14 e modificazioni citoscheletriche 11,15, che consentono loro di attraversare e crescere nella loro nuova posizione. La difficoltà nel colpire le cellule di melanoma risiede nella complessità e nel numero di tali adattamenti; pertanto, il campo dovrebbe fare sforzi per ricreare sperimentalmente il maggior numero possibile di passaggi e adattamenti. Nonostante i numerosi progressi nei saggi in vitro come gli organoidi e le colture 3D16,17, questi modelli ricapitolano solo in modo incompleto la cascata metastatica in vivo.
I modelli murini hanno dimostrato valore trovando un equilibrio tra riproducibilità, fattibilità tecnica e simulazione della malattia umana. Cellule di melanoma impiantate per via intravascolare, ortotopica ed eterotopica da xenotrapianti derivati dal paziente o colture a breve termine in topi immunocompromessi o umanizzati rappresentano la spina dorsale della scoperta del bersaglio nel melanoma metastatico. Tuttavia, questi sistemi spesso mancano di un vincolo biologico cruciale sulle metastasi: il sistema immunitario. I modelli di metastasi del melanoma singenico che possiedono questo vincolo sono relativamente scarsi sul campo. Questi sistemi, sviluppati in topi immunocompetenti, tra cui B16-F1018, la famiglia YUMM di linee cellulari19, SM120, D4M321, RIM322 o più recentemente, RMS 23 e M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 linee cellulari di melanoma, facilitano lo studio del complesso ruolo della risposta immunitaria dell'ospite nella progressione del melanoma.
Qui, viene presentata una pipeline per l'identificazione del bersaglio delle metastasi del melanoma. Con l'aumento e più grandi set di dati "omici" generati da coorti di pazienti affetti da melanoma, postuliamo che gli studi che detengono la maggiore promessa clinica siano quelli che derivano dall'integrazione dei big data, portando a un meticoloso interrogatorio funzionale e meccanicistico 25,26,27,28. Utilizzando modelli murini per studiare potenziali bersagli nel processo metastatico, si possono tenere conto di eventi specifici in vivo e interazioni tissutali, aumentando così la probabilità di traduzione clinica. Sono delineati diversi metodi per quantificare il carico metastatico, fornendo dati complementari sui risultati di un dato esperimento. Viene descritto un protocollo per l'isolamento unicellulare dai tumori in vari organi per aiutare la caratterizzazione imparziale dell'espressione genica nelle cellule metastatiche, che può precedere il sequenziamento dell'RNA monocellulare o di massa.

<table><tbody><tr><td>#15 Lama Scapel&nbsp;</td><td>WPI</td><td>500242</td><td>Per procedure chirurgiche</td></tr><tr><td>#3 Scapel Handle</td><td>WPI</td><td>500236</td><td>Per procedure chirurgiche</td></tr><tr><td>1 mL di siringa di tubercolina, punta scorrevole&nbsp;</td><td>BD</td><td>309626</td><td>Iniezioni</td></tr><tr><td>Siringa da 10 mL, punta a slittamento</td><td>BD</td><td>301029</td><td>Perfusione</td></tr><tr><td>10% Formalina Tamponata</td><td>di sodio EK Industries</td><td>4499-20L</td><td>Per perfusione/fissativo tissutale</td></tr><tr><td>15 mL</td><td>Corning conico&nbsp;</td><td>430052</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>15 mL Provette coniche da centrifuga in polipropilene</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Deacon Labs</td><td>04-355-223</td><td>Istologia</td></tr><tr><td>22G - Ago da 22 mm</td><td>BD</td><td>305156</td><td>Perfusione</td></tr><tr><td>4-0 Vicryl Suture</td><td>Ethicon</td><td>J464G</td><td>Sutura</td></tr><tr><td>4% fosfato di Carson tamponato paraformaldeide&nbsp;</td><td>EMS</td><td>15733-10</td><td>Per perfusione/fissativo tissutale</td></tr><tr><td>40&micro; m</td><td>Corning</td><td>431750</td><td>Lavorazione dei tessuti</td></tr><tr><td>5-0 Sutura assorbibile&nbsp;</td><td>Ethicon</td><td>6542000</td><td>Chiusura</td></tr><tr><td>50 mL Conico&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430828</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>50mL Provette coniche da centrifuga in polipropilene Falcon</td><td></td><td>352070</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>7-0 Sutura in seta&nbsp;</td><td>FST</td><td>18020-70</td><td>Legatura</td></tr><tr><td>70&micro; m</td><td>Corning</td><td>431751</td><td>Lavorazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Supporti di montaggio anti-sbiadimento&nbsp; &nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>H-1000-10</td><td>Approssimatore di immunofluorescenza</td></tr><tr><td>che applica pinze, 10 cm&nbsp;</td><td>WPI</td><td>14189</td><td>Per procedure microchirurgiche</td></tr><tr><td>Avance</td><td>Bruker</td><td>3 HD</td><td>NMR Console&nbsp;</td></tr><tr><td>Biospec 7030&nbsp;</td><td>Bruker</td><td>7030</td><td>Micro MRI</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Bioreg</td><td>A941</td><td>NuMA Colorazione</td></tr><tr><td>Pinza per sutura Castroviejo, punte dritte Piattaforma di legatura da 5,5 mm, 11 cm&nbsp;</td><td>WPI</td><td>WP5025501</td><td>Per procedure microchirurgiche</td></tr><tr><td>Barattolo di colorazione Coplin</td><td>Bel-Art&nbsp;</td><td>F44208-1000</td><td>Istologia</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Immunofluorescenza</td></tr><tr><td>dCas9-KRAB</td><td>Addgene</td><td>110820</td><td>Manipolazione genetica</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>NEB</td><td>M0303L</td><td>Elaborazione dei tessuti</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Corning</td><td>21-030-CM</td><td>Lavorazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Lama a bordo singolo non rivestita extra affilata</td><td>GEM</td><td>62-0167</td><td>Lavorazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Substrato della matrice extracellulare&nbsp;</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>considerare il fattore di crescita ridotto (come alternativa&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cytiva</td><td>SH30910.03</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Fiji Immagine J</td><td>Fiji Immagine J</td><td>Software</td><td>Immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Capra anti-coniglio HRP coniugato multimero&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>A16104</td><td>NuMA Siero di capra colorante</td></tr><tr><td></td><td>Gibco</td><td>PCN5000</td><td>Immunofluorescenza</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>Lavorazione dei tessuti</td></tr><tr><td>Ematossilina&nbsp;</td><td>Richard-Allan Scientific&nbsp;</td><td>7231</td><td>Istologia</td></tr><tr><td>Illumina III</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td>BLI Instrument</td></tr><tr><td>Siringa da insulina 28G - ago da 8 mm</td><td>BD</td><td>329424</td><td>Iniezioni</td></tr><tr><td>Siringa da insulina 31G - ago da 6 mm.</td><td>BD</td><td>326730</td><td>Iniezioni Pinze</td></tr> per <tr><td>iris, 10,2 cm, curva completa, seghettate</td><td>WPI</td><td>504478</td><td>Per perfusione e procedure chirurgiche</td></tr><tr><td>Isoflurano USP</td><td>Covetrus</td><td>11695067772</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Gioiellieri #7 Pinze Titanio 11 cm 0,07 x 0,01 mm Punta</td><td>WPI</td><td>WP6570</td><td>Per procedure microchirurgiche</td></tr><tr><td>Ketamina HCl 100mg/mL</td><td>Mylan Ind.</td><td>1049007</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>lentiCRISPRv2</td><td>Addgene</td><td>98290</td><td>Manipolazione genetica</td></tr><tr><td>Lycopersicon Esculentum (Pomodoro) Lectina, DyLight 649</td><td>Invitrogen</td><td>L32472</td><td>Marcatore di cellule endoteliali vascolari</td></tr><tr><td>MEM aminoacidi non essenziali X 100</td><td>Corning</td><td>25-025-CI</td><td>Colture cellulari</td></tr><tr><td>Forbici Metzenbaum</td><td>WPI</td><td></td><td>503269 Per chirurgia procedure</td></tr><tr><td>Unità di microiniezione</td><td>KOPF</td><td>5000</td><td>Iniezioni intracardiache</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S25877&nbsp;</td><td>Colorazione NuMA</td></tr><tr><td>Ago 30G x 25mm</td><td>BD</td><td>305128</td><td>Ago per iniezione intracardiaca</td></tr><tr><td>33G x 15mm</td><td>Hamilton</td><td>7747-01</td> Porta ago per <td>iniezione intracarotidea</td></tr><tr><td>, Castroviejo, 14cm, con blocco, 1,2mm Ganasce seghettate</td><td>WPI</td><td>14137-G</td><td>Per procedure microchirurgiche</td></tr><tr><td>NOD. Topi Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>005557</td><td>topi Murine model</td></tr><tr><td>NU/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>002019</td><td>Modello murino</td></tr><tr><td>Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>97585</td><td>NuMA Colorazione</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina 10000U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE</td><td>0891-01</td><td>soluzione di separazione della densità&nbsp;</td></tr><tr><td>Guanti chirurgici classici PI Cardinal</td><td>Health</td><td>2D72PT75X</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>pLKO Tet-On</td><td>Addgene</td><td>21915</td><td>Manipolazione genetica</td></tr><tr><td>Povidone-Iodio 10% Soluzione</td><td>Medline</td><td>MDS093943</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Gocce di proparacaina 0,5%</td><td>Akorn Pharma</td><td>AX0501</td><td>Anestetico locale oftalmico</td></tr><tr><td>Puralube Petrolatum Unguento oftalmico</td><td>Dechra</td><td>83592</td> Lame per rasoio per <td>anestesia</td></tr><tr><td>Lame a doppio taglio&nbsp;</td><td>EMS</td><td>72000</td><td>Rasatura e Vibrotomo Brain Slicing&nbsp;</td></tr><tr><td>Reflex 9mm EZ Clip&nbsp;</td><td>Braintree</td><td>EZC-&nbsp; KIT</td><td>Chiusura ferita</td></tr><tr><td>RPMI 1640&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040-CM</td><td>Forbici per colture cellulari</td></tr><tr><td>, molla 10,5 cm Str, lame da 8 mm</td><td>WPI</td><td>501235</td><td>Per procedure microchirurgiche</td></tr><tr><td>Microtomo a lama vibrante semiautomatico</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>Brain Slice Immunofluorescenza</td></tr><tr><td>Sistema di vaporizzazione per anestesia a canale singolo</td><td>Kent Scientific</td><td>VetFlo-1210S&nbsp;</td><td>anestesia</td></tr><tr><td>Sistema di camere da tavolo Smartbox e soffiatore di scarico</td><td>EZ Systems</td><td>TT4000</td><td>Eutanasia CO2</td></tr><tr><td>Telo monouso fenestrato sterile</td><td>Medline</td><td>NON21002</td><td>Chirurgia</td></tr><tr><td>Cultori chirurgici Aurora sterili non rinforzati con maniche a scomparsa</td><td>Medline</td><td>DYNJP2715</td><td></td></tr><tr><td>Surgery T25 Flask</td><td>Corning&nbsp;</td><td>430639</td><td>Coltura cellulare</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Corning</td><td>46-031-CM</td><td>Colorazione NuMA</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td> Pinza per legatura <td>Troutman in immunofluorescenza</td></tr><tr><td>, 10 cm, modello G curvo, punta da 0,52 mm con piattaforma di legatura</td><td>WPI</td><td>WP505210</td><td>Per procedure microchirurgiche</td></tr><tr><td>Clip per vasi 10G Pressione 5x 0,8 mm Ganasce, 5/confezione</td><td>WPI</td><td>15911</td><td>Per procedure microchirurgiche</td></tr><tr><td>Visiopharm</td><td>Visiopharm Visiopharm</td><td></td><td>Software di quantificazione della colorazione NuMA</td></tr><tr><td>Xilasina 100mg/mL</td><td>Akorn Pharma</td><td>59399-111-50</td><td>Anestesia</td></tr><tr><td>Xilene</td><td>Fisher</td><td>X3P-1GAL</td><td>Istologia</td></tr></tbody></table>

una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma

A Robust Discovery Platform for the Identification of Novel Mediators of Melanoma Metastasis

Le metastasi sono un processo complesso, che richiede alle cellule di superare barriere che sono solo modellate in modo incompleto da saggi in vitro . È stato stabilito un flusso di lavoro sistematico utilizzando modelli in vivo robusti e riproducibili e metodi standardizzati per identificare nuovi attori nelle metastasi del melanoma. Questo approccio consente l'inferenza dei dati in specifiche fasi sperimentali per caratterizzare con precisione il ruolo di un gene nelle metastasi. I modelli vengono stabiliti introducendo cellule di melanoma geneticamente modificate tramite iniezioni intracardiache, intradermiche o sottocutanee nei topi, seguite dal monitoraggio con imaging seriale in vivo . Una volta raggiunti gli endpoint prestabiliti, i tumori primari e/o gli organi portatori di metastasi vengono prelevati ed elaborati per varie analisi. Le cellule tumorali possono essere ordinate e sottoposte a una qualsiasi delle diverse piattaforme "omiche", incluso il sequenziamento dell'RNA a singola cellula. Gli organi vengono sottoposti ad imaging e analisi immunoistopatologiche per quantificare il carico complessivo delle metastasi e mappare la loro specifica posizione anatomica. Questa pipeline ottimizzata, compresi i protocolli standardizzati per l'attecchimento, il monitoraggio, la raccolta dei tessuti, l'elaborazione e l'analisi, può essere adottata per colture derivate dal paziente, a breve termine e linee cellulari umane e murine consolidate di vari tipi di cancro solido.

Le figure seguenti illustrano come il flusso di lavoro descritto è stato applicato per l'identificazione di nuovi driver di metastasi del melanoma. La Figura 2 riassume i risultati di uno studio pubblicato in cui sono stati studiati gli effetti del silenziamento della fucosiltransferasi FUT8 nelle metastasi del melanoma in vivo 26. In breve, l'analisi dei dati glicemici dei pazienti umani (ottenuti da array di lectine) e il profilo trascrittomico hanno rivela...

Questo articolo descrive un flusso di lavoro di tecniche impiegate per testare nuovi potenziali mediatori di metastasi del melanoma e i loro meccanismi d'azione.

Una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma

Metastasis is a complex process, requiring cells to overcome barriers that are only incompletely modeled by in vitro assays. A systematic workflow was ...

Questo protocollo descrive una serie di tecniche all'interno di un flusso di lavoro continuo che possono essere utilizzate per valutare gli effetti in vivo dei candidati regolatori delle metastasi del melanoma, ma anche delle metastasi di altre neoplasie solide. Il vantaggio principale del nostro flusso di lavoro sistematico è una maggiore riproducibilità dei dati grazie a modelli e tecniche in vivo robusti e standardizzati. Questa pipeline offre un percorso per la scoperta del target e lo sviluppo della terapia testando i candidati dedotti dai dati Omics o dai saggi in vitro in un ambiente in vivo.La curva di apprendimento associata alle tecniche presentate in questo protocollo viene abbreviata utilizzando i materiali forniti e seguendo la descrizione dettagliata durante la pratica dei passaggi. Ad aiutare a dimostrare la procedura saranno Orlando Aristizabal, uno scienziato ricercatore in The Preclinical Imaging Core e Ran Moubarak, un istruttore nel mio laboratorio. Per le iniezioni intradermiche, anestetizzare e radere un topo di otto-10 settimane all'interno di un armadietto di biosicurezza mantenendo le condizioni asettiche.Quindi afferrare e ritrarre la pelle all'indietro co

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Ricerca sul cancro

In questo articolo vengono descritte le procedure di un test metastasi sperimentale che viene utilizzato per determinare il potenziale metastatico di linee cellulari tumorali umane.

Metastasi di analisi sperimentale

Questo video descrive il protocollo per stabilire un modello murino di metastasi spontanee di xenotrapianti derivati da pazienti con cancro del colon-retto o PDX. Questi modelli di xenotrapianto imitano parzialmente le caratteristiche dei carcinomi umani e comprendono gli aspetti critici delle neoplasie maligne umane, tra cui l'invasione e le metastasi.

Modelli murini di metastasi spontanee: una piattaforma per studiare il potenziale metastatico delle cellule di cancro colorettale iniettate ortotopicamente

In questo video, le cellule di melanoma vengono iniettate per via endovenosa attraverso la vena della coda nel modello murino. Le cellule del melanoma viaggiano ulteriormente attraverso il sistema circolatorio, adattandosi al microambiente distante e causando metastasi in organi come i polmoni.

Modello murino sperimentale di melanoma metastatico: una piattaforma per studiare il potenziale metastatico delle cellule di melanoma nei polmoni

Questo protocollo descrive una tecnica per la preparazione del campione mediante la co-coltura di espianti ovarici con le cellule tumorali delle tube di Falloppio. Questi campioni vengono visualizzati utilizzando la spettroscopia di massa per immagini, o IMS, per rilevare lo scambio di piccole molecole tra le cellule e i tessuti che porta allo sviluppo del tumore.

Modellazione della comunicazione del cancro ovarico per l'analisi della spettrometria di massa per immagini: un metodo per identificare i comunicatori chimici di piccole molecole nello sviluppo di tumori ovarici metastatici

Le metastasi svolgono un ruolo profondo nella virulenza del cancro, rappresentando circa il 90% dei decessi.  Riportiamo un protocollo per un modello di melanoma metastatico nel topo che è utile per determinare l'efficacia degli agenti terapeutici contro questo fenomeno clinico.

Iniezione di cellule singenici del topo melanoma per determinare il loro potenziale metastatico nei polmoni

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di pelle 3D organotipiche melanoma sferoide che ricapitola sia l'architettura e pluricellulari complessità di un organo/del tumore in vivo ma allo stesso tempo accomoda sistematica sperimentale intervento.

Un modello di pelle sferoide 3D Organotypic Melanoma

Vi presentiamo un protocollo per valutare i livelli di espressione di microRNA (Mirna) di circolazione nei campioni del plasma dai malati di cancro. In particolare, abbiamo utilizzato un kit disponibile in commercio per estrazione di miRNA e trascrizione d'inversione di circolazione. Infine, abbiamo analizzato un panel di miRNA selezionati 24 utilizzando targhe personalizzate in tempo reale sonda pre-maculato.

Rilevamento di un pannello personalizzato di MicroRNA circolanti in pazienti con cancro colorettale metastatico

Nell'era dell'immunoterapia e della profilazione genomica a singola cellula, la biologia del cancro richiede nuovi strumenti in vitro e computazionali per studiare l'interfaccia tumore-immunità in un contesto spaziotemporale appropriato. Descriviamo protocolli per sfruttare co-colture microfluidiche tumore-immunitarie in contesti 2D e 3D, compatibili con il monitoraggio dinamico e multiparametrico delle funzioni cellulari.

Modelli di co-coltura microfluidica per la dissezione della risposta immunitaria in microambienti tumorali in vitro

Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.

Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo

Il melanoma è una malattia molto aggressiva che si diffonde rapidamente ad altri organi. Questo protocollo descrive l'applicazione dell'imaging ecografico ad altissima frequenza, abbinato al rendering 3D, per monitorare il volume dei linfonodi inguinali nel modello murino Braf/Pten del melanoma metastatico.

Analisi del volume dei linfonodi mediante imaging ecografico ad altissima frequenza nel modello murino geneticamente modificato braf/Pten del melanoma

Qui, presentiamo un protocollo per generare organoidi derivati da pazienti affetti da melanoma coltivando sospensioni cellulari dissociate da tessuti freschi di melanoma. Questi organoidi ricapitolano fedelmente i tumori paziente-specifici in vitro, offrendo un approccio innovativo all'esplorazione dei meccanismi immunosoppressivi dei tumori, allo screening dei farmaci, ai meccanismi di resistenza ai farmaci e agli approcci di sorveglianza del cancro.

Svelare le opportunità terapeutiche con i modelli di organoidi derivati dai pazienti con melanoma

Scopri un flusso di lavoro standardizzato per valutare i mediatori delle metastasi del melanoma utilizzando modelli in vivo robusti. Questo metodo facilita la scoperta di bersagli terapeutici e migliora la riproducibilità dei dati.

Una solida piattaforma di scoperta per l'identificazione di nuovi mediatori delle metastasi del melanoma

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