Name: Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato 1-13 C e spettroscopia NMR 13C / 31P (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 56 s
Description: Scopri come studiare il metabolismo cardiaco in cuori di topo perfusi isolati usando piruvato iperpolarizzato [1-13C] e spettroscopia NMR 13C/31P. Questo metodo permette di quantificare in tempo reale i flussi metabolici e l'energetica cardiaca.

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Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla Israel Science Foundation nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 1379/18; la borsa di studio Jabotinsky del Ministero israeliano della scienza e della tecnologia per le scienze applicate e ingegneristiche per i dottorandi diretti n. 3-15892 per DS; e il programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione n. 858149 (AlternativesToGd).

Il comitato etico congiunto (IACUC) dell'Università ebraica e dell'Hadassah Medical Center ha approvato il protocollo di studio per il benessere degli animali (MD-19-15827-1).
1. Preparazione del tampone Krebs-Henseleit
<ol><li>Un giorno prima dell'esperimento, preparare una versione modificata del buffer Krebs-Henseleit (KHB)26. Inizialmente, sciogliere 118 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 0,5 mM piruvato, 1,2 mM MgSO 4, 25 mM NaHCO3 e 1,2 mM KH 2 PO4 in H2O bidistillato.</li>
	<li>Bollire questa miscela con 95%/5% O 2/CO 2 per 20 minuti, quindi aggiungere 1,2 mM CaCl2.</li>
	<li>Regolare il pH del tampone a 7,4 con HCl o NaOH.</li>
	<li>Il giorno dell'esperimento, aggiungere 10 mM di glucosio e 72 U / L di insulina al KHB preparato nella fase 1.2. NOTA: L'insulina viene aggiunta al tampone di perfusione come descritto nel lavoro di Kolwicz et al.26 e in accordo con studi precedenti che riportano che l'insulina aumenta la funzione contrattile27 e l'intensità del segnale iperpolarizzato [13C] bicarbonato 28.</li>
</ol>2. Preparazione del sistema di perfusione
<ol><li>Conservare un serbatoio di 200 ml di KHB a bagnomaria a 40 °C e bollire con 95%/5% O 2/CO2 ad una portata di 4 L/min per 1 ora prima della perfusione cardiaca. Mantenere il buffer continuamente gorgogliante con questa miscela di gas per tutta la durata dell'esperimento.<ol><li>Innanzitutto, impostare il bagno d'acqua a 40 °C. Inserire il serbatoio KHB. Utilizzare una pompa peristaltica (vedere la tabella dei materiali) e tubi di prolunga di grado medico per ricircolare il KHB tra il serbatoio tampone e il tubo NMR da 10 mm a una portata costante di 7,5 ml / min.</li>
		<li>Collegare tre tubi in silicone polimerizzato al platino (3 mm i.d.) alla pompa (un tubo di afflusso e due tubi di deflusso per il tampone KH). Inserire le linee di deflusso e afflusso nel buffer KH riscaldato. Quindi, inserire la linea dell'ossigeno nel tampone KH riscaldato.</li>
		<li>Utilizzare sottili linee di polietere etere etere chetone (PEEK, vedi Tabella dei materiali) affinché il tampone e l'agente iperpolarizzato fluiscano da e verso il tubo NMR all'interno del foro dello spettrometro.</li>
	</ol></li>
	<li>Assicurarsi che la temperatura sia mantenuta a 37-37,5 °C. Segui i passaggi seguenti.</li>
	<li>Avvolgere la linea di afflusso (dal serbatoio tampone al tubo NMR) con un nastro riscaldante impostato a 42 °C.</li>
	<li>Riscaldare il tubo NMR all'interno dello spettrometro con un flusso d'aria calda regolato dallo spettrometro.</li>
	<li>Utilizzare un sensore di temperatura compatibile NMR (vedere la tabella dei materiali) per misurare la temperatura all'interno del tubo NMR. La temperatura è regolata a 37-37,5 °C.</li>
</ol>3. Taratura e preparazione dello spettrometro NMR per l'acquisizione
<ol><li>Il giorno dell'esperimento, inserire un campione standard di 13 C che contiene 1,4-diossano (tabella dei materiali) nello spettrometro e sintonizzare e abbinare la sonda NMR per 13C. Quindi, ottenere uno spettro che mostri il segnale di equilibrio termico di 1,4-diossano con un angolo di nutazione di 90°.</li>
	<li>Ora scambiate il campione standard di 13C con un campione standard di 31 P (Table of Materials), che contiene 105 mM di ATP in D2O. Sintonizzare e abbinare la sonda NMR per 31P. NOTA: Uno spettro che mostra i segnali di equilibrio termico del fosfato è ottenuto con un angolo di nutazione di 50°.</li>
	<li>Inserire la linea di afflusso, la linea di deflusso e la sonda di temperatura in un tubo NMR da 10 mm, quindi inserire il tubo nel foro magnetico. Regolare il nastro riscaldante a 42 °C.</li>
	<li>Acquisire uno spettro NMR 31P del buffer KH circolante da utilizzare in quell'esperimento per 30 minuti, con un angolo di nutazione di 50° e un TR di 1,1 s (1.640 acquisizioni).</li>
</ol>4. Preparazione animale, procedura chirurgica e perfusione del cuore nel tubo NMR
<ol><li>Anestetizzare un topo maschio HSD:ICR (CD-1) con isoflurano al 3,3% nell'aria ambiente (Table of Materials) a 340 mL/min per 5 minuti utilizzando un sistema di anestesia gassosa (Table of Materials) in una camera a induzione.</li>
	<li>Utilizzare l'anestesia nasale per il mantenimento dell'anestesia generale con isoflurano al 2,9%. NOTA: Si presta attenzione a ridurre al minimo il dolore e il disagio per l'animale.</li>
	<li>Fissare gli arti dell'animale con del nastro adesivo, garantire un riflesso negativo del dolore al pedale e quindi iniettare 300 UI di eparina di sodio per via intraperitoneale.</li>
	<li>Bagnare accuratamente la parete toracica e l'addome del topo con alcool al 70% per garantire la pulizia ed evitare la contaminazione o l'ostruzione dei capelli durante la procedura chirurgica.</li>
	<li>A 1 minuto dopo l'iniezione di eparina, tagliare la pelle e il muscolo della cavità addominale con piccole forbici.</li>
	<li>Posizionare il piccolo morsetto per zanzare che blocca l'emostato a mascella curva tra il processo xifoideo e la pelle del torace per sollevare il torace ed esporre il diaframma. Forare e tagliare il lobo destro del diaframma.</li>
	<li>Tagliare il petto attraverso la linea mediana, ritrarre ai lati e quindi rimuovere.</li>
	<li>Iniettare il ventricolo sinistro del cuore con 200 UI di eparina di sodio per prevenire la coagulazione del sangue. Quindi, iniettare 0,1 ml di 0,5 mol/L KCl ghiacciato per ottenere un arresto cardiaco, come descritto in precedenza25. L'arresto cardiaco è essenziale per poter cannulare il cuore.</li>
	<li>Identificare il timo e rimuoverlo usando le forbici per esporre l'aorta. Rimuovere il tessuto residuo della gabbia toracica.</li>
	<li>Identificare l'arco aortico e utilizzare una pinza curva per posizionare un nodo sciolto con una sutura di seta 3-0 (Table of Materials) attorno all'aorta ascendente. Iniettare 3 ml di KHB nel ventricolo sinistro per rimuovere i coaguli di sangue dall'aorta.</li>
	<li>Utilizzare una pinza curva per ritrarre il cuore in modo inferiore per una migliore visualizzazione dell'aorta ascendente.</li>
	<li>Eseguire l'incannulamento in situ con un catetere endovenoso da 22 G (Table of Materials). Applicare l'adesivo cianoacrilato nella regione cannulata, quindi eseguire la doppia sutura di legatura. Iniettare ulteriore tampone KH nel cuore e verificare che fluisca attraverso il tubo di incannulazione.</li>
	<li>Rimuovere la pinza curva. Scollegare il cuore dai visceri circostanti e perfonderlo retrogradamente con KHB ghiacciato (4 °C) attraverso il catetere endovenoso.</li>
	<li>Collegare il cuore alla linea di afflusso del sistema di perfusione tramite il catetere endovenoso. All'inizio della perfusione con tampone caldo (37-37,5 °C) a 7,5 ml/min, il cuore inizia a battere spontaneamente.</li>
	<li>Fissare il tubo NMR con il cuore pulsante, le linee di deflusso e la sonda di temperatura e inserirlo nel foro dello spettrometro, assicurandosi che il cuore sia al centro della sonda NMR.</li>
</ol>5. Acquisizione dei dati per l'energetica cardiaca e il pH
<ol><li>Acquisire spettri 31P per circa 1 ora con un angolo di rotazione di 50 ° e un TR di 1,1 s.</li>
</ol>6. Polarizzazione e dissoluzione dello spin DNP
<ol><li>Preparare una formulazione da 28,5 mg di [1-13C]piruvato. Questa formulazione consiste di 11,1 mM a 14,0 mM OX063 radicale nell'acido puro.</li>
	<li>Preparare 4 ml di mezzo di dissoluzione. Il mezzo di dissoluzione è costituito da tampone TRIS-fosfato, che contiene 11,2 mM NaH 2 PO 4, 38,8 mM Na 2 HPO4, 33 mM TRIS e2mM HCl. Questa composizione media viene regolata in modo tale che dopo l'aggiunta di 28,5 mg di [1-13C] formulazione di acido piruvico a 4 ml di questo tampone (nella fase di dissoluzione), il pH della soluzione risultante sarà 7,4.</li>
	<li>Eseguire la polarizzazione di spin e la dissoluzione rapida in un dispositivo di polarizzazione di spin DNP (dDNP) secondo le istruzioni del produttore (Tabella dei materiali). Applicare l'irradiazione a microonde ad una frequenza di 94,110 GHz per la polarizzazione della formulazione di acido piruvico [1-13C] da 1,45 K a 1,55 K per circa 1,5 h.</li>
	<li>Miscelare rapidamente i 4 mL di mezzo iperpolarizzato dal dispositivo dDNP con una soluzione ben ossigenata che integra il mezzo di dissoluzione iperpolarizzato per ottenere una composizione che corrisponda strettamente al mezzo di perfusione. NOTA: Il volume finale del mezzo che perfonde il cuore durante le iniezioni iperpolarizzate con 14 mM iperpolarizzati [1-13C] piruvato è 26 ml. La composizione finale del mezzo iniettato (dopo miscelazione) contiene 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 70 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 1,2 mM KH 2 PO4, 10 mM glucosio, 1,2 mM CaCl2e 72 U/L di insulina.</li>
	<li>Somministrare il mezzo iperpolarizzato [1-13C]contenente piruvato al cuore isolato utilizzando una configurazione a flusso continuo29. NOTA: Questo viene fatto per garantire che la perfusione cardiaca non sia disturbata in nessun momento durante l'esperimento e che il mezzo iperpolarizzato venga somministrato ad una velocità nota e per una durata nota.</li>
</ol>7. Spettroscopia iperpolarizzata 13C
<ol><li>Acquisire dati iperpolarizzati 13C utilizzando impulsi di eccitazione saturante selettivi del prodotto 15 applicando impulsi sinusoidali cardinali (Sinc) da 2,5 ms, come descritto in precedenza15,16. Eccitare selettivamente [1-13 C]lattato e [13C]bicarbonato consecutivamente ad intervalli di 6 s per ottenere un intervallo di 12s per ciascun metabolita.</li>
	<li>Per il rilevamento di [1-13 C]lattato, centrare l'impulso selettivo di Sinc alla frequenza [1-13 C]piruvato idrato (179,4 ppm), che si traduce in un rapporto di intensità del segnale (lac) di 0,113 per i segnali C 1 di [1-13 C]piruvato a [1-13C]lattato.</li>
	<li>Per il rilevamento di [13 C]bicarbonato, centrare l'impulso selettivo Sinc a 157,7 ppm, che è 214 Hz down-field del segnale [13C]bicarbonato (161,1 ppm); ciò si traduce in un rapporto di intensità del segnale (bic) di 0,139 per il segnale C 1 di [1-13C]piruvato a [13C]bicarbonato.</li>
</ol>8. Determinazione del peso e del volume umido del tessuto
<ol><li>Alla fine dell'esperimento, staccare il cuore dal sistema di perfusione e asciugarlo delicatamente con carta velina. Successivamente, pesare il cuore per ottenere il peso umido del tessuto.</li>
	<li>Determinare il volume del cuore utilizzando un fattore di densità di 1,05 g/cm3, come determinato in precedenza per il cuore di topo30.</li>
</ol>9. Quantificazione del contenuto di ATP
<ol><li>Integrare il segnale γ-ATP di una singola acquisizione del campione standard ATP e un'acquisizione di 30 minuti (TR di 1,1 s e 1.640 acquisizioni) del cuore isolato.</li>
	<li>Quantificare il contenuto di ATP del cuore confrontando l'integrale del segnale γ-ATP del cuore con quello dello standard (Table of Materials), dove quest'ultimo ha una concentrazione nota (105 mM), e correggere il numero di acquisizioni ed effetti di rilassamento.</li>
</ol>10. Risolvere il segnale Pi del cuore
NOTA: Per valutare il pH tissutale, è necessario prima deconvolgere il segnale Pi del cuore da quello del segnale Pi totale (Pit). Questo viene fatto omettendo il segnale del KHB Pi (PiKH) da quello del Pit.
<ol><li>In uno spettro 31P di KHB che mostra un singolo segnale Pi (Pi KH, Figura 1A), adattare il segnale PiKH a una funzione lorentziana usando Excel (Table of Materials).</li>
	<li>Il volume visibile alla sonda NMR (Vp, 1,375 ml), contiene più KHB quando la provetta non contiene il cuore. Per correggere questo effetto di riempimento, calcolare il segnale tampone attenuato (Pib) utilizzando Eq. 1A. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq01.jpg" style="margin: auto;">Eq. 1A dove Vh è il volume del cuore, come determinato al punto 8.</li>
	<li>Sottrarre questo segnale dal Pit secondo Eq. 1B per ottenere il segnale Pi derivante esclusivamente dal cuore perfuso (Pih, Figura 1B). <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq02.jpg" style="margin: auto;">Eq. 1B</li>
</ol>11. Analisi multiparametrica del pH
<ol><li>Eseguire la conversione della distribuzione dello spostamento chimico del segnale Pih al pH con riferimento allo spostamento chimico di PCr utilizzando Eq. 231. <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq03.jpg" style="margin: auto;">Eq. 2 dove Δδ è la differenza di spostamento chimico, pKa è 6,72, δ base libera è 5,69 e δ acido libero è 3,27, come descritto in precedenza31.</li>
	<li>Correggere la curva di distribuzione del pH risultante per la non linearità tra la scala di spostamento chimico di Pih e la scala di pH secondo Lutz et al.32. Una distribuzione tipica del pH risultante da questo calcolo è presentata nella Figura 1C.</li>
	<li>Analizzare la distribuzione del pH tissutale con un approccio multiparametrico utilizzando sette parametri statistici seguendo il lavoro di Lutz et al. 32. Quattro di questi parametri sono qui presentati in quanto sembrano essere i più descrittivi del pH tissutale: 1) pH massimo globale; 2) pH medio ponderato; 3) pH mediano ponderato; e 4) asimmetria del grafico del pH (Figura 1C).</li>
</ol>12. Calcolo delle attività LDH e PDH
NOTA: I tassi di produzione dei metaboliti iperpolarizzati [1-13 C]lattato e [13C]bicarbonato sono utilizzati per calcolare le attività LDH e PDH, rispettivamente. Nell'approccio di saturazione-eccitazione selettiva del prodotto15, solo i metaboliti iperpolarizzati appena sintetizzati vengono rilevati da ciascuna eccitazione selettiva.
<ol><li>Utilizzare il segnale iperpolarizzato [1-13C]piruvato come riferimento per determinare il corrispondente livello di produzione di metaboliti.<ol><li>Durante la perfusione con il mezzo iperpolarizzato, la concentrazione di [1-13 C]piruvato nel tubo NMR aumenta (wash-in), quindi si stabilizza (ad una concentrazione massima di 14mM) e quindi diminuisce (wash-out).</li>
		<li>Per identificare i punti temporali in cui la concentrazione di piruvato ha raggiunto un livello costante (plateau), correggere il segnale [1-13C]piruvato per il decadimento del segnale risultante dal rilassamento di T1 e dalla pulsazione RF utilizzando la costante di rilassamento effettiva, Teff.</li>
		<li>Per ogni iniezione, definire il Teff in base alla sua capacità di correggere la curva di decadimento del piruvato [1-13C] per mostrare questa dinamica del flusso (Eq.3). <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq04.jpg" style="margin: auto;">Eq. 3 dove <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq05.jpg" style="margin: auto;"> è il segnale [1-13 C]piruvato che è stato acquisito durante l'acquisizione di [13C]bicarbonato. Il Teff medio negli esperimenti qui descritti è risultato essere 35,8 s ± 2,3 s (n = 5 cuori).</li>
		<li>Selezionare i punti dati in cui la concentrazione è entro il 10% del segnale massimo corretto [1-13C]piruvato per ulteriori analisi.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare i dati corrispondenti della produzione di [1-13 C]lattato e [13C]bicarbonato per i punti temporali selezionati nella fase 12.1per il calcolo dei tassi di produzione dei metaboliti utilizzando Eq. 4A ed Eq. 4B, a condizione che l'SNR del segnale metabolita sia maggiore di 2 (soglia per l'analisi). Un tipico esempio di tale selezione di punti temporali è mostrato nella Figura 2B (finestra temporale evidenziata).</li>
	<li>Calcola i tassi di produzione di ciascuno dei punti dati selezionati utilizzando Eq. 4A ed Eq. 4B: <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq17.jpg" style="margin: auto;">Eq. 4A <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq06.jpg" style="margin: auto;">Eq. 4B dove <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq07.jpg" style="margin: auto;"> e sono i tassi di produzione di [1-13 C]lattato o [13 C]bicarbonato in ciascun punto temporale, rispettivamente. <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq09.jpg" style="margin: auto;"> e sono fattori che rappresentano rispettivamente l'eccitazione relativa di [1-13 C]piruvato e <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq10.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq08.jpg" style="margin: auto;"> dei prodotti [1-13 C]lattato o [13C]bicarbonato. Questi fattori sono stati determinati in precedenza per essere 0,113 e 0,139, rispettivamente29. Vp è il volume rilevato dalla sonda NMR (1,375 ml), TR indica l'intervallo di tempo tra due eccitazioni consecutive di saturazione selettiva del prodotto (12 s per ciascun prodotto), <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq11.jpg" style="margin: auto;"> e sono i segnali di [1-13 C]lattato e [13 C]bicarbonato, rispettivamente, e e sono i segnali di [1-13C]piruvato che sono stati acquisiti durante il [1-13 C]lattato e <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq12.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq13.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/63188/63188eq14.jpg" style="margin: auto;"> [13 C]eccitazioni di bicarbonato, rispettivamente. [Pyr] è la concentrazione di [1-13 C]piruvato, che era di 14mM durante la fase di plateau.<ol><li>Determinare la velocità per ciascun punto e quindi la media per iniezione iperpolarizzata.</li>
	</ol></li>
</ol>

Non ci sono divulgazioni.

Dimostriamo una configurazione sperimentale progettata per studiare il metabolismo iperpolarizzato [1-13C] del piruvato, l'energetica dei tessuti e il pH in un modello di cuore di topo isolato.
I passaggi critici all'interno del protocollo sono i seguenti: 1) garantire che il pH del tampone sia 7,4; 2) garantire che tutti i componenti del buffer siano inclusi; 3) evitare la coagulazione del sangue nei vasi cardiaci mediante iniezioni di eparina; 4) evitare il danno ischemico al cuor...

Le alterazioni del metabolismo cardiaco sono associate a una varietà di cardiomiopatie e spesso costituiscono la base dei meccanismi fisiopatologici sottostanti1. Tuttavia, ci sono numerosi ostacoli allo studio del metabolismo nei tessuti viventi, poiché la maggior parte dei saggi biochimici richiede l'omogeneizzazione del tessuto e la lisi cellulare e / o il tracciamento radioattivo. Pertanto, vi è una pressante necessità di nuovi strumenti per studiare il metabolismo miocardico nei tessuti viventi. La risonanza magnetica (MR) dei substrati iperpolarizzati marcati con 13C consente misurazioni in tempo reale del metabolismo nei tessuti viventi2, senza l'uso di radiazioni ionizzanti, aumentando il rapporto segnale-rumore MR (SNR) dei siti marcati di diversi ordini di grandezza3. Qui, descriviamo una configurazione sperimentale, un approccio di acquisizione e un approccio analitico per studiare il metabolismo rapido nel cuore di topo isolato e, in parallelo, presentare indicatori di energetica generale del tessuto e acidità. Il pH cardiaco è un indicatore prezioso, poiché l'equilibrio acido-base viene interrotto nelle prime fasi di malattie cardiache e condizioni come ischemia miocardica, ipertrofia disadattiva e insufficienza cardiaca6.
La produzione iperpolarizzata di [1-13 C]lattato e [13 C]bicarbonato da [1-13C]piruvato iperpolarizzato aiuta a determinare i tassi di produzione di lattato deidrogenasi (LDH) e piruvato deidrogenasi (PDH). La maggior parte degli studi precedenti condotti utilizzando substrati iperpolarizzati nel cuore isolato del roditore ha utilizzato modelli cinetici complessi per derivare l'attività enzimatica di LDH e PDH, o ha riportato i rapporti di intensità del segnale del prodotto iperpolarizzato su un substrato senza calcolare i tassi effettivi di attività enzimatica 2,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14. Qui, abbiamo utilizzato l'approccio di saturazione-eccitazione selettiva del prodotto 15, che consente il monitoraggio dell'attività enzimatica in modo privo di modelli15,16. In questo modo sono stati determinati i tassi enzimatici assoluti (cioè il numero di moli di prodotto prodotte per unità di tempo). 31 La spettroscopia P è stata utilizzata per osservare i segnali di fosfato inorganico (Pi), fosfocreatina (PCr) e adenosina trifosfato (ATP). Un'analisi multiparametrica è stata utilizzata per caratterizzare la distribuzione del pH del cuore, come dimostrato dallo spostamento chimico eterogeneo nel segnale Pi del tessuto.
Il cuore di topo perfuso retrogradamente (Langendorff heart)17,18,19 è un modello ex vivo per il cuore pulsante intatto. In questo modello, la vitalità cardiaca e il pH sono conservati per almeno 80 minuti20 e ha mostrato un potenziale di recupero dopo una lesione ischemica prolungata21,22. Tuttavia, la variabilità involontaria durante la microchirurgia può portare a variabilità nella vitalità del tessuto attraverso i cuori. Studi precedenti hanno riportato il deterioramento di questo cuore nel tempo19; Ad esempio, è stata osservata una riduzione della funzione contrattile del 5% -10% all'ora18. Il segnale dell'adenosina trifosfato (ATP) ha precedentemente dimostrato di riferire sullo stato energetico miocardico e sulla vitalità23. Qui, abbiamo notato che il cuore perfuso può occasionalmente mostrare una variabilità involontaria nei livelli di vitalità, come dimostrato dal contenuto di ATP, nonostante il fatto che abbiamo avuto una perfusione ininterrotta e un apporto di ossigeno. Dimostriamo qui che normalizzare i tassi di LDH e PDH al contenuto di ATP del cuore riduce la variabilità inter-cardiaca in questi tassi.
Nel seguente protocollo, descriviamo la procedura chirurgica utilizzata per l'incannulamento cardiaco, l'isolamento e la conseguente perfusione nello spettrometro NMR. Da notare, altri approcci chirurgici volti a isolare e perfondere il cuore di topo sono stati descritti prima di24,25.
Vengono descritte anche le metodologie utilizzate per l'acquisizione dei dati relativi ai tassi enzimatici nel cuore pulsante (utilizzando la spettroscopia 13 C e iperpolarizzato [1-13C]piruvato) e la vitalità e l'acidità del cuore (utilizzando la spettroscopia NMR 31P). Infine, vengono spiegate le metodologie analitiche per determinare le attività enzimatiche metaboliche e la vitalità e l'acidità dei tessuti.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HyperSense DNP Polarizzatore</td><td>Oxford Instruments</td><td>52-ZNP91000</td><td>HyperSense, 3,35 T, spettrometro NMR iperpolarizzatore DNP-dissoluzione preclinica</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>RS2D</td><td></td><td>NMR Cube, 5,8 T, dotato di una sonda a banda larga da 10 mm</td></tr><tr><td>Pompa peristaltica.</td><td>Cole-Parmer</td><td>07554-95</td><td></td></tr><tr><td>Sonda di temperatura</td> Sonda <td>di temperatura compatibile</td><td>Osensa</td><td>FTX-100-LUX+</td>NMR</tr><tr><td>Sistema di anestesia a basso flusso Somnosuite</td><td>Kent Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lines, tubi, sutura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi in silicone polimerizzato al platino</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-96119-16</td><td>L/S 16 D.I. 3,1 mm& nbsp;</td></tr><tr><td>Linee sottili di polietere etere chetone (PEEK)</td><td>Upchurch Scientific</td><td></td><td>id. 0.040"</td></tr><tr><td>Catetere endovenoso</td><td>BD Medical</td><td>381323</td><td>22 G</td></tr><tr><td>Sutura in seta</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td>Diametro del filo di 3-0</td></tr><tr><td>Chemicals and pharmaceuticals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>[1-13C]acido piruvico</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>CLM-8077-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21074</td><td>CAS: 10043-52-4</td></tr><tr><td>D-(+)-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>CAS: 50-99-77</td></tr><tr><td>Eparina sodica</td><td>Rotexmedica</td><td>HEP5A0130C0160</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico 37%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td>CAS: 7647-01-0</td></tr><tr><td>Insulina aspart (NovoLog)</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>isoflurano</td><td>Terrel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>solfato</td> <td>di magnesioSigma-Aldrich</td><td>793612</td><td>CAS: 7487-88-9</td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4504</td><td>CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>CAS: 7778-77-0</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Gadot Gruppo</td><td></td><td>CAS: 144-55-8</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>CAS: 7647-14-5</td></tr><tr><td>Sodio idrossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>655104</td><td>CAS: 1310-73-2</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>CAS: 7558-79-4</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico diidrato</td><td>Merck</td><td>6345</td><td>CAS: 13472-35-0</td></tr><tr><td>TRIS (grado biotecnologico)</td><td>Amresco</td><td>0826</td><td>CAS: 77-86-1</td></tr><tr><td>Radicale tritile OX063</td><td>GE Healthcare AS</td><td>NC100136</td><td>OX063</td></tr><tr><td>Standard NMR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>13C campione standard</td><td>Cambridge Isotope Laboratories</td><td>DLM-72A</td><td>40% p-diossano in benzene-D6</td></tr><tr><td>31P</td><td>Prodotto in casa</td><td></td><td>105 mM ATP e 120 mM di acido fenilfosfonico in D2O</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel 2016</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MNova</td><td>Mestrelab Research</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 c] e spettroscopia nmr 13c / 31p

Investigating Cardiac Metabolism in the Isolated Perfused Mouse Heart with Hyperpolarized [1-13C]Pyruvate and 13C/31P NMR Spectroscopy

Il metabolismo è alla base di importanti processi nella vita cellulare. Caratterizzare il funzionamento delle reti metaboliche nei tessuti viventi fornisce informazioni cruciali per comprendere il meccanismo delle malattie e progettare trattamenti. In questo lavoro, descriviamo procedure e metodologie per studiare l'attività metabolica in cellula in un cuore di topo perfuso retrogradamente in tempo reale. Il cuore è stato isolato in situ, in concomitanza con l'arresto cardiaco per ridurre al minimo l'ischemia miocardica ed è stato perfuso all'interno di uno spettrometro di risonanza magnetica nucleare (NMR). Mentre nello spettrometro e sotto perfusione continua, il [1-13 C]piruvato iperpolarizzato è stato somministrato al cuore, e i successivi tassi di produzione iperpolarizzati [1-13 C]lattato e [13C] bicarbonato sono serviti a determinare, in tempo reale, i tassi di produzione di lattato deidrogenasi e piruvato deidrogenasi. Questa attività metabolica del [1-13C]piruvato iperpolarizzato è stata quantificata con spettroscopia NMR in un modello libero utilizzando l'approccio di acquisizione selettiva di saturazione-eccitazione del prodotto. 31 La spettroscopia P è stata applicata tra le acquisizioni iperpolarizzate per monitorare l'energetica cardiaca e il pH. Questo sistema è utile in modo univoco per studiare l'attività metabolica nel cuore di topo sano e malato.

Gli spettri 31P registrati da un cuore di topo perfuso con KHB e dal solo tampone sono mostrati nella Figura 1A. I segnali di α-, β- e γ-ATP, PCr e Pi sono stati osservati nel cuore. Il segnale Pi era composto da due componenti principali: nel campo superiore (lato sinistro del segnale), il segnale Pi era principalmente dovuto al KHB ad un pH di 7,4; nel campo inferiore (lato destro del segnale), il segnale Pi era più ampio e meno omogeneo a causa dell'ambiente più acido. Quest'ul...

Descriviamo una configurazione sperimentale per la somministrazione di metaboliti iperpolarizzati marcati con 13C in modalità di perfusione continua a un cuore di topo perfuso isolato. Un approccio di acquisizione dedicato a 13C-NMR ha permesso la quantificazione dell'attività enzimatica metabolica in tempo reale e un'analisi multiparametrica 31P-NMR ha permesso la determinazione del contenuto di ATP tissutale e del pH.

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e spettroscopia NMR 13C / 31P

Metabolism is the basis of important processes in cellular life. Characterizing how metabolic networks function in living tissues provides crucial ...

Hi.In questo video imparerai come eseguire studi di risonanza magnetica iperpolarizzata del cuore di topo perfuso. David Shaul, uno studente MD / PhD in laboratorio, ti guiderà attraverso le varie tecniche e procedure. Oggi apprendiamo un protocollo per lo studio del metabolismo iperpolarizzato del carbonio-13 piruvato, combinato con la spettroscopia NMR 31P.Il metabolismo del piruvato si trova al crocevia del metabolismo aerobico e anaerobico. E come tale, è di grande valore per studiare varie condizioni del cuore. Quindi, iniziamo.Il cuore del topo è isolato e perfuso con tampone Krebs-Hensleit, all'interno di un tubo NMR da 10 millimetri. Il cuore viene quindi inserito nello spettrometro NMR. Lì, viene registrato uno spettro 31P per osservare l'energetica cardiaca e il pH, osservando le risonanze di adenosina trifosfato, fosfocreatina e fosfato inorganico.Nel frattempo, un campione di piruvato etichettato con carbonio-13 in prima posizione è iperpolarizzato. E dopo che si verifica la dissoluzione, viene iniettato al cuore per consentire la misurazione di lattato, inorganici e piruvato le attività organizzate in tempo reale. Un giorno prima dell'esperimento, preparare 400 millili

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Langendorff-mode perfusione cuore isolato, in collaborazione...

Valutazione della funzione cardiaca e Energetica nel Cuori mouse isolato mediante 31 P spettroscopia NMR

L'obiettivo è quello di monitorare lo stato redox mitocondriale di cuori isolati nel contesto del precarico e le pressioni fisiologica postcarico. Un modello di lavoro biventricolare cuore di coniglio viene presentato. Fluorescenza ad alta risoluzione spaziotemporale immagini di NADH viene utilizzato per monitorare lo stato mitocondriale redox del tessuto epicardico.

NADH Imaging di fluorescenza biventricolare isolato lavoro Hearts Coniglio

Un fantoccio dinamico multi-compartimento viene utilizzato per simulare alcune biologie di interesse per studi metabolici utilizzando agenti di risonanza magnetica iperpolarizzata.

L&#39;uso di un multi-comparto dinamico singolo enzima Phantom per gli Studi di hyperpolarized Risonanza Magnetica Agents

Il seguente protocollo descrive la preparazione e l'utilizzo di tamponi per la misurazione quantitativa dei tassi di ossidazione del glucosio e degli acidi grassi nel cuore di ratto funzionante isolato. Vengono inoltre discussi i metodi utilizzati per l'analisi dei campioni e l'interpretazione dei dati.

Metodi per la determinazione dei tassi di glucosio e acidi grassi ossidazione nel cuore isolato di lavoro Rat

La polarizzazione nucleare dinamica con successiva dissoluzione del campione ha permesso studi in tempo reale del metabolismo nei sistemi biologici. Il [1-13C]piruvato iperpolarizzato è stato utilizzato per studiare l'attività della lattato deidrogenasi in una linea cellulare di carcinoma prostatico in vitro.

hyperpolarized 13 C metabolica spettroscopia di risonanza magnetica e Imaging

Qui introduciamo un metodo per utilizzare un catetere ottico intra-ventrico nei cuori perfusi per eseguire la spettroscopia di assorbimento attraverso la parete cardiaca. I dati ottenuti forniscono informazioni solide sulla tensione dell'ossigeno tissutale, nonché sull'utilizzo del substrato e sul potenziale della membrana contemporaneamente con misure di prestazione cardiaca in questa onnipresente preparazione.

Catetere leggero intra-cardiaco per il monitoraggio del metabolismo cellulare utilizzando la spettroscopia transmurale di riambente di cuori mammiferi perfusi

Vi presentiamo un protocollo per misurare la dipendenza del campo magnetico del tempo di rilassamento spin-reticolo di 13composti arricchiti con C, iperpolarizzati per mezzo di polarizzazione nucleare dinamica, utilizzando una rilassantesi veloce ciclabile. In particolare, lo abbiamo dimostrato con [1-13C]pyruvate, ma il protocollo potrebbe essere esteso ad altri substrati iperpolarizzati.

Misurazione della dipendenza da campo magnetico di rilassamento Spin-Lattice di iperpolarizzato [1-13C]pyruvate

Questo protocollo integra un sistema di bioreattore personalizzato con spettroscopia NMR iperpolarizzata ¹³C per misurare il metabolismo del piruvato in tempo reale nelle cellule vive, migliorando la riproducibilità e l'accuratezza cinetica per studi metabolici e applicazioni di screening farmacologico.

Rilevamento metabolico in tempo reale in cellule viventi mediante NMR iperpolarizzata a 13C

Questo articolo descrive una tecnica ad alta risoluzione temporale e spaziale a otticamente movimento immagine del potenziale d'azione sulla superficie del Langendorff-cuore perfuso di ratto utilizzando un colorante potenziometrica (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Il protocollo seguente delinea il processo di isolamento, ventilazione e strumentazione polmoni del mouse su misura stabile o pulsatile vascolare polmonare di pressione del flusso di relazioni al fine di quantificare gli effetti del flusso sanguigno, flusso d'aria, i cambiamenti delle vie aeree e sui cambiamenti vascolari post-carico del ventricolo destro.

Caratterizzazione del isolata, ventilata e polmone mouse Instrumented perfusi con flusso pulsatile

Scopri come studiare il metabolismo cardiaco in cuori di topo perfusi isolati usando piruvato iperpolarizzato [1-13C] e spettroscopia NMR 13C/31P. Questo metodo permette di quantificare in tempo reale i flussi metabolici e l'energetica cardiaca.

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato 1-13 C e spettroscopia NMR 13C / 31P (Video) | JoVE Journal

Studio del metabolismo cardiaco nel cuore di topo perfuso isolato con piruvato iperpolarizzato [1-13 C] e ^{spettroscopia NMR 13}C / ³¹P

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