Name: Produzione efficiente e scalabile di varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule di mammifero utilizzando un sistema di espressione transitoria (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-10T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Scopri un protocollo scalabile per produrre varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule HEK293 con elevata purezza. Questo metodo supporta la ricerca sulla malattia di Huntington.

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Ringraziamo il Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, The State University of New York a Buffalo, per aver eseguito l'analisi MS di HTT. Questo lavoro è stato uno sforzo collaborativo con la Fondazione CHDI. Ringraziamo in particolare Elizabeth M. Doherty; Ignacio Munoz-Sanjuan; Douglas Macdonald, Fondazione CHDI; e Rory Curtis, Curia, per il loro prezioso contributo durante la preparazione di questo manoscritto. Siamo anche grati a Michele Luche, Mithra Mahmoudi e Stephanie Fox per il loro sostegno a questo sforzo di ricerca.

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<li>MacDonald, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington%27s+disease+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li>
<li>Nasir, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+disruption+of+the+Huntington%27s+disease+gene+results+in+embryonic+lethality+and+behavioral+and+morphological+changes+in+heterozygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted disruption of the Huntington's disease gene results in embryonic lethality and behavioral and morphological changes in heterozygotes.</a> Cell. 81 (5), 811-823 (1995).</li>
<li>Dragatsis, I., Levine, M. S., Zeitlin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Hdh+in+the+brain+and+testis+results+in+progressive+neurodegeneration+and+sterility+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Hdh in the brain and testis results in progressive neurodegeneration and sterility in mice.</a> Nature Genetics. 26 (3), 300-306 (2000).</li>
<li>Anne, S. L., Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+huntingtin+by+cyclin-dependent+kinase+5+is+induced+by+DNA+damage+and+regulates+wild-type+and+mutant+huntingtin+toxicity+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage and regulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons.</a> Journal of Neuroscience. 27 (27), 7318-7328 (2007).</li>
<li>Dietrich, P., Johnson, I. M., Alli, S., Dragatsis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elimination+of+huntingtin+in+the+adult+mouse+leads+to+progressive+behavioral+deficits%2C+bilateral+thalamic+calcification%2C+and+altered+brain+iron+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Elimination of huntingtin in the adult mouse leads to progressive behavioral deficits, bilateral thalamic calcification, and altered brain iron homeostasis.</a> PLoS Genetics. 13 (7), 1006846(2017).</li>
<li>Dragatsis, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+early+embryonic+deletion+of+huntingtin+from+pyramidal+neurons+on+the+development+and+long-term+survival+of+neurons+in+cerebral+cortex+and+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Effect of early embryonic deletion of huntingtin from pyramidal neurons on the development and long-term survival of neurons in cerebral cortex and striatum.</a> Neurobiology of Disease. 111, 102-117 (2018).</li>
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<li>DiFiglia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+huntingtin+in+neuronal+intranuclear+inclusions+and+dystrophic+neurites+in+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Gutekunst, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+and+neuropil+aggregates+in+Huntington%27s+disease%3A+Relationship+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nuclear and neuropil aggregates in Huntington's disease: Relationship to neuropathology.</a> Journal of Neuroscience. 19 (7), 2522-2534 (1999).</li>
<li>Hodgson, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+YAC+mouse+model+for+Huntington%27s+disease+with+full-length+mutant+huntingtin%2C+cytoplasmic+toxicity%2C+and+selective+striatal+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A YAC mouse model for Huntington's disease with full-length mutant huntingtin, cytoplasmic toxicity, and selective striatal neurodegeneration.</a> Neuron. 23 (1), 181-192 (1999).</li>
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<li>Kim, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+conformation+of+polyglutamine+track+revealed+by+a+crystal+structure+of+huntingtin+N-terminal+region+with+insertion+of+three+histidine+residues%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Beta conformation of polyglutamine track revealed by a crystal structure of huntingtin N-terminal region with insertion of three histidine residues.</a> Prion. 7 (3), 221-228 (2013).</li>
<li>Hoop, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+exon+1+fibrils+feature+an+interdigitated+%CE%B2-hairpin-based+polyglutamine+core%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Huntingtin exon 1 fibrils feature an interdigitated β-hairpin-based polyglutamine core.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (6), 1546-1551 (2016).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intein-based+strategy+for+the+production+of+tag-free+huntingtin+exon+1+proteins+enables+new+insights+into+the+polyglutamine+dependence+of+Httex1+aggregation+and+fibril+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An intein-based strategy for the production of tag-free huntingtin exon 1 proteins enables new insights into the polyglutamine dependence of Httex1 aggregation and fibril formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Seong, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+facilitates+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin facilitates polycomb repressive complex 2.</a> Human Molecular Genetics. 19 (4), 573-583 (2009).</li>
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<li>Harding, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HAP40+orchestrates+huntingtin+structure+for+1+differential+interaction+with+polyglutamine+2+expanded+exon+1%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">HAP40 orchestrates huntingtin structure for 1 differential interaction with polyglutamine 2 expanded exon 1.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Huang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathological+polyQ+expansion+does+not+alter+the+conformation+of+the+Huntingtin-HAP40+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Pathological polyQ expansion does not alter the conformation of the Huntingtin-HAP40 complex.</a> Structure. 29 (8), 804-809 (2021).</li>
<li>Colin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+phosphorylation+acts+as+a+molecular+switch+for+anterograde%2Fretrograde+transport+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin phosphorylation acts as a molecular switch for anterograde/retrograde transport in neurons.</a> EMBO Journal. 27 (15), 2124-2134 (2008).</li>
<li>Thompson, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IKK+phosphorylates+Huntingtin+and+targets+it+for+degradation+by+the+proteasome+and+lysosome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome.</a> Journal of Cell Biology. 187 (7), 1083-1099 (2009).</li>
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<li>Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defined+methodology+for+reliable+quantification+of+western+blot+data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A defined methodology for reliable quantification of western blot data.</a> Molecular Biotechnology. 55 (3), 217-226 (2013).</li>
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<li>McMeekin, T. L., Wilensky, M., Groves, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+indices+of+proteins+in+relation+to+amino+acid+composition+and+specific+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Refractive indices of proteins in relation to amino acid composition and specific volume.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 7 (2), 151-156 (1962).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse con i contenuti di questo articolo.

Descriviamo qui un metodo di trasfezione, espressione e purificazione transitoria per generare più costrutti proteici FL HTT con purezza e omogeneità adeguate per l'uso come standard per lo sviluppo di saggi immunologici e MS, controlli per l'analisi western blot e per studi struttura-funzione. Questo metodo di espressione transitoria è scalabile e versatile e consente all'utente di generare quantità di basso milligrammo di varianti FL HTT in modo più efficiente rispetto all'utilizzo di linee cellulari stabili o metodi basati su virus descritti in precedenza21,22,23,24. Di routine, 2-5 mg di FL HTT altamente purificato possono essere generati da una produzione di proteine su scala 2 L in meno di una settimana utilizzando il metodo di espressione transitoria una volta costruito il plasmide, con una resa tipica di 1-2,5 mg di FL HTT per litro di coltura cellulare.
Il metodo di espressione transitoria qui descritto supera molti ostacoli nell'espressione stabile delle linee cellulari, come il lungo tempo necessario per stabilire linee cellulari e le difficoltà nello stoccaggio e nel mantenimento di linee cellulari stabili. Il PEI è anche relativamente economico rispetto ad altri reagenti di trasfezione sul mercato, rendendo economicamente sostenibile la trasfezione su larga scala. Ci sono anche limitazioni nel protocollo: l'efficienza della trasfezione dipende in gran parte dalla qualità dei plasmidi, dalla crescita ottimale delle cellule e dal modo in cui il PEI viene conservato e preparato. Gli operatori devono prestare particolare attenzione ed eseguire controlli di qualità in questi passaggi critici per evitare un drastico calo delle rese proteiche. Anche la resina Anti-FLAG utilizzata nel protocollo è relativamente costosa e mostra una ridotta cattura di FL HTT dopo diverse purificazioni e rigenerazioni. Alcuni ricercatori potrebbero trovare più pratico passare a un tag diverso per consentire una rigenerazione più robusta della resina di affinità.
Sono state testate varie linee cellulari e condizioni di espressione per ottimizzare i livelli di espressione di FL HTT. Le cellule HEK293 sono state scelte per l'espressione di FL HTT a causa dell'elevata espressione delle proteine e della facilità di manipolazione in un formato di coltura in sospensione, rendendo il metodo adatto per l'espressione su larga scala in agitatori o bioreattori. Un livello di espressione proteica FL HTT più elevato può essere raggiunto a temperature di coltura più basse come 32 °C piuttosto che utilizzare la temperatura abituale di 37 °C. È possibile che la temperatura più bassa possa rallentare la sintesi proteica e promuovere il corretto ripiegamento di FL HTT40. Tuttavia, questo fenomeno non è specifico per FL HTT o le linee cellulari testate. La ridotta temperatura post-trasfezione è stata ampiamente utilizzata nell'espressione proteica farmaceutica nelle cellule CHO. Sebbene il meccanismo non sia completamente compreso, si pensa che le basse temperature arrestino il ciclo cellulare nella fase G1 e deviino l'energia cellulare verso la produzione di proteine41.
HTT a lunghezza intera purificato da cellule di mammifero co-eluisce con lo chaperone Hsp7024 e le fasi di lavaggio Mg-ATP possono rimuovere la proteina Hsp70. È interessante notare che Hsp70 co-eluito non è osservato in FL HTT purificato da un sistema di espressione cellulare di insetti21,22,23. Ciò può riflettere una differenza nei PTM di FL HTT o nelle risposte delle proteine da shock termico alla sovraespressione di FL HTT nelle cellule di mammifero e di insetti. Una volta che la proteina ricombinante è stata spogliata di Hsp70, sono necessari detergenti non ionici come CHAPS o DDM per stabilizzare la forma monomerica di FL HTT.
Gli stati di oligomerizzazione delle varianti FL HTT sono stati analizzati utilizzando Blue Native PAGE e SEC-MALS. Una piccola frazione di HTT dimerico e oligomerico di ordine superiore era presente quando analizzata da Blue Native PAGE o SEC-MALS. Da notare che gli oligomeri di ordine superiore formati da FL HTT non sembrano essere correlati con la lunghezza del polyQ, e anche il mutante di delezione Exon1 mostra un rapporto oligomero-dimero-monomero simile. Le variazioni effettive nel contenuto di oligomeri tra questi costrutti sono probabilmente dovute a piccole differenze nella produzione e nella gestione di ciascun lotto. In contrasto con gli aggregati e le fibrille formati da HTT Exon140,41, gli oligomeri di ordine superiore di FL HTT sono rimasti solubili e hanno potuto essere analizzati da SEC e Native PAGE.
La FL HTT monomerica purificata è solo relativamente stabile. La conservazione prolungata a 4 °C, brevi incubazioni a temperatura ambiente o concentrazioni > 1 mg/ml convertiranno tutti la FL HTT monomerica in forme dimeriche e oligomeriche di ordine superiore, anche se non vi è alcuna precipitazione visibile osservata in tali condizioni. FL HTT monomerico purificato mantenuto a ≤1 mg/mL è rimasto relativamente stabile a -80 °C nel tampone di stoccaggio (50 mM Tris, pH 8,0, 500 mM NaCl, 5% v/v glicerolo, 0,5% p/v CHAPS e 5 mM DTT) come descritto in precedenza24. Fino a 6 cicli di congelamento-scongelamento di FL HTT preparati e conservati in questo modo non hanno causato precipitazioni visibili della proteina, sebbene un leggero spostamento verso uno stato oligomerico superiore sia stato osservato da SEC-MALS (Figura supplementare S2). I campioni sono stati analizzati anche da SDS PAGE dopo ripetuti cicli di congelamento-disgelo. Non sono stati osservati precipitati visibili; nessun aggregato o prodotto di degradazione aggiuntivo è stato visto da SDS-PAGE (Figura supplementare S3). La stabilità a lungo termine della FL HTT purificata è ancora oggetto di studio. In assenza di dati conclusivi a lungo termine, si consiglia di conservare FL HTT purificato a -80 °C per non più di 6 mesi.
Le varianti della proteina FL HTT ricombinante di alta qualità e i metodi per produrle sono molto richiesti dalla comunità di ricerca sulla MH. Queste proteine sono in uso come test immunologici e standard analitici per la SM, in studi strutturali e per lo sviluppo di nuovi saggi specifici per FL HTT. I metodi di espressione transitoria su larga scala qui descritti hanno costantemente prodotto quantità di milligrammi di varianti FL HTT con purezza del >95%, fornendo strumenti essenziali per gli studi HTT. La produzione di decine di milligrammi di varianti altamente purificate di FL HTT polyQ e di altri mutanti a supporto della ricerca sulla MH è diventata routine.

La malattia di Huntington (HD) è una rara malattia neurodegenerativa caratterizzata principalmente da movimenti motori instabili e involontari, nonché alterazioni cognitive e psichiatriche, come cambiamenti di personalità e apatia 1,2. La MH è associata ad un'espansione del tratto di ripetizione CAG localizzato nell'esone 1 del gene huntingtina (HTT) a più di 35 ripetizioni, con un numero maggiore di ripetizioni CAG correlate ad un esordio precoce della malattia 3,4. Il prodotto traslazionale di HTT, la proteina huntingtina (HTT), è implicato nella vitalità neuronale e nello sviluppo del cervello 5,6,7,8,9.
HTT è una proteina di impalcatura segnalata per partecipare a una vasta gamma di processi cellulari, trasporto di vescicole, divisione cellulare, ciliogenesi e autofagia10,11. Tuttavia, la patogenesi molecolare della MH non è del tutto chiara, e manca l'identificazione di interattori proteici chiave che mediano l'impatto patologico della mHTT espansa con polyQ. Alcune ricerche suggeriscono un guadagno della funzione tossica da mHTT guidato dalla propensione all'oligomerizzazione della proteina HTT espansa, poiché gli aggregati HTT sono stati identificati nei neuroni e nella glia in pazienti MH e modelli animali della malattia 12,13,14,15,16,17 . Per alimentare lo studio della funzione e della struttura delle varianti FL HTT e mHTT e fornire ai ricercatori standard proteici di alta qualità per lo sviluppo del test, è necessario un apporto robusto e scalabile di proteine ricombinanti omogenee.
A causa delle sue dimensioni (aa 1-3.144, numerazione basata sulla lunghezza del poliQ Q23), dell'instabilità proteolitica e della propensione all'aggregazione, FL HTT si è dimostrato difficile da esprimere e isolare come proteina solubile. In precedenza, la regione dell'esone 1 (aa 2-90) di HTT è stata espressa e purificata su larga scala utilizzando vari tag che possono aumentare la solubilità della proteina in Escherichia coli18,19,20. FL HTT è stato prima espresso e purificato in un sistema di espressione di cellule di insetti utilizzando baculovirus 21,22 e sono state riportate strutture di microscopia elettronica (EM) a bassa risoluzione 30 Å di FL Q23-HTT e Q78-HTT chimicamente reticolato23. Lo studio della struttura HTT è stato ulteriormente avanzato quando la produzione di FL Q17, Q46 e Q128-HTT con modificazioni post-traduzionali native (PTM) è stata raggiunta in cellule umane utilizzando linee cellulari stabili o sistemi di espressione di adenovirus24. Questi studi suggeriscono che, sebbene l'HTT purificato esista principalmente allo stato monomerico, tende anche a formare oligomeri e aggregati di alto ordine.
L'ultracentrifugazione analitica di FL Q128-HTT, con una regione polyQ altamente espansa, ha fornito più frazioni oligomeriche e aggregate rispetto alla proteina con la regione polyQ non espansa24. Utilizzando una linea cellulare stabile, una strategia è stata adattata con successo per stabilizzare FL HTT attraverso la co-espressione con il partner di interazione HAP40. Una struttura crio-EM del complesso FL HTT e HAP40 è stata risolta con una risoluzione media di 4 Å utilizzando il complesso proteico purificato (PDB:6EZ8)25. Questa strategia di co-espressione è stata adattata con successo a un sistema di baculovirus e una serie di varianti HTT di alta qualità con diverse lunghezze di polyQ sono state espresse e purificate da cellule di insetti26. Da allora, altre strutture crio-EM del complesso di HTT con lunghezze variabili di polyQ e HAP40 e strutture ad alta risoluzione sono state risolte e depositate nel Protein Data Base27,28 (PDB: 7DXK, 7DXH, 6X9O).
Abbiamo ottimizzato un metodo di trasfezione ed espressione in cellule HEK293, utilizzando polietilenimina (PEI), per una rapida espressione transitoria di FL HTT. Come prova di principio, le varianti FL HTT contenenti 23 glutammine (FL Q23-HTT) sono state prima purificate e caratterizzate utilizzando una modifica di un metodo di purificazione descritto in precedenza24. Questo metodo di trasfezione transitoria è conveniente, altamente efficiente e scalabile; può produrre HTT purificato con rese di 1-2 mg/L, paragonabili al metodo della linea cellulare stabile riportato24. Poiché la proteina è prodotta in una linea cellulare umana, l'HTT prodotto ha maggiori probabilità di avere PTM umani nativi quando sottoposto ad analisi proteomica della spettrometria di massa 11,29,30,31. Sono state prodotte quantità di milligrammi delle varianti FL Q48-HTT, FL Q73-HTT ed exon1-deleted (ΔExon1-HTT) di FL HTT, dimostrando che il metodo di espressione transitoria è particolarmente utile nella produzione rapida di varianti alternative di HTT senza dipendere dallo sforzo dispendioso in termini di tempo richiesto per stabilire linee cellulari stabili per la produzione.
Il seguente protocollo esemplifica il metodo standard utilizzato nel laboratorio di questi autori per la coltura cellulare, la trasfezione, la purificazione delle proteine e la caratterizzazione proteica postpurificazione per produrre FL Q23-HTT da una coltura cellulare da 2 L. Il protocollo può essere scalato fino a colture più grandi o adattato per purificare altre varianti HTT. Fino a 10 colture cellulari L di FL HTT e varie mutazioni del sito o del troncamento di omologhi HTT e HTT sono state eseguite con successo in laboratorio utilizzando lo stesso protocollo. FL HTT purificato contiene un'alta percentuale di monomeri insieme a dimeri e oligomeri di ordine superiore. Lo stesso profilo aggregato è osservato tra le varianti prodotte (Q23, Q48, Q73 e Exon1 cancellato). Poiché l'aggregazione può verificarsi quando non viene presa la dovuta attenzione, è stato condotto uno studio di formulazione e stabilità gelo-scongelamento per identificare le migliori condizioni per la gestione delle proteine. Vengono inoltre descritti metodi quali Blue Native PAGE e SEC/MALS-RI per analizzare il contenuto di oligomeri HTT come parte del processo di controllo qualità. A beneficio della comunità di ricerca sulla MH, i plasmidi e le proteine HTT descritti in questo studio sono anche depositati nel MH Community Repository presso il Coriell Institute (www.coriell.org/1/CHDI).

<table><tbody><tr><td>Concentratore da 100 kDa-Protocollo Amicon</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>Numero di sezione-6.2.4</td></tr><tr><td>20x buffer di esecuzione PAGE nativo blu Numero di</td> sezione <td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td>Protocollo-8.1</td></tr><tr><td>20x TBS</td><td>Thermo Fisher</td><td>PI28358</td><td>Protocol Section Number-5.1</td></tr><tr><td>4x buffer di campionamento PAGE nativo blu Numero di sezione</td><td>Invitrogen</td><td>BN2003</td><td>Protocollo-8.3</td></tr><tr><td>4x tampone di carico LDS</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.3</td></tr><tr><td>Palloni di Erlenmeyer da 5 L</td> Numero di sezione <td>del protocollo Corning</td><td>431685-4.2</td><td></td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel di agarosio</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Numero di sezione del protocollo-2.2</td></tr><tr><td>Agente antiagglomerante</td><td>Thermo Fisher</td><td>0010057AE</td><td>Numero di sezione del protocollo-4.8</td></tr><tr><td>affinità anti-FLAG M2 gel</td><td>Sigma</td><td>A2220</td><td>Numero di sezione del protocollo-6.1.1</td></tr><tr><td>anti-FLAG M2</td><td>Sigma</td><td>F3165</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.7</td></tr><tr><td>Antischiuma-Excell antischiuma</td><td>Sigma</td><td>59920C-1B</td><td>Numero di sezione del protocollo-4.8</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma</td><td>A6419</td><td>Numero di sezione del protocollo-6.1.4.4</td></tr><tr><td>BEH 450 SEC</td><td>Waters</td><td>186006851</td><td>2,5 &micro; m x 4,6 mm x 150 mm Numero di sezione del protocollo-7.3</td></tr><tr><td>blu nativo PAGINA 5% G-250 additivo campione</td><td>Invitrogen</td><td>BN2004</td><td>Numero di sezione del protocollo-8.3</td></tr><tr><td>carbenicillina</td><td>Thermo Fisher</td><td>10177012</td><td>Numero di sezione del protocollo-2.5</td></tr><tr><td>centrifuga - Sorvall Lynx 6000</td><td>Thermo Fisher</td><td>75006590</td><td>Numero di sezione del protocollo-6.1.3</td></tr><tr><td>Contatore di celle - ViCELL</td><td>BECKMAN COULTER</td><td></td><td>Numero di sezione del protocollo-4.3</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Anatrace</td><td>C316S Numero di</td><td>sezione del protocollo-6.1.4.6</td></tr><tr><td>Cellule di E. coli competenti-TOP10</td> Numero di sezione del protocollo <td>Invitrogen</td><td></td> C404010-2.4 <td></td></tr><tr><td>digitonina</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Numero della sezione del protocollo-5.1</td></tr><tr><td>Rivelatore dell'indice di rifrazione differenziale</td> Numero della sezione del protocollo <td>Wyatt-7.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK peptide Genscript</td><td></td><td></td><td>Servizio di sintesi peptidica Numero di sezione del protocollo-6.1.4.6</td></tr><tr>Numero di sezione<td>del protocollo EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-5.1</td><td></td></tr><tr><td>Kit Giga del plasmide EndoFree</td><td>Qiagen</td><td>12391</td><td>Numero di sezione del protocollo-3.3</td></tr><tr><td>Acqua priva di endotossine</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.03</td><td>Numero di sezione del protocollo-4.1</td></tr><tr><td>kit di quantificazione delle endotossine-CRL Sistema di rilevamento Endosafe Nexgen-PTS</td><td>Charles River</td><td>PTS150K</td><td>Protocol Numero di sezione-3.4</td></tr><tr><td>rotore ad angolo fisso Rotore A23-6x100</td><td>Thermo Fisher</td><td>75003006</td><td>Protocol Section Number-6.1.3</td></tr><tr><td>Software FPLC- Unicorn 6.2</td><td>Cytiva</td><td></td><td>Protocol Section Number-6.1.4</td></tr><tr><td>Sintesi genica</td><td>Genscript</td><td></td><td>Servizio di sintesi genica Numero di sezione del protocollo-1.2</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Fisher Scientific Glycerol (ACS certificato)</td><td>G33-4</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.6</td></tr><tr><td>Mezzo di crescita-Mezzo di espressione Expi293</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1435102</td> Numero <td>di sezione del protocollo-4.2</td></tr><tr><td>Celle HEK293</td><td>Thermo Fisher</td><td>R79007</td><td>Numero di sezione del protocollo-4</td></tr><tr><td>ad alto taglio omogeneizzatore-Microfluidizzatore</td><td>MicroFluidics</td><td>LM10</td><td>Numero di sezione del protocollo-6.1.3</td></tr><tr><td>HPLC - 1260 infinity II Bio-Insert HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td>Numero di sezione del protocollo-7.1</td></tr><tr><td>Image Studio</td><td>Software di analisi delle immagini LiCor</td><td></td><td> Numero di sezione del protocollo-5.1</td></tr><tr><td>MAB2166</td><td>Sigma</td><td>MAB2166</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.7</td></tr><tr><td>MAB2168</td><td>Numero</td> di sezione del protocollo EMD <td>MAB2168-5.7</td><td></td></tr><tr><td>MAB3E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47757</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.7</td></tr><tr><td>MAB4E10</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-7757</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.7</td></tr> Numero di <tr>sezione del protocollo<td></td><td>MAB5490 MAB5490 Sigma-5.7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Numero di sezione del</td> protocollo <td>MAB5492 MAB5492 Sigma-5.7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MAB8A4</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-47759</td> Numero di <td>sezione del protocollo-5.7</td></tr><tr><td>Rivelatore di diffusione della luce multi-angolo Numero di sezione</td> del <td>protocollo Wyatt-7.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NativeMark Unstained Protein Standard</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>Numero di sezione del protocollo-8.4</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td>Numero della sezione del protocollo-5.6</td></tr><tr><td>NheI</td><td>New England Biolab</td><td>R0131S</td><td>Versione Hi-Fi disponibile Numero di sezione del protocollo-2.2</td></tr><tr><td>NuPAGE 3&ndash; Gel di acetato di tris all'8%</td><td>Invitrogen</td><td>EA0375PK2</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.4</td></tr><tr><td>NuPAGE Tris-Acetato SDS Tampone di corsa</td><td>Invitrogen</td><td>LA0041</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.4</td></tr><tr><td>PEI 25K</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td>Numero della sezione del protocollo-4.1</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Thermo Fisher 15070063</td><td></td><td>Numero di sezione del protocollo-4.2</td></tr><tr><td>Fosfato Soluzione salina tamponata (PBS)</td><td>Cytiva</td><td>SH30256.02</td><td>Numero di sezione del protocollo-4.5</td></tr><tr><td>kit miniprep del plasmide</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Numero di sezione del protocollo-2.6</td></tr><tr><td>PmeI</td><td>New England Biolab</td><td>R0560S Numero di</td><td>sezione del protocollo-2.2</td></tr><tr><td>gel Bis-tris prefabbricato- 3-12% NativePAGE Novex Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1003BOX</td><td>Numero di sezione del protocollo-8.4</td></tr><tr><td>proteasi cocktail di inibitori</td><td>GoldBio</td><td>GB-331-1</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.1</td></tr><tr><td>Software di analisi SEC-MALS - Astra 7</td><td>Wyatt Technology</td><td></td><td>Numero di sezione del protocollo-7.6</td></tr><tr><td>anticorpo secondario -IRdye 800 CW capra anti-topo IgG</td><td>LiCor</td><td>926-32210</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.9</td></tr><tr><td>Superose 6 pg XK 16/70</td><td>Cytiva</td><td>90100042</td><td>Numero di sezione del protocollo-6.2</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher</td><td>BP152</td><td>Numero di sezione del protocollo-5.6</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Thermo Fisher</td><td>AAJ20605AP</td><td>Numero di sezione del protocollo-6.1.1</td></tr><tr><td>Spettrometro UV - Nanodrop 8000</td><td>Thermo Fisher</td><td>ND-8000-GL</td><td>Numero di sezione del protocollo-2.2</td></tr><tr><td>XK26/100</td><td>Cytiva</td><td>28988951</td><td>Numero di sezione del protocollo-6.1.1</td></tr></tbody></table>

produzione efficiente e scalabile di varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule di mammifero utilizzando un sistema di espressione transitoria

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

L'huntingtina a lunghezza intera (FL HTT) è una proteina di grandi dimensioni (aa 1-3.144), ubiquitariamente espressa, contenente poliglutammina (polyQ) con una massa di circa 350 kDa. Mentre la funzione cellulare della FL HTT non è completamente compresa, un'espansione mutante del tratto polyQ sopra ~36 ripetizioni è associata alla malattia di Huntington (HD), con la lunghezza del polyQ correlata approssimativamente con l'età di esordio. Per comprendere meglio l'effetto della struttura sulla funzione dell'HTT mutante (mHTT), sono necessarie grandi quantità di proteina. La produzione submilligramma di FL HTT nelle cellule di mammifero è stata ottenuta utilizzando l'espressione stabile della linea cellulare inducibile dalla doxiciclina. Tuttavia, la produzione di proteine da linee cellulari stabili ha limitazioni che possono essere superate con metodi di trasfezione transitoria. 
Questo documento presenta un metodo robusto per la produzione di quantità di basso milligrammo di FL HTT e delle sue varianti da plasmidi ottimizzati per codone mediante trasfezione transitoria utilizzando polietilenimina (PEI). Il metodo è scalabile (>10 mg) e produce costantemente 1-2 mg/L di coltura cellulare di FL HTT altamente purificata. Coerentemente con i rapporti precedenti, lo stato della soluzione purificata di FL HTT è risultato altamente dinamico; La proteina ha una propensione a formare dimeri e oligomeri di alto ordine. Una chiave per rallentare la formazione di oligomeri è lavorare rapidamente per isolare le frazioni monomeriche dalle frazioni dimeriche e oligomeriche di alto ordine durante la cromatografia di esclusione dimensionale. 
La cromatografia ad esclusione dimensionale con diffusione della luce multiangolo (SEC-MALS) è stata utilizzata per analizzare il dimero e il contenuto oligomerico di ordine superiore dell'HTT purificato. Non è stata osservata alcuna correlazione tra la lunghezza del poliQ HTT FL (Q23, Q48 e Q73) e il contenuto di oligomeri. Il costrutto esone1-cancellato (aa 91-3,144) ha mostrato una propensione all'oligomerizzazione comparabile a FL HTT (aa 1-3,144). I metodi di produzione, purificazione e caratterizzazione mediante indice di rifrazione SEC/MALS (RI), elettroforesi su gel di sodio dodecilsolfato-poliacrilammide (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE e Blue Native PAGE sono descritti nel presente documento.

Forniamo protocolli scalabili che coprono la progettazione di costrutti, la trasfezione transitoria, l'espressione e la purificazione di varianti proteiche di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule HEK293.

Produzione efficiente e scalabile di varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule di mammifero utilizzando un sistema di espressione transitoria

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Il protocollo è stato sviluppato per la produzione di varianti di caccia a lunghezza intera su scala di basso milligrammo. Permette di produrre proteine costanti di alta qualità essenziali per i ricercatori MH. A dimostrare la procedura sarà Michael Harris, ricercatore del Curia Laboratory.Inizia aggiungendo un grammo di polietilenimmina 25 K a un litro di acqua priva di endotossine e mescola bene. Regolare il pH a 2,0 utilizzando acido cloridrico 100 millimolari e mescolare fino a quando tutto il polietilenimmina si dissolve. Quindi regolare il pH a 7,0 utilizzando una soluzione di idrossido di sodio da 100 millimolari e far passare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micrometri.Fare aliquote della soluzione filtrata e conservarle a meno 20 gradi Celsius. Propagare le cellule HEK293 nel mezzo di crescita integrato con streptomicina penicillina in un incubatore shaker umidificato a 37 gradi Celsius, 90 RPM, 5% anidride carbonica per 18-24 ore. Un giorno prima della trasfezione, diluire le cellule ad una densità di circa 1,2 x 10 alla sesta cella di potenza per millilitro in due litri di terreno di crescita in un pallone Erlenmeyer da cinque litri e incubare per 18-24 ore.Alla fine dell'incubazione, misurare la densità e la vitalità della cella utilizzando un contatore automatico delle celle seguendo le istruzioni del produttore. Dopo aver calcolato la quantità di polietilenimmina e plasmide necessaria per la trasfezione, diluire la polietilenimmina e il plasmide singolarmente in 100 millilitri di PBS e incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, mescolare il plasmide diluito e il polietilenimmina ruotando delicatamente e incubare la miscela a temperatura ambiente per 30 minuti.Aggiungere la miscela alla coltura cellulare e mescolare ruotando delicatamente. Ora, lascia che le cellule crescano per 24 ore. Il giorno successivo, aggiungere la soluzione di butirrato di sodio a una concentrazione finale di agente anti-aggregante e anti-schiuma a due millimolari in rapporto di 1: 1, 000 volume alla coltura e incubare le cellule nell'incubatore dello shaker umidificato per 48 ore.Dopo aver misurato la vitalità e la densità della cella, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 2.000 G per 30 minuti e conservare il pellet cellulare a meno 80 gradi Celsius prima della purificazione. Per la purificazione anti-FLAG con FPLC, imballare da 12 a 25 millilitri di resina anti-FLAG su una colonna vuota a una portata di quattro millilitri al minuto utilizzando il tampone A e regolare l'altezza dello stantuffo per rimuovere lo spazio tra l'estremità dello stantuffo e il letto di resina. Quindi, sospendere il pellet cellulare scongelato nel tampone di lisi fredda e passare la sospensione cellulare una volta attraverso un omogeneizzatore ad alto taglio a 1.000 libbre per pollice quadrato di pressione.Utilizzando una centrifuga dotata di un rotore ad angolo fisso compatibile, chiarire il lisato a 20.000 G per un'ora. Programma FPLC nella finestra Metodo, caricare il lisato chiarificato tramite la pompa campione e lavare la colonna con i volumi di colonna desiderati di buffer A, B, C, D e buffer di eluizione come descritto nel manoscritto di testo. Una volta terminata la corsa, analizzare 10 microlitri delle frazioni di picco utilizzando SDS-PAGE.Combinare le frazioni di picco con la purezza desiderata e risparmiare circa 50 microlitri di eluati combinati per ulteriori analisi SDS-PAGE. Inizia a equilibrare la colonna SEC usando l'FPLC e carica l'eluato anti-FLAG tramite un superloop da 50 millilitri. Dopo aver eseguito il buffer SEC, consentire che la separazione SEC avvenga durante la notte a quattro gradi Celsius.Confrontare il profilo di eluizione con il profilo di eluizione HTT standard per distinguere i picchi monomerici, dimeri e oligomeri di ordine superiore. Raggruppare le frazioni HTT monomeriche in base al profilo di eluizione della colonna SEC e, se lo si desidera, raggruppare separatamente le frazioni HTT oligomeriche e dimeriche di ordine superiore. Concentrare la proteina HTT aggregata utilizzando un concentratore centrifugo da 100 kilodalton a quattro gradi Celsius.Dopo aver calcolato la concentrazione proteica, aliquote meno di 100 microlitri della proteina HTT purificata in una provetta da microcentrifuga crio-sicura. Flash congelare le aliquote utilizzando azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Eseguire tutte le analisi SEC-MALS a quattro gradi Celsius sul sistema HPLC, accoppiato con un rilevatore UV, un rilevatore di diffusione della luce multi-angolo, un rilevatore di indice di rifrazione differenziale e utilizzare 0,185 come incremento dell'indice di rifrazione per HTT.Spurgare la pompa e i rilevatori con acqua filtrata di grado HPLC e collegare la colonna UHPLC al sistema. Equilibrare la colonna con acqua filtrata e quindi buffer SEC-MALS fino a quando tutti i segnali del rilevatore raggiungono la linea di base. Iniettare due microlitri di soluzione BSA ad una portata di 0,3 millilitri al minuto per 15 minuti per iniezione.Esaminare la qualità dei dati, eseguire la normalizzazione, l'allineamento dei picchi e la correzione dell'ampliamento della banda in base al profilo BSA e creare un modello per le seguenti esecuzioni di esempio HTT. Scongelare rapidamente una fiala del campione FL Q23-HTT in un bagno d'acqua a temperatura ambiente usando un galleggiante. Filtrare l'HTT attraverso un filtro di rotazione da 0,1 micrometri.Iniettare da due a quattro microlitri del campione HTT e correre per 15 minuti a quattro gradi Celsius a una portata di 0,3 millilitri al minuto. Analizza i dati cromatografici e di diffusione della luce utilizzando il software di accompagnamento e genera un grafico Zimm per determinare la massa molecolare media in peso per ciascun picco. Nel presente studio, utilizzando un processo a colonna in due fasi, è stato ottenuto più del 95% della purezza per HTT e il principale contaminante era lo chaperone Hsp70, che è stato eliminato mediante ampio lavaggio con cloruro di magnesio e ATP durante la fase di purificazione dell'affinità anti-FLAG La sovraespressione di FL HTT può provocare la frammentazione della proteina, ma FL Q23-HTT prodotto con il metodo risolto come una singola banda con il peso molecolare corretto di 350 kilodalton indica che non frammentazione.L'analisi Western blot dopo la reazione degli anticorpi con FL Q23-HTT ha dimostrato che la proteina è stata isolata senza significativi troncamenti rilevabili, poiché non sono state osservate ulteriori bande correlate ai frammenti. La varianza della lunghezza di FL HTT poly-Q, Q23, Q48 e Q73 ha reagito come previsto nel Western blot, mostrando un segnale progressivamente più forte per l'anticorpo monoclonale MW1 diretto da poli-Q, correlato all'aumento della lunghezza Q. Tra le colonne HPLC testate, la colonna SEC ha mostrato una risoluzione sufficiente tra il monomero HTT e il dimero, in modo tale da poter distinguere le masse molari.FL HTT purificato da SEC ha mostrato bande multiple corrispondenti agli stati di oligomerizzazione, che potrebbero essere dovuti alla presenza di diversi cerotti idrofobici che contribuiscono alla formazione di oligomeri di ordine superiore durante la migrazione all'interno del gel. L'HTT purificato ha mostrato tre bande principali su PAGE nativo blu con un peso molecolare stimato di 643, 927 e 1.070 kilodalton che probabilmente rappresentano rispettivamente le specie monomeriche, dimeriche e trimeriche di HTT. La corretta gestione dell'huntingtina purificata è essenziale per evitare di generare oligomeri di alto ordine negli aggregati solubili.È imperativo che l'utente finale lavori rapidamente per erogare il campione in provette pre-refrigerate prima del congelamento flash. I test di stabilità a lungo termine possono essere eseguiti su campioni conservati per periodi prolungati a meno 80 gradi Celsius. Ripetute analisi HPLC SEC-MALS confermeranno se vi sono state modifiche al contenuto monomerico del campione.

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Questo è un protocollo rapido ed economico per la produzione di proteine di mammifero glicosilate secrete e la successiva purificazione in un solo passaggio con rese sufficienti di proteine omogenee per la cristallografia a raggi X e altri studi biofisici.

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Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

Il BDNF ricombinante contenente una sequenza Avi (BDNFAvi) viene prodotto nelle cellule HEK293 in modo conveniente ed è purificato dalla cromatografia di affinità. BDNFavi viene quindi direttamente mono-biotinylated con l'enzima BirA in un tubo. BDNFavi e BDNFavi monobionlate mantengono la loro attività biologica rispetto al BDNF disponibile in commercio.

Un protocollo migliorato per purificare e direttamente mono-biotinyare recombinante BDNF in un tubo per gli studi sul traffico cellulare nei neuroni

Qui, viene presentato un protocollo di produzione AAV basato su celle HEK293 in sospensione, con conseguente riduzione del tempo e della manodopera necessari per la produzione di vettori utilizzando componenti disponibili per scopi di ricerca da fornitori commerciali.

Produzione di lotti vettoriali adeno-associati ad alto rendimento utilizzando celle di sospensione HEK293

Scopri un protocollo scalabile per produrre varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule HEK293 con elevata purezza. Questo metodo supporta la ricerca sulla malattia di Huntington.

Produzione efficiente e scalabile di varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule di mammifero utilizzando un sistema di espressione transitoria (Video) | JoVE Journal

Produzione efficiente e scalabile di varianti di huntingtina umana a lunghezza intera in cellule di mammifero utilizzando un sistema di espressione transitoria

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