Name: Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Impara la sintesi di masarimycin per studiare l'inibizione della crescita batterica Gram-positiva con Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae. Questo protocollo riproducibile utilizza cromatografia su strato sottile e cromatografia flash per purificazione.

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La ricerca è stata sostenuta dalla National Science Foundation con il numero di sovvenzioni 2009522. L'analisi NMR della masarimicina è stata supportata dal premio del programma di strumentazione di ricerca della National Science Foundation con il numero di sovvenzione 1919644. Eventuali opinioni, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.

1. Metodi generali
NOTA: Tutti i composti sono stati acquistati da fornitori standard e utilizzati senza ulteriore purificazione.
<ol><li>Eseguire la cromatografia a strato sottile (TLC) su una piastra di alluminio prefigurata con gel di silice XG F254. Rileva le macchie sotto una lampada UV, immergendoti nella macchia di p-anisaldeide o esponendo al vapore I2 .</li>
	<li>Registra tutti gli spettri di risonanza magnetica nucleare (NMR) su uno spettrometro a 400 MHz. NOTA: 1H-NMR e 13spettri C-NMR sono stati riferiti ai picchi di solvente residuo. Le costanti di accoppiamento sono date in [Hz] e gli spostamenti chimici in [ppm].</li>
	<li>Registrare gli spettri di spettrometria di massa a ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) di masarimicina su uno spettrometro di massa compatto dotato di una sonda di analisi dei solidi atmosferici.</li>
</ol>2. Procedura generale per la preparazione della masarimicina
NOTA: eseguire i passaggi seguenti in una cappa aspirante.
<ol><li>Preparare una soluzione di 0,1 M in metanolo di ciascun reagente: cicloesilammina, cicloesil carbossildeide, acido o-iodobenzoico e cicloesil isocianuro35. ATTENZIONE: La cicloesilammina, l'isocianuro di cicloesile e la carbossaldeide cicloesile sono infiammabili. Possono causare corrosione cutanea e indurre tossicità orale, cutanea, respiratoria o riproduttiva. Tenere i composti lontani da fiamme libere, superfici calde e fonti di accensione. Indossare un'adeguata protezione della pelle e degli occhi, lavorare in un'area ben ventilata ed evitare l'inalazione di vapori o nebbia. Per la conservazione, tenere le bottiglie ben chiuse e conservarle in un luogo fresco e asciutto. Conservare cicloesil carbossialdeide in un essiccatore in un'atmosfera N2 .</li>
	<li>Mescolare 5 mL di cicloesilammina (0,1 M di soluzione in metanolo) e 5 mL di cicloesil carbossilaldeide (0,1 M in metanolo) in un matraccio a fondo tondo tappato e mescolare la soluzione utilizzando una barra magnetica su una piastra agitata/calda per 30 minuti a 40 °C in un bagno di sabbia. Monitorare la temperatura utilizzando un termometro posto a circa 1 cm sotto la superficie della sabbia.</li>
	<li>Dopo 30 minuti, aggiungere 5 mL di isocianuro di cicloesile (soluzione da 0,1 M in metanolo) alla soluzione dal punto 2.2 e mescolare per altri 20 minuti a 50 °C. Infine, aggiungere 5 mL di acido o-iodobenzoico (soluzione da 0,1 M in metanolo) alla miscela di reazione e continuare a mescolare a 55 °C per 3-5 ore.</li>
	<li>Monitorare periodicamente l'andamento della reazione da parte di TLC circa ogni ora dopo che la miscela di reazione di cui sopra è stata agitata per 3 ore.</li>
	<li>Tagliare una striscia di 3 cm x 6 cm di piastra TLC con supporto in alluminio. Usando una matita #2, disegna una linea a circa 1 cm dal basso. Utilizzando un microcapillare di vetro, individuare circa 5 μL della miscela di reazione sulla piastra TLC e lasciarla asciugare.</li>
	<li>A un becher da 150 ml, aggiungere abbastanza fase mobile (esano 90:10: isopropanolo) per coprire il fondo del becher. Utilizzando un paio di pinzette, posizionare con attenzione la piastra TLC sopra nel becher assicurandosi che la piastra TLC entri nella fase mobile in modo uniforme. Coprire la parte superiore del becher con un pezzo di carta stagnola. NOTA: assicurarsi che la fase mobile non copra la linea e il campione individuato.</li>
	<li>Lasciare che la fase mobile risalga la piastra TLC fino a quando non si trova a circa 1 cm sotto la parte superiore della piastra. Rimuovere la piastra TLC e, utilizzando una matita, disegnare una linea che indichi la distanza percorsa dalla fase mobile. Lasciare asciugare la piastra TLC in una cappa aspirante.</li>
	<li>Una volta essiccato, posizionare la piastra TLC in un becher contenente una piccola quantità di solido I2 e coprire il becher con un pezzo di stagnola. Monitorare la TLC per lo sviluppo di macchie gialle/marroni. Una volta sviluppato, rimuovere la piastra TLC e contrassegnare la posizione delle macchie con una matita (Figura supplementare 1). NOTA: Se2 macchie non sono contrassegnate, la macchia si dissiperà nel tempo. Le macchie possono anche essere visualizzate sulla piastra TLC mediante luce UV, colorazione di p-anisaldeide o colorazione del permanganato di potassio (vedere Informazioni supplementari).</li>
	<li>Calcolate i valori Rf per tutti i punti visualizzati utilizzando la seguente formula: Rf = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq01.jpg"></li>
	<li>Considerare la reazione completa quando solo un punto con Rf = 0,3 è visibile sulla piastra TLC. Rimuovere il solvente in un evaporatore rotativo a pressione ridotta e asciugare il prodotto grezzo (ottenuto come olio bruno-giallastro) sotto un alto vuoto fino a quando tutto il metanolo è evaporato.</li>
	<li>Sciogliere il prodotto greggio essiccato in 30 ml di acetato di etile e trasferirlo in un imbuto separatore. Estrarre l'acetato di etile in sequenza con 1 M HCl (2 x 30 mL), H2O (30 mL), soluzione satura di NaHCO3 (2 x 30 mL), H2O (30 mL) e soluzione di NaCl saturo (2 x 30 mL). Scartare gli strati acquosi. NOTA: Lo strato di acetato di etile è lo strato superiore in ciascuna delle estrazioni. Per ogni estrazione, agitare vigorosamente l'imbuto separatore contenente l'acetato di etile e la soluzione acquosa (HCl, H2O, NaHCO3 o NaCl) e lasciare che gli strati si separino completamente.</li>
	<li>Rimuovere lo strato di acetato di etile dall'imbuto separatore e raccoglierlo in un matraccio Erlenmeyer. Aggiungere una spatola piena di Na2SO4 (anidra) per rimuovere l'acqua residua dall'acetato di etile. NOTA: La soluzione di acetato di etile è considerata secca quando Na2SO4 nel matraccio scorre liberamente e non si aggrega. Se Na2SO4 si aggrega, è possibile aggiungere una spatola aggiuntiva di Na2SO4 .</li>
	<li>Filtrare la soluzione essiccata di acetato di etile attraverso la carta da filtro #1 per rimuovere Na2SO4. Lavare la carta da filtro con una piccola quantità di acetato di etile. Posizionare la soluzione filtrata di acetato di etile in un matraccio a fondo tondo e rimuovere il solvente su un evaporatore rotatorio a pressione ridotta per ottenere masarimicina come olio una volta rimosso tutto l'acetato di etile.</li>
	<li>Sciogliere l'olio di masarimicina ottenuto sopra in una quantità minima (1-2 ml) di esano 9:1: isopropanolo e mescolare su una piastra magnetica fino a quando tutto il composto è sciolto.</li>
	<li>Purificare la masarimicina disciolta mediante cromatografia flash utilizzando una colonna flash di silice in fase normale da 12 g.<ol>
<li>Equilibrare la colonna flash con 10 volumi di colonna di fase mobile (esano 99:1: isopropanolo) con lo strumento impostato ad una portata di 15 mL/min. NOTA: al termine dell'equilibrio, arrestare il flusso e scollegare la parte superiore della colonna dal sistema.</li>
		<li>Aspirare la masarimicina disciolta usando una siringa da 5 ml. Collegare la siringa direttamente alla parte superiore della colonna flash bilanciata e iniettare la soluzione nella colonna. Ricollegare la colonna caricata al sistema di cromatografia flash e avviare l'eluizione del gradiente.</li>
		<li>Elute masarimycin dalla colonna utilizzando l'eluizione gradiente ad una concentrazione di fase mobile finale di 10:90 esano: isopropanolo su 12 volumi di colonna. Monitorare l'eluizione di masarimicina attraverso l'assorbimento a 230 e 254 nm.</li>
		<li>Raccogliere i composti eluiti dalla colonna da un collettore di frazioni che raccoglie 20 ml di solvente per frazione. NOTA: Se non è disponibile un sistema di cromatografia flash, la purificazione della masarimicina può essere eseguita tramite una colonna di silice gravitazionale con una fase mobile 3:1 (esano: acetato di etile). Le frazioni contenenti masarimicina possono essere identificate da TLC utilizzando la stessa fase mobile. La visualizzazione delle macchie TLC è stata effettuata con luce UV, vapore I2 o colorazione del permanganato di potassio.</li>
		<li>Identificare le frazioni contenenti masarimicina mediante TLC (fasi 2.5-2.9) o spettrometria di massa su uno spettrometro di massa compatto dotato di una sonda di analisi dei solidi atmosferici. Asciugare il prodotto finale sotto vuoto (~0,3 mbar). NOTA: La masarimicina è abitualmente ottenuta come olio incolore o solido con una resa del 55%-70% rispetto al mmol di cicloesil carbossialdeide aggiunto alla reazione. Calcola la resa finale della masarimicina ottenendo la massa della masarimicina purificata e calcolando la resa teorica della reazione usando la seguente formula: % resa = <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63191/63191eq02.jpg"> x 100%</li>
	</ol></li>
	<li>Confermare la struttura della masarimicina mediante NMR.<ol>
<li>Sciogliere ~10 mg di campione di masarimicina in 0,5 ml di CDCl3. Utilizzando un pipetto Pasteur, trasferire la soluzione su un tubo NMR da 5 mm e tappare il tubo. Posizionare il tubo NMR nello spettrometro.</li>
		<li>Acquisisci spettri NMR 1H e 13C utilizzando esperimenti preimpostati dal produttore. Le assegnazioni dei turni chimici e gli spettri rappresentativi sono forniti nelle figure supplementari 3-4.</li>
	</ol></li>
	<li>Conservare la masarimicina asciutta o disciolta in DMSO (concentrazione finale di 25 mM) a -20 °C fino all'uso.</li>
</ol>3. Procedura a microonde per la preparazione di masarimycin
<ol><li>Preparare soluzioni 0,6 M di cicloesilammina, cicloesile carbossildeide, isocianuro di cicloesile e acido o-iodobenzoico in acetonitrile.</li>
	<li>Aggiungere una barra di agitazione e 10 ml di acetonitrile a un flaconcino di reazione a microonde di vetro.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di cicloesilammina (0,6 M in acetonitrile), 2 mL di cicloesil carbossildeide (0,6 M in acetonitrile) e 7 ml di acetonitrile al flaconcino.</li>
	<li>Posizionare il flaconcino di reazione a microonde nel carosello del microonde. Mescolare la miscela, riscaldarla per 30 minuti a 50°C con una potenza di 400 W e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di acido o-iodobenzoico (0,6 M in metanolo) e 2 mL di isocianuro di cicloesile (0,6 M in acetonitrile) al flaconcino. Mescolare la miscela, riscaldarla a 100 °C nel microonde per 40 minuti con una potenza di 400 W e lasciarla raffreddare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Monitorare l'avanzamento della reazione mediante TLC (esano 90:10: isopropanolo) utilizzando il vapore I2 dopo il completamento del passaggio 3.5. NOTA: se la TLC mostra che la reazione è incompleta (cioè più punti sulla TLC), riposizionare il flaconcino di reazione nel microonde e impostare le condizioni del microonde descritte al punto 3.5.</li>
	<li>Una volta completata la reazione, versare la soluzione in un matraccio a fondo tondo da 100 ml ed evaporarla a secco utilizzando un evaporatore rotante.</li>
	<li>Seguire i passaggi 2.6-2.16 sopra per completare il workup acquoso, la purificazione e la caratterizzazione della masarimicina.</li>
</ol>4. Analisi di sinergia e antagonismo
<ol><li>Coltivare Streptococcus pneumoniae R6 su piastre di agar Mueller-Hinton (MH) contenenti il 5% (v/v) di sangue di pecora a 37 °C in condizioni anaerobiche. In tutti gli esperimenti, utilizzare cellule di secondo passaggio coltivate in 5 ml di brodo MH a 37 °C in condizioni anaerobiche fino a quando OD600 è ~ 0,4.</li>
	<li>Sottoporre gli inibitori masarimicina e optochina a diluizioni seriali 1:2 nei rispettivi solventi, con le concentrazioni risultanti che affiancano i valori minimi di concentrazione inibitoria (MIC) di ciascun inibitore.<ol>
<li>Effettuare la diluizione iniziale di masarimicina in dimetilsolfossido (DMSO) fino a raggiungere una concentrazione di 100 μM. Da questo punto, fare diluizioni di masarimicina in brodo MH. Preparare la soluzione madre di optochin (3,5 mM) sciogliendo l'optochina disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) in brodo MH sterile. NOTA: le soluzioni stock di Masarimycin sono state realizzate a 25 mM in DMSO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Su una piastra sterile di microtitolazione a 96 pozzetti, aggiungere aliquote da 2 μL di ciascuna diluizione optochina a ciascuna fila della piastra. Alla stessa piastra, aggiungere 2 aliquote μL di ogni diluizione di masarimicina a ciascuna colonna per creare una serie di concentrazioni di optochin e masarimycin sulla piastra (Figura 2).</li>
	<li>Aggiungere brodo MH sterile (93 μL) a ciascun pozzetto contenente gli inibitori di cui sopra. Inoculare le piastre di microtitolazione con 5 μL di coltura (OD600 ~ 0,4) dal punto 4.1. NOTA: l'inoculazione della piastra a 96 pozzetti viene in genere eseguita in condizioni anaerobiche in una workstation anaerobica. Il volume finale nel pozzo è di 100 μL.</li>
	<li>Coltivare colture per 18 ore a 37 °C in condizioni anaerobiche, seguite dall'aggiunta di 30 μL di soluzione allo 0,01% (m/v) di sale sodico di resazurina. Incubare la piastra a temperatura ambiente per 15 minuti per consentire la formazione e la stabilizzazione del colore. NOTA: La soluzione di resazurina viene preparata sciogliendo il composto in acqua distillata e può essere conservata a 4 °C per un massimo di due settimane.</li>
	<li>Leggere direttamente i valori di concentrazione dalla piastra e assegnare la più bassa concentrazione di inibitori per la quale non si osserva alcuna crescita batterica (colore blu) come [X] (vedere il punto 4.7.1), cioè la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in presenza del co-farmaco. NOTA: La crescita batterica positiva è identificata nei pozzetti dal colorante resazurina che diventa rosa. I valori di MIC per ciascun farmaco da solo (cioè in assenza di co-farmaco) sono determinati in modo simile utilizzando il test resazurin MIC35 con ciascun farmaco separatamente (Figura supplementare 5). I MIC in S. pneumoniae sono 7,8 μM e 15,85 μM per masarimycin e optochin, rispettivamente.</li>
	<li>Determinare la concentrazione inibitoria frazionaria (FIC) e l'indice FIC (FICI) utilizzando le seguenti equazioni.<ol>
<li>FIC= [X]/MICx, dove [X] (dal passo 4.6) è la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in presenza del co-farmaco, e MICx è la più bassa concentrazione inibitoria del farmaco in assenza del co-farmaco.</li>
		<li>FICI= FICmasarimicina +antibiotico FIC NOTA: FICI &lt; 0,5 = sinergico, 0,5 &lt; FICI &lt; 1 = additivo, 1 &lt; FICI &lt; 4 = indifferente, FICI &gt; 4 = antagonista.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Studio morfologico
<ol><li>Coltivare Bacillus subtilis 11774 su piastre di agar Luria-Bertani (LB) (10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito e 5 g/L di NaCl) contenenti l'1,5% di Bacto agar a 37 °C. In tutti gli esperimenti, utilizzare cellule di secondo passaggio coltivate in 5 ml di brodo LB a 37 °C fino a OD600 = 1. Coltivare S.pneumoniae nello stesso modo del passaggio 4.1.</li>
	<li>Dopo aver ottenuto una densità di coltura cellulare con OD600nm = 1 per B. subtilis, o OD600nm = 0,4 per S. pneumoniae, aggiungere masarimycin usando una pipetta al tubo di coltura etichettato "trattato" ad una concentrazione finale di 3,8 μM (0,75x MIC per B.subtilis), o 5,85 μM (0,75x MIC per S.pneumoniae). Al secondo tubo di coltura etichettato "controllo", aggiungere un volume equivalente di DMSO.</li>
	<li>Per B.subtilis, posizionare i campioni in un incubatore a 37 °C per 90 minuti con agitazione a 150 giri/min. Per S. pneumoniae, incubare le cellule senza scuotere in condizioni anaerobiche.</li>
	<li>Dopo 90 minuti, fissare chimicamente le colture in una miscela 1:10 (v/v) di terreno di coltura e tampone di fissaggio (20 mM HEPES, 1% formaldeide (pH 6,8)) a 4 °C durante la notte. Al termine del fissaggio, applicare 10-20 μL di campioni su vetrini per microscopio di vetro utilizzando una pipetta e lasciarli asciugare all'aria. Fissare i campioni essiccati all'aria riscaldando i vetrini utilizzando un bruciatore Bunsen.</li>
	<li>Dopo il fissaggio a caldo, i campioni di colorazione con l'aggiunta di 100 μL di blu di metilene allo 0,1% (m/v) (soluzione in etanolo al 20% (v/v). Incubare i vetrini macchiati per 10 minuti e lavare via il colorante in eccesso con dH2O. Quindi, riscaldare delicatamente i vetrini macchiati a 60 ° C in un forno per 15-20 minuti per portare le celle su un piano focale comune.</li>
	<li>Sigillare i campioni macchiati posizionando un coprimicroscopio sulle cellule macchiate. Quindi, sigillare i bordi usando il cemento del vetrino del microscopio. Posizionare il vetrino del microscopio sigillato sul palco del microscopio e mettere a fuoco l'immagine con un ingrandimento di 100x utilizzando la microscopia a campo luminoso.</li>
	<li>Posizionare una goccia di olio per immersione sul vetrino del microscopio e mettere a fuoco il campo visivo utilizzando un ingrandimento di 1000x. Acquisire micrografie utilizzando una fotocamera collegata al microscopio e il relativo software associato. Acquisisci immagini utilizzando le impostazioni di bilanciamento automatico del bianco e apertura sul software. NOTA: in alternativa, le immagini possono essere elaborate utilizzando il software open source ImageJ.</li>
</ol>

Reid, C. W. ha proprietà intellettuale che coinvolge applicazioni specifiche di masarimycin.

Masarimycin è un singolo inibitore batteriostatico micromolare della crescita di B. subtilis35 e S. pneumoniae37 . In B. subtilis, masarimycin ha dimostrato di inibire il GlcNAcase LytG35, mentre il bersaglio molecolare preciso nella parete cellulare di S. pneumoniae non è stato identificato37. La sintesi di masarimicina utilizzando la classica sintesi organica o la procedura a microonde fornisce l'i...

Il peptidoglicano (PG) è un polimero a maglie che delinea la forma e la struttura cellulare nei batteri Gram-positivi e Gram-negativi 1,2. Questo eteropolimero è una matrice di amminozuccheri reticolati da peptidi corti 3,4,5,6 con una spina dorsale composta da residui alternati di N-acetilglucosamina (GlcNAc) e acido N-acetilmuramico (MurNAc) legati a β-(1,4) (Figura 1)1. Attaccato alla porzione di lattilo C-3 di MurNAc è il peptide dello stelo. Il metabolismo della PG coinvolge un sistema strettamente coordinato di enzimi biosintetici e degradativi per incorporare nuovo materiale nella parete cellulare 7,8. La degradazione del PG viene effettuata da enzimi collettivamente denominati autolisine9 e ulteriormente classificati in base alla specificità del legame scisso. Le autolisine partecipano a molti processi cellulari tra cui la crescita cellulare, la divisione cellulare, la motilità, la maturazione PG, la chemiotassi, la secrezione proteica, la competenza genetica, la differenziazione e la patogenicità10,11. Svelare le funzioni biologiche specifiche delle singole autolisine può essere scoraggiante, in parte a causa della ridondanza funzionale. Tuttavia, recenti studi biofisici 8,12,13 e computazionali12 hanno fornito nuove informazioni sui loro ruoli nel metabolismo pg. Inoltre, recenti rapporti hanno fornito ulteriori informazioni sulla sintesi14 e sui 15,16,17 passaggi mediati dalla membrana nel metabolismo pg. Una conoscenza approfondita della relazione tra vie degradative e sintetiche del metabolismo pg potrebbe dare origine a bersagli antibiotici precedentemente non sfruttati.
Mentre ci sono stati progressi significativi nella metodologia per studiare la glicobiologia negli eucarioti, la glicobiologia batterica e, in particolare, il metabolismo PG non è avanzato a un ritmo simile. Gli attuali approcci chimici per studiare il metabolismo pg includono antibiotici marcati fluorescentemente18, sonde fluorescenti 19,20 e etichettatura metabolica 21,22,23,24. Questi nuovi approcci stanno fornendo nuovi modi per interrogare il metabolismo della parete cellulare batterica. Mentre alcune di queste strategie sono in grado di etichettare PG in vivo, possono essere specie-specifiche19, o funzionare solo in ceppi privi di una particolare autolisina25. Molte strategie di marcatura PG sono destinate all'uso con pareti cellulari isolate26 o con vie di biosintesi PG ricostituite in vitro 20,27,28. L'uso di antibiotici marcati con fluorescenza è attualmente limitato alle fasi biosintetiche e alla transpeptidazione18.
Le attuali conoscenze sulle autolisine batteriche e sul loro ruolo nel metabolismo della parete cellulare provengono da analisi genetiche e biochimiche in vitro 11,29,30,31,32. Mentre questi approcci hanno fornito una ricchezza di informazioni su questa importante classe di enzimi, decifrare il loro ruolo biologico può essere difficile. Ad esempio, a causa della ridondanza funzionale33, la cancellazione di un'autolisina nella maggior parte dei casi non comporta l'arresto della crescita batterica. Questo nonostante il loro ruolo implicito nella crescita e divisione cellulare 7,12. Un'altra complicazione è che la delezione genetica delle autolisine batteriche può dare origine a meta-fenotipi34. I metafenotipi derivano dalla complessa interazione tra la via interessata dalla delezione genetica e altre vie interconnesse. Ad esempio, un meta-fenotipo può insorgere attraverso un effetto diretto come la mancanza di un enzima o un effetto indiretto come un'interruzione dei regolatori.
Attualmente, ci sono solo pochi inibitori delle autolisine della glicosidasi come N-acetilglucosaminidasi (GlcNAcase) e N-acetilmuramidasi, che possono essere utilizzati come sonde chimiche per studiare la degradazione del PG. Per risolvere questo problema, la diamide masarimicina (precedentemente definita come fgkc) è stata identificata e caratterizzatacon 35 come inibitore batteriostatico della crescita del Bacillus subtilis che prende di mira il GlcNAcase LytG32 (Figura 1). LytG è un GlcNAcase36 eso-agente, membro del cluster 2 all'interno della famiglia 73 della glicosil idrolasi (GH73). È il principale GlcNAcase attivo durante la crescita vegetativa32. Per quanto ne sappiamo, la masarimicina è il primo inibitore di un GlcNAcase ad azione PG che inibisce la crescita cellulare. Ulteriori studi sulla masarimicina con Streptococcus pneumoniae hanno scoperto che la masarimicina probabilmente inibisce il metabolismo della parete cellulare in questo organismo37. Qui, la preparazione di masarimicina è segnalata per l'uso come sonda di biologia chimica per studiare la fisiologia negli organismi Gram-positivi B. subtilis e S. pneumoniae. Vengono presentati esempi di analisi morfologica del trattamento con concentrazione inibitoria sub-minima con masarimicina, nonché un test di sinergia/antagonismo. I saggi di sinergia e antagonismo con antibiotici con modalità d'azione ben definite possono essere un modo utile per esplorare le connessioni tra i processi cellulari 38,39,40.

<table><tbody><tr><td>Acido 2-iodobenzoico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>I7675-25G</td><td>polvere corrosiva, irritante, da giallo chiaro ad arancio-marrone</td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>109827-4L</td><td>liquido infiammabile, irritante, incolore</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>34851-4L</td><td>liquido infiammabile, irritante, incolore</td></tr><tr><td>Piastre di silice con supporto in alluminio</td><td>Sorbtech</td><td>4434126</td><td>gel di silice XG F254 su piastre con supporto in alluminio</td></tr><tr><td>cloroformio-d</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>151823-50G</td><td>solvente per spettrometro</td></tr><tr><td>di massa compatto</td><td>NMR Advion-Interchim</td> Spettrometro di massa compatto <td>Advion CMS</td><td>dotato di sorgente APCI e sonda per l'analisi dei solidi atmosferici</td></tr><tr><td>Corning Costar 96 piastre a fondo piatto sterili</td> Fisher <td>Chemical</td><td>07-200-90</td><td>per saggi di sinergia/antagonismo</td></tr><tr><td>vetrini coprioggetto</td><td>fisher chemical</td><td>12-547</td><td>per microscopia</td></tr><tr><td>Cicloesanocarbossaldeide</td><td>CHEM-IMPEX INT'L INC.</td><td>24451</td> liquido <td>infiammabile, irritante, da incolore a rosa</td></tr><tr><td>Cicloesil isocianuro</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>133302-5G</td><td>liquido irritante, incolore, odore estremamente sgradevole</td></tr><tr><td>Cicloesilammina</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>240648-100ML</td><td>liquido corrosivo, infiammabile, irritante, incolore a meno che non sia contaminato</td></tr><tr><td>Acetato di etile</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>537446-4L</td><td>infiammabile, irritante, incolore </td></tr><tr><td>cartuccia di silice flash liquida (12g)</td><td>Advion-Interchim</td><td>PF-50SIHP-F0012</td><td>confezione di colonne di silice flash (12g) per la purificazione della formaldeide di masarimicina</td></tr><tr><td></td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F8775-25ML</td><td>agente di fissaggio per microscopia</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H8651-25G</td><td>tampone per microscopia soluzione di fissaggio</td></tr><tr><td>Esano, miscela di isomeri</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>178918-4L</td><td>dannoso per l'ambiente, infiammabile, irritante, pericoloso per la salute, liquido incolore</td></tr><tr><td>Spettrometro di massa compatto ad alte prestazioni</td><td>Sonda</td> per <td>l'analisi</td><td>dei solidi atmosferici (ASAP), a bassa risoluzione</td></tr><tr><td>High Vac</td><td>eppendorf</td><td>Vacufuge più</td><td>vuoto aiutato dalla forza centrifuga e dalla temperatura</td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>258148-2.5L</td><td>corrosivo, irritante, incolore acido</td></tr><tr><td>cloridrico</td> liquido <td>SIGMA-ALDRICH</td><td>320331-2.5L</td> forte <td>acido</td></tr><tr><td>immersione olio</td><td>fisher chimico</td><td>12-365-19</td><td>per microscopia</td></tr><tr><td>Iodio, cristalli risublimati</td><td>Alfa Aesar</td><td>41955</td><td>dannoso per l'ambiente, irritante, pericoloso per la salute, cristalli grigio scuro/viola</td></tr><tr><td>Mestre Mnova</td><td>MestreLab Research</td><td></td><td>software per l'elaborazione degli spettri NMR</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>439193-4L</td><td>infiammabile, tossico, pericoloso per la salute, liquido incolore</td></tr><tr><td>blu di metilene</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>M9140-25G</td><td>colorante per microscopia per la colorazione delle pareti cellulari</td></tr><tr><td>piastre di agar meuller-hinton + 5% di sangue di pecora</td><td>fisher chimico</td><td>B21176X</td><td>terreno di crescita per Streptococcus pneumoniae</td></tr><tr><td>brodo meuller-hinton</td><td>fisher chemical</td><td>DF0757-17-6</td><td>terreni di crescita per vetrini per microscopio Streptococcus pneumoniae</td></tr><tr><td>fisher</td><td>chemical</td><td>22-310397</td><td>per microscopia</td></tr><tr><td>Labstation di sintesi a microonde</td><td>Dispositivo MILESTONE</td><td>START SYNTH</td><td>che richiede la ventilazione di una cappa aspirante, dotato di tubi NMR a carosello</td></tr><tr><td></td><td>di sintesi SIGMA-ALDRICH</td><td>Z562769-5EA</td><td>tubi NMR da 5 mm 600 MHz</td></tr><tr><td>Risonanza Magnetica Nucleare (NMR)</td><td>Bruker</td><td>Ascend 400</td><td>grande magnete superconduttore (400MHz)</td></tr><tr><td>optocina</td><td>Fisher chimico</td><td>AAB21627MC</td><td>etilidrocupreina cloridrato</td></tr><tr><td>piastre di Petrie</td><td>Celltreat</td><td>229695</td><td>per la preparazione di piastre di agar per la crescita batterica</td></tr><tr><td>Primo Star Microscopio a campo chiaro/contrasto di fase con fotocamera ERc5s</td><td>Zeiss</td><td></td><td>per studi morfologici</td></tr><tr><td>puriFlash</td><td>interchim</td><td>XS520plus</td><td>sistema di purificazione per cromatografia flash</td></tr><tr><td>resazurin</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>R7017-1G</td><td>per saggi di sinergia/antagonismo</td></tr><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>Heidolph</td><td>Hei-VAP Value Evaporatore a solvente "The Collegiate"</td><td></td></tr> <tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S6014-500G</td><td>irritante, bianco polvere</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>fisher chimico</td><td>S271-1</td><td>cristallino, incolore</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S5886-500G</td><td>per la crescita di B.subtilis e la preparazione di terreni LB</td></tr><tr><td>Solfato di sodio</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>7985592-500G</td><td>anidro, granulare, bianco</td></tr><tr><td>triptone</td><td>fisher chimico</td><td>BP1421-500</td><td>per la crescita di B.subtilis e preparazione di LB media</td></tr><tr><td>Whitney DG250 Workstation</td><td>Microbiology International</td><td>DG250</td><td>workstation anaerobica workstation. Miscela di gas anaerobici utilizzata: 5% di idrogeno, 10% di anidride carbonica, equilibrio azoto</td></tr><tr><td>estratto di lievito</td><td>Fisher Chemical</td><td>BP1422-500</td><td>per la crescita di B.subtilis e la preparazione di LB media</td></tr><tr><td>Zen Lite (blu) software</td><td>Zeiss per l'acquisizione</td><td></td><td>di micrografie</td></tr></tbody></table>

sintesi di masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica gram-positiva

Synthesis of Masarimycin, a Small Molecule Inhibitor of Gram-Positive Bacterial Growth

Il peptidoglicano (PG) nella parete cellulare dei batteri è una struttura macromolecolare unica che conferisce forma e protezione dall'ambiente circostante. Fondamentale per comprendere la crescita e la divisione cellulare è la conoscenza di come la degradazione del PG influenza la biosintesi e l'assemblaggio della parete cellulare. Recentemente, è stata riportata l'etichettatura metabolica di PG attraverso l'introduzione di zuccheri o amminoacidi modificati. Mentre l'interrogazione chimica dei passaggi biosintetici con inibitori di piccole molecole è possibile, gli strumenti di biologia chimica per studiare la degradazione del PG da parte delle autolisine sono sottosviluppati. Le autolisine batteriche sono un'ampia classe di enzimi coinvolti nella degradazione strettamente coordinata del PG. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per la preparazione di una sonda a piccola molecola, masarimycin, che è un inibitore della N-acetilglucosaminidasi LytG nel Bacillus subtilis e del metabolismo della parete cellulare nello Streptococcus pneumoniae. Viene fornita la preparazione dell'inibitore tramite sintesi organica classica e assistita da microonde. Viene presentata la sua applicabilità come strumento per studiare la fisiologia Gram-positiva nei saggi biologici.

Masarimycin è un inibitore batteriostatico a piccola molecola di B. subtilis e S. pneumoniae e ha dimostrato di inibire il GlcNAcase LytG eso-agente in B. subtilis35,37 e di colpire la parete cellulare in S. pneumoniae37. La masarimicina può essere preparata in modo efficiente sia dalla sintesi organica classica che da quella assistita da microonde con rese nell'intervallo 55%-70%. La sintesi assistita d...

Viene presentato un protocollo dettagliato per la preparazione della diamide batteriostatica masarimicina, una sonda a piccola molecola che inibisce la crescita di Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae mirando alla degradazione della parete cellulare. La sua applicazione come sonda chimica è dimostrata in saggi di sinergia/antagonismo e studi morfologici con B. subtilis e S. pneumoniae.

Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva

Peptidoglycan (PG) in the cell wall of bacteria is a unique macromolecular structure that confers shape, and protection from the surrounding environment. ...

La masarimicina è uno dei pochi inibitori delle autolisine batteriche che arresta la crescita delle cellule batteriche. Può essere utilizzato per indagare le differenze tra inattivazione chimica e genetica delle autolisine e fornisce un approccio ortogonale alla genetica per studiare la fisiologia batterica. La sintesi di masarimicina può sembrare scoraggiante.Segui attentamente i passaggi mostrati. In caso di dubbio se una fase di reazione ha funzionato, confermare con cromatografia a strato sottile e le variazioni dei valori RF. Per iniziare, preparare una soluzione 0,1-molare di cicloesilammina, cicloesil carbossaldeide, acido orto-iodobenzoico e cicloesil isocianuro in metanolo.Aggiungere la barra magnetica, quindi, mescolare cinque millilitri di cicloesilammina e cinque millilitri di cicloesile carbossialdeide in un matraccio a fondo tondo coperto e posizionare il matraccio in un bagno di sabbia su un agitatore a piastra calda per 30 minuti a 40 gradi Celsius. Monitorare la temperatura utilizzando un termometro posto a circa un centimetro sotto la superficie della sabbia. Dopo 30 minuti, aggiungere cinque millilitri di isocianuro di cicloesile alla soluzione e mescolare per altri 20 minuti a 50 gradi Celsius.Quindi, aggiungere cinque millilitri di acido orto-iodobenzoico alla miscela di reazione e continuare a mescolare a 55 gradi Celsius per tre-cinque ore. Dopo tre ore di agitazione, monitorare periodicamente l'avanzamento della reazione mediante cromatografia a strato sottile, o TLC, a intervalli di circa un'ora. Considerare la reazione completa quando solo un punto con un fattore di ritenzione pari a 0,3 è visibile sulla piastra TLC.Rimuovere il solvente nell'evaporatore rotativo a pressione ridotta. Una volta evaporato tutto il metanolo, sciogliere il prodotto grezzo essiccato in 30 millilitri di acetato di etile e trasferirlo in un imbuto separatore. Estrarre l'acetato di etile in sequenza con acido cloridrico monofusolare, acqua, soluzione di bicarbonato di sodio saturo, acqua di nuovo e soluzione di cloruro di sodio saturo, scartando gli strati acquosi ad ogni estrazione.Quindi, rimuovere lo strato di acetato di etile dall'imbuto separatore e raccoglierlo in un pallone Erlenmeyer. Aggiungere una spatola piena di solfato di sodio anidro per rimuovere l'acqua residua dall'acetato di etile. Filtrare la soluzione essiccata di acetato di etile attraverso una carta da filtro numero uno per rimuovere il solfato di sodio.Quindi, lavare la carta da filtro con una piccola quantità di acetato di etile. La soluzione filtrata di acetato di etile è stata evaporata a secco su un evaporatore rotativo a pressione ridotta per ottenere masarimicina come olio una volta rimosso tutto l'acetato di etile. Sciogliere l'olio di masarimicina in uno o due millilitri di una soluzione da esano a isopropanolo 9:1 e mescolare su una piastra magnetica fino a quando l'intero composto non è sciolto.Per purificare la masarimicina disciolta, eseguire la cromatografia flash con una colonna flash di silice da 12 grammi, in fase normale. Equilibrare la colonna flash con 10 volumi di colonna di fase mobile con gli strumenti impostati ad una portata di 15 millilitri al minuto. Dopo che l'equilibrio è completo, disegnare la masarimicina disciolta usando una siringa da cinque millilitri.Collegare la siringa direttamente alla parte superiore della colonna flash bilanciata e iniettare la soluzione nella colonna. Ricollegare la colonna caricata al sistema di cromatografia flash e avviare l'eluizione del gradiente. Elute masarimycin dalla colonna utilizzando l'eluizione gradiente ad una concentrazione di fase mobile finale di 10:90 esano a isopropanolo su 12 volumi di colonna.Monitorare l'eluizione di masarimicina attraverso l'assorbimento a 230 e 254 nanometri. Per lo studio della morfologia, coltivare bacillus subtilis 11774 su piastre di agar LB a 37 gradi Celsius. In tutti gli esperimenti successivi, utilizzare cellule di secondo passaggio coltivate in cinque millilitri di brodo LB fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 1.Successivamente, utilizzando una pipetta, aggiungere masarimicina ai tubi di coltura etichettati trattati con una concentrazione finale di 3,8 micromoli. Per i tubi di coltura etichettati come controllo, aggiungere un volume equivalente di DMSO. Posizionare i campioni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 90 minuti con agitazione a 150 RPM.Dopo 90 minuti, fissare chimicamente le colture in una miscela 1:10 di terreni di coltura e fissare il buffer a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, utilizzare una pipetta per applicare da 10 a 20 microlitri dei campioni fissati chimicamente ai vetrini del microscopio di vetro e lasciarli asciugare all'aria. Quindi, fissare a caldo i campioni essiccati all'aria riscaldando i vetrini utilizzando un bruciatore Bunsen.Dopo il fissaggio a caldo, colorare i campioni con 100 microlitri di blu di metilene allo 0,1%. Dopo un'incubazione di 10 minuti con la macchia, lavare via il colorante in eccesso con acqua distillata. Quindi, riscaldare delicatamente i vetrini macchiati a 60 gradi Celsius in un forno per 15-20 minuti per portare le celle su un piano focale comune.Sigillare i campioni macchiati posizionando un coperchio del microscopio sulle cellule macchiate. Quindi, sigillare i bordi usando il cemento del vetrino del microscopio. Posizionare il vetrino del microscopio sigillato sul palco del microscopio e mettere a fuoco l'immagine con un ingrandimento di 100X utilizzando la microscopia a campo luminoso.Posizionare una goccia di olio per immersione sul vetrino del microscopio e mettere a fuoco il campo visivo utilizzando l'ingrandimento 1000X. Acquisire micrografie utilizzando una fotocamera collegata al microscopio e il relativo software associato. Acquisisci immagini utilizzando le impostazioni di bilanciamento automatico del bianco e apertura del software.La cromatografia flash consente una rapida purificazione della masarimicina con elevata purezza. La valutazione della sinergia o dell'antagonismo con l'optochina dell'inibitore dell'ATPasi in S.pneumoniae è presentata qui. La concentrazione più bassa del composto per inibire la crescita batterica, indicata dal colore blu, è considerata il valore minimo di concentrazione inibitoria in presenza di un co-farmaco.Al contrario, i pozzetti con colore rosa indicano la crescita batterica. Saggi fenotipici con masarimicina a 0,75 volte le concentrazioni minime inibitorie hanno dimostrato un fenotipo simile alla salsiccia per B.subtilis e un fenotipo aggregante per S.pneumoniae. Prestare attenzione alla temperatura della reazione.Assicurarsi che la reazione sia completa monitorando con TLC. Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con antibiotici marcati fluorescenti per studiare i cambiamenti alla parete cellulare al microscopio.

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La biosintesi eterologa di eritromicina A...

La logica, passaggi sperimentali, e le potenzialità di eterologa Biosintesi prodotto naturale Con l&#39;antibiotico Eritromicina Complesso A prodotti attraverso<em&gt; E. coli</em

Presentiamo qui un protocollo dettagliato di (A) l'identificazione di un prodotto naturale con attività antibiotica, (B) la purificazione del composto (C) il primo modello della sua biosintesi, (D) sequenziamento del genoma / -mining e ( E) la verifica del cluster genico biosintetico.

Da un prodotto naturale al suo grappolo Biosynthetic Gene: Una dimostrazione che utilizzino Polyketomycin da Streptomyces diastatochromogenes Tü6028

Un protocollo di estrazione del genoma guidato dalla spettrometria di massa è stabilito e descritto qui. Si basa sulle informazioni sulla sequenza genomica e sull'analisi LC-MS/MS e mira a facilitare l'identificazione di molecole da complessi estratti microbici e vegetali.

Mass Spectrometry-Guided Genome Mining come strumento per scoprire nuovi prodotti naturali

Qui, descriviamo un saggio biologico che utilizza 3-(4′,5′-dimetiltiazol-2′-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) per testare le ossime spirocicliche precedentemente sintetizzate.

Sintesi dell'eterociclo spirociclico funzionalizzato e saggio di citotossicità

I composti tiofenesulfonammidici sono potenti e specifici inibitori dei regolatori del quorum sensing del vibrione LuxR/HapR che ne bloccano l'attività in vivo, impedendo così la trascrizione dei geni per la virulenza, la motilità e i biofilm. Questo protocollo descrive in dettaglio come questi composti vengono sintetizzati, modellati in silico e analizzati in vivo per l'attività contro LuxR/HapR.

Sintesi e dosaggio di inibitori del quorum sensing del vibrione

Il lievito di fissione viene utilizzato qui come ospite eterologo per esprimere proteine citoscheletriche batteriche come FtsZ e MreB come proteine di fusione traduzionali con GFP per visualizzare la loro polimerizzazione. Inoltre, i composti che influenzano la polimerizzazione vengono identificati mediante imaging utilizzando un microscopio a fluorescenza.

Il lievito di fissione come piattaforma per lo screening di farmaci antibatterici mirati alle proteine del citoscheletro batterico

Questo studio ha sviluppato un test per lo screening ad alto rendimento contro Mycobacterium abscessus con un ceppo doppio reporter di recente creazione, utilizzando la fluorescenza e la luminescenza per valutare rapidamente la vitalità batterica. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che mirano a selezionare nuovi farmaci contro questo batterio resistente ai farmaci.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Questo protocollo introduce una metodologia di screening fluorometrica ottimizzata per identificare inibitori naturali di prodotti e piccole molecole nella sintesi proteica. La sua praticità lo rende adatto sia all'istruzione triennale sulle tecniche di scoperta di farmaci sia all'applicazione in campagne di chimica medicinale.

Un protocollo basato sulla fluorescenza per lo screening preliminare degli inibitori della sintesi proteica da fonti naturali

Questo protocollo descrive un metodo per produrre e valutare l'attività antimicrobica e la citotossicità del peptide cationico Mel4 e del mimetico dei peptidi RK758. Integrando sintesi chimica, espressione ricombinante e saghi funzionali standardizzati, fornisce un flusso di lavoro semplificato per la produzione e il test di peptidi e mimetici di piccole molecole.

Produzione e test di peptidi antimicrobici e dei loro mimetici

Qui presentiamo un protocollo per identificare potenziali candidati farmaci antitubercolosi tramite screening fenotipico, comprendendo la sintesi chimica di un composto di 4-aminochinolina, la determinazione della sua concentrazione inibitoria minima contro Mycobacterium tuberculosis e la valutazione della sua citotossicità nelle linee cellulari di mammiferi.

Identificazione dei potenziali candidati anti-TB: una guida passo dopo passo alla sintesi, alla determinazione della CIM e alla valutazione della citotossicità nelle cellule di mammiferi

Impara la sintesi di masarimycin per studiare l'inibizione della crescita batterica Gram-positiva con Bacillus subtilis e Streptococcus pneumoniae. Questo protocollo riproducibile utilizza cromatografia su strato sottile e cromatografia flash per purificazione.

Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva

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