Sintesi di Masarimycin, un inibitore di piccole molecole della crescita batterica Gram-positiva

La masarimicina è uno dei pochi inibitori delle autolisine batteriche che arresta la crescita delle cellule batteriche. Può essere utilizzato per indagare le differenze tra inattivazione chimica e genetica delle autolisine e fornisce un approccio ortogonale alla genetica per studiare la fisiologia batterica. La sintesi di masarimicina può sembrare scoraggiante.

Segui attentamente i passaggi mostrati. In caso di dubbio se una fase di reazione ha funzionato, confermare con cromatografia a strato sottile e le variazioni dei valori RF. Per iniziare, preparare una soluzione 0,1-molare di cicloesilammina, cicloesil carbossaldeide, acido orto-iodobenzoico e cicloesil isocianuro in metanolo.

Aggiungere la barra magnetica, quindi, mescolare cinque millilitri di cicloesilammina e cinque millilitri di cicloesile carbossialdeide in un matraccio a fondo tondo coperto e posizionare il matraccio in un bagno di sabbia su un agitatore a piastra calda per 30 minuti a 40 gradi Celsius. Monitorare la temperatura utilizzando un termometro posto a circa un centimetro sotto la superficie della sabbia. Dopo 30 minuti, aggiungere cinque millilitri di isocianuro di cicloesile alla soluzione e mescolare per altri 20 minuti a 50 gradi Celsius.

Quindi, aggiungere cinque millilitri di acido orto-iodobenzoico alla miscela di reazione e continuare a mescolare a 55 gradi Celsius per tre-cinque ore. Dopo tre ore di agitazione, monitorare periodicamente l'avanzamento della reazione mediante cromatografia a strato sottile, o TLC, a intervalli di circa un'ora. Considerare la reazione completa quando solo un punto con un fattore di ritenzione pari a 0,3 è visibile sulla piastra TLC.

Rimuovere il solvente nell'evaporatore rotativo a pressione ridotta. Una volta evaporato tutto il metanolo, sciogliere il prodotto grezzo essiccato in 30 millilitri di acetato di etile e trasferirlo in un imbuto separatore. Estrarre l'acetato di etile in sequenza con acido cloridrico monofusolare, acqua, soluzione di bicarbonato di sodio saturo, acqua di nuovo e soluzione di cloruro di sodio saturo, scartando gli strati acquosi ad ogni estrazione.

Quindi, rimuovere lo strato di acetato di etile dall'imbuto separatore e raccoglierlo in un pallone Erlenmeyer. Aggiungere una spatola piena di solfato di sodio anidro per rimuovere l'acqua residua dall'acetato di etile. Filtrare la soluzione essiccata di acetato di etile attraverso una carta da filtro numero uno per rimuovere il solfato di sodio.

Quindi, lavare la carta da filtro con una piccola quantità di acetato di etile. La soluzione filtrata di acetato di etile è stata evaporata a secco su un evaporatore rotativo a pressione ridotta per ottenere masarimicina come olio una volta rimosso tutto l'acetato di etile. Sciogliere l'olio di masarimicina in uno o due millilitri di una soluzione da esano a isopropanolo 9:1 e mescolare su una piastra magnetica fino a quando l'intero composto non è sciolto.

Per purificare la masarimicina disciolta, eseguire la cromatografia flash con una colonna flash di silice da 12 grammi, in fase normale. Equilibrare la colonna flash con 10 volumi di colonna di fase mobile con gli strumenti impostati ad una portata di 15 millilitri al minuto. Dopo che l'equilibrio è completo, disegnare la masarimicina disciolta usando una siringa da cinque millilitri.

Collegare la siringa direttamente alla parte superiore della colonna flash bilanciata e iniettare la soluzione nella colonna. Ricollegare la colonna caricata al sistema di cromatografia flash e avviare l'eluizione del gradiente. Elute masarimycin dalla colonna utilizzando l'eluizione gradiente ad una concentrazione di fase mobile finale di 10:90 esano a isopropanolo su 12 volumi di colonna.

Monitorare l'eluizione di masarimicina attraverso l'assorbimento a 230 e 254 nanometri. Per lo studio della morfologia, coltivare bacillus subtilis 11774 su piastre di agar LB a 37 gradi Celsius. In tutti gli esperimenti successivi, utilizzare cellule di secondo passaggio coltivate in cinque millilitri di brodo LB fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge 1.

Successivamente, utilizzando una pipetta, aggiungere masarimicina ai tubi di coltura etichettati trattati con una concentrazione finale di 3,8 micromoli. Per i tubi di coltura etichettati come controllo, aggiungere un volume equivalente di DMSO. Posizionare i campioni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per 90 minuti con agitazione a 150 RPM.

Dopo 90 minuti, fissare chimicamente le colture in una miscela 1:10 di terreni di coltura e fissare il buffer a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, utilizzare una pipetta per applicare da 10 a 20 microlitri dei campioni fissati chimicamente ai vetrini del microscopio di vetro e lasciarli asciugare all'aria. Quindi, fissare a caldo i campioni essiccati all'aria riscaldando i vetrini utilizzando un bruciatore Bunsen.

Dopo il fissaggio a caldo, colorare i campioni con 100 microlitri di blu di metilene allo 0,1%. Dopo un'incubazione di 10 minuti con la macchia, lavare via il colorante in eccesso con acqua distillata. Quindi, riscaldare delicatamente i vetrini macchiati a 60 gradi Celsius in un forno per 15-20 minuti per portare le celle su un piano focale comune.

Sigillare i campioni macchiati posizionando un coperchio del microscopio sulle cellule macchiate. Quindi, sigillare i bordi usando il cemento del vetrino del microscopio. Posizionare il vetrino del microscopio sigillato sul palco del microscopio e mettere a fuoco l'immagine con un ingrandimento di 100X utilizzando la microscopia a campo luminoso.

Posizionare una goccia di olio per immersione sul vetrino del microscopio e mettere a fuoco il campo visivo utilizzando l'ingrandimento 1000X. Acquisire micrografie utilizzando una fotocamera collegata al microscopio e il relativo software associato. Acquisisci immagini utilizzando le impostazioni di bilanciamento automatico del bianco e apertura del software.

La cromatografia flash consente una rapida purificazione della masarimicina con elevata purezza. La valutazione della sinergia o dell'antagonismo con l'optochina dell'inibitore dell'ATPasi in S.pneumoniae è presentata qui. La concentrazione più bassa del composto per inibire la crescita batterica, indicata dal colore blu, è considerata il valore minimo di concentrazione inibitoria in presenza di un co-farmaco.

Al contrario, i pozzetti con colore rosa indicano la crescita batterica. Saggi fenotipici con masarimicina a 0,75 volte le concentrazioni minime inibitorie hanno dimostrato un fenotipo simile alla salsiccia per B.subtilis e un fenotipo aggregante per S.pneumoniae. Prestare attenzione alla temperatura della reazione.

Assicurarsi che la reazione sia completa monitorando con TLC. Questo metodo può essere utilizzato in combinazione con antibiotici marcati fluorescenti per studiare i cambiamenti alla parete cellulare al microscopio.