Imaging confocale ad alto rendimento di trimeri spike SARS-CoV-2 coniugati quantum dot per tracciare il legame e l'endocitosi nelle cellule HEK293T

Abbiamo stabilito una tecnologia di piattaforma per LA SARS COVID 2 che può essere applicabile ad altri virus con il riconoscimento e l'ingresso delle cellule mediate da Spike come primo passo nell'infezione virale cellulare. I punti quantici sono luminosi, stabili e la loro superficie può essere funzionalizzata per una varietà di applicazioni cellulari. Usando questo metodo, possiamo visualizzare e misurare l'interiorizzazione di Spike nelle cellule.

Per preparare lo 0,1% BSA. Aggiungere 130 microlitri da 7,5% BSA a 10 millilitri di supporti di imaging in mix. Per una diluizione seriale da 6,1 a tre e triplicato aggiungere 14,26 microlitri di QD Spike a 285,74 microlitri dello 0,1% BSA per ottenere la massima concentrazione di 20 nanomoli.

Quindi aggiungere 100 microlitri di 20 nanomole o QD Spike a 200 microlitri dello 0,1% BSA per creare la seconda illusione di 6,67 nanomole QD Spike. Rimuovere tutti i supporti esauriti da ciascun pozzetto con un aspiratore multicanale, lavare una volta con una pipetta multicanale con 100 microlitri di supporti di imaging per pozzetto, quindi aspirare 100 microlitri del supporto di imaging. Aggiungere 50 microlitri di soluzione QD Spike per pozzetto e incubare la piastra per tre ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Indossando dispositivi di protezione, preparare i supporti di imaging al 4% pfa e allo 0,1% PSA all'interno di un armadio di sicurezza biologico sterile, aspirare 50 microlitri di QD Spike da ciascun pozzo e aggiungere 100 microlitri del 4% di PFA per pozzetto con una pipetta multicanale automatizzata per evitare di asciugare i pozzetti. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte con PBS, preparare il colorante nucleare rosso intenso diluendo la soluzione madre da cinque millimetri a uno a 1000 in PBS, aspirare il PBS e aggiungere nuovamente 50 microlitri di colorante nucleare diluito per pozzetto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi lavare tre volte con PBS, visualizzare la piastra o sigillarla utilizzando un sigillante a piastre per l'imaging successivo.

Conservare il piatto a quattro gradi Celsius. Avviare il software per la piattaforma di imaging. Dopo aver effettuato l'accesso alla piattaforma di imaging, creare un nuovo protocollo di acquisizione selezionando il tipo di piastra come piastra di imaging inferiore trasparente a 96 pareti, selezionare la modalità ottica è diventata focale e l'ingrandimento come 40 volte l'immersione in acqua, selezionare il binning come uno.

Selezionare la modalità per i contrasti facciali digitali, ad esempio il contrasto elevato, per produrre corpi cellulari ben definiti. Scatta un'istantanea per confermare che questa intestazione è appropriata come mostrato nella finestra dell'immagine, seleziona il canale C adatto per l'uso con la linea cellulare ACE2-GFP per visualizzare il traffico ACE2 all'interno della cella. Per creare un canale QD personalizzato, selezionare il menu a discesa triangolo e scegliere l'eccitazione nell'intervallo di 405 nanometri in emissione nell'intervallo 608 nanometri, selezionare un pozzo con un robusto segnale QD citoplasmatico per impostare il tempo di esposizione, la potenza del laser e la posizione di altezza Z.

Verificate se l'altezza predefinita produce un'immagine delle celle nel piano focale desiderato. La posizione Z sarà inferiore per l'endocitosio puntata rispetto alla posizione Z per la membrana plasmatica. Scegli un tempo di esposizione, in genere compreso tra 100 e 300 millisecondi, che produca un'immagine luminosa con livelli di grigio, almeno tre volte superiori al segnale di sfondo.

A 20 nanomole i livelli di grigio dovrebbero essere di circa 6.000 unità atomiche con un tempo di esposizione di 200 millisecondi e una potenza laser dell'80%. Controlla i livelli di grigio facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine prodotta con la funzione di istantanea in ciascun canale e selezionando l'intensità dello spettacolo, quindi fai clic con il pulsante sinistro del mouse sull'oggetto di interesse o sullo sfondo per visualizzare il livello di grigio per quel pixel, regola la potenza del laser per regolare l'intensità degli oggetti di interesse. Salva il protocollo di acquisizione, passa all'esperimento e inserisci il nome della piastra, esegui l'esperimento.

La traslocazione di QD e ACE2 è stata visualizzata utilizzando la microscopia a fluorescenza e una linea cellulare che esprime ACE2-GFP. La segmentazione delle immagini e la successiva analisi sono state eseguite per estrarre parametri rilevanti come il conteggio spot. In primo luogo, i nuclei sono stati segmentati dal canale del marcatore nucleare per creare una popolazione ROI.

Quindi una regione ROI che delinea la cella con segmentato utilizzando il canale ACE2-GFP. Infine, i punti QD 608 Spike sono stati segmentati dalla regione ROI delle celle, i segnali QD e ACE2 internalizzati hanno mostrato una forte co-localizzazione. Un esperimento di risposta alla concentrazione con sei diverse concentrazioni di QD Spike è stato eseguito in cellule HEK 293T.

Determinando le concentrazioni ottiche di QD, QDS può essere utilizzato a partire da 2,22 nanomole, tuttavia, si consiglia di utilizzare concentrazioni di 10 nanomole o superiori per garantire una risposta robusta. Durante la coniugazione alla proteina QD può verificarsi l'aggregazione. Gli aggregati sono stati individuati nella soluzione QD come precipitati aggregati luminosi e cellule HEK 293T, i QD sono stati incubati con anticorpi neutralizzati a partire da 30 microgrammi per microlitro prima che l'aggiunta alle cellule, questi anticorpi bloccassero l'internalizzazione del legame e causassero una riduzione del numero di spot rispetto alle cellule trattate solo con QD.

Questo saggio può anche essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento, la valutazione del piombo degli anticorpi neutralizzanti per identificare gli antivirali del gioco di parole per l'ingresso virale di blocco ed essere adattato per studiare le nuove varianti emergenti.