Name: Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-11T13:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: Scopri come generare mutanti nulli di Aeromonas per studiare il ruolo delle glicosiltransferasi nella glicosilazione dei flagelli e nella patogenesi batterica. Questo metodo combina saggi di motilità e purificazione dei flagelli.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio Nazionale delle Ricerche Canada, per il Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spagna) e per la Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il primo passo critico di questo metodo è l'identificazione delle regioni coinvolte nella glicosilazione dei flagelli e dei presunti GT perché questi enzimi mostrano un'elevata omologia e sono coinvolti in molti processi. L'analisi bioinformatica dei genomi di Aeromonas in database pubblici mostra che questa regione è adiacente alla regione dei flagelli polari 2, che contiene i geni flagellina in molti ceppi e contiene geni coinvolti nella biosintesi dell'acido pseudaminico27. Ciò ha perm...

La glicosilazione proteica è stata descritta sia nei batteri Gram-positivi che gram-negativi e consiste nell'attaccamento covalente di un glicano a una catena laterale di amminoacidi 1,2. Nei procarioti, questo processo di solito avviene attraverso due principali meccanismi enzimatici: O- e N-glicosilazione 3. Nella O-glicosilazione, il glicano è attaccato al gruppo ossidrile di un residuo di serina (Ser) o treonina (Thr). Nella N-glicosilazione, il glicano è attaccato all'azoto ammidico della catena laterale di un residuo di asparagina (Asn) all'interno delle sequenze tripeptidiche Asn-X-Ser/Thr, dove X potrebbe essere qualsiasi amminoacido tranne la prolina.
I glicani possono adottare strutture lineari o ramificate e sono composti da monosaccaridi o polisaccaridi legati covalentemente da legami glicosidici. Nei procarioti, i glicani di solito mostrano diversità nella composizione e nella struttura dello zucchero rispetto ai glicani eucariotici4. Inoltre, sono state descritte due diverse vie di glicosilazione batterica che differiscono nel modo in cui il glicano viene assemblato e trasferito alla proteina accettore: glicosilazione sequenziale e in blocco 5,6. Per la glicosilazione sequenziale, il glicano complesso viene costruito direttamente sulla proteina mediante successiva aggiunta di monosaccaridi. Nella glicosilazione in blocco, un glicano preassemblato viene trasferito alla proteina da un oligosaccaride legato ai lipidi da una oligosaccarilstransferasi specializzata (OTasi). Entrambe le vie hanno dimostrato di essere coinvolte nei processi di N- e O-glicosilazione 7.
La glicosilazione proteica ha un ruolo nella modulazione delle proprietà fisico-chimiche e biologiche delle proteine. La presenza di un glicano può influenzare il modo in cui la proteina interagisce con il suo ligando, che influenza l'attività biologica della proteina, ma può anche influenzare la stabilità proteica, la solubilità, la suscettibilità alla proteolisi, l'immunogenicità e le interazioni microbo-ospite 8,9. Tuttavia, diversi parametri di glicosilazione, come il numero di glicani, la composizione del glicano, la posizione e il meccanismo di attaccamento, potrebbero anche influenzare la funzione e la struttura delle proteine.
Le glicosiltransferasi (GT) sono gli enzimi chiave nella biosintesi di glicani complessi e glicoconiugati. Questi enzimi catalizzano la formazione del legame glicosidico tra una porzione di zucchero da una molecola di donatore attivata e uno specifico accettore di substrato. I GT possono utilizzare sia nucleotidi che non nucleotidi come molecole donatrici e colpire diversi accettori di substrato, come proteine, saccaridi, acidi nucleici e lipidi10. Pertanto, comprendere le GT a livello molecolare è importante per identificare i loro meccanismi d'azione e specificità, e consente anche di capire come la composizione zuccherina dei glicani che modificano le molecole rilevanti sia correlata alla patogenicità. Il database degli enzimi Carboidrati Attivi (CAZy)11 classifica i GT in base alla loro omologia di sequenza, che fornisce uno strumento predittivo poiché, nella maggior parte delle famiglie GT, la piega strutturale e i meccanismi d'azione sono invarianti. Tuttavia, quattro ragioni rendono difficile prevedere la specificità del substrato di molti GT: 1) nessun chiaro motivo di sequenza che determini la specificità del substrato è stato determinato nei procarioti12, 2) molte GT e OT mostrano promiscuità del substrato13,14, 3) le GT funzionali sono difficili da produrre ad alta resa in forma ricombinante e 4) l'identificazione dei substrati sia del donatore che dell'accettore è complessa. Nonostante ciò, recenti studi di mutagenesi hanno permesso di ottenere progressi significativi nella comprensione dei meccanismi catalitici e di sottrarre il legame delle GT.
Nei batteri, l'O-glicosilazione sembra essere più diffusa della N-glicosilazione. I siti di O-glicosilazione non mostrano una sequenza di consenso e molte delle proteine O-glicosilate sono secrete o proteine della superficie cellulare, come flagelline, pili o autotrasportatori1. La glicosilazione della flagellina mostra variabilità nel numero di siti accettori, nella composizione e nella struttura del glicano. Ad esempio, Burkholderia spp flagellins ha un solo sito accettore, mentre in Campylobacter jejuni, flagellins ha ben 19 siti accettori15,16. Inoltre, per alcuni batteri, il glicano è un singolo monosaccaride, mentre altri batteri possiedono glicani eterogenei compromessi da diversi monosaccaridi per formare oligosaccaridi. Questa eterogeneità si verifica anche tra ceppi della stessa specie. Le flagelline di Helicobacter sono modificate solo dall'acido pseudaminico (PseAc)17 e le flagelline di Campylobacter possono essere modificate da PseAc, la forma acetamidino dell'acido pseudaminico (PseAm) o dell'acido legionaminico (LegAm), e dai glicani derivati da questi zuccheri con acetil, N-acetilglucosamina o sostituzioni propioniche 18,19. In Aeromonas, le flagelline sono modificate dai glicani la cui composizione varia da un singolo derivato dell'acido PseAc a un eteropolisaccaride20, e l'attaccamento dei glicani ai monomeri della flagellina avviene sempre tramite un derivato PseAc.
In generale, la glicosilazione delle flagelline è essenziale per l'assemblaggio del filamento flagellare, la motilità, la virulenza e la specificità dell'ospite. Tuttavia, mentre flagellins di C. jejuni16, H. pylori17 e Aeromonas sp. 21 non può essere assemblato in filamento a meno che i monomeri proteici non siano glicosilati, Pseudomonas spp. e Burkholderia spp. 15 non richiedono glicosilazione per l'assemblaggio dei flagelli. Inoltre, in alcuni ceppi di C. jejuni, i cambiamenti nella composizione zuccherina del glicano flagello influenzano l'interazione batterico-ospite e possono svolgere un ruolo nell'eludere alcune risposte immunitarie16. L'autoagglutinazione è un'altra caratteristica fenotipica influenzata dalle modifiche nella composizione dei glicani associati alle flagelline. Una minore autoagglutinazione porta ad una riduzione della capacità di formare microcolonie e biofilm22. In alcuni batteri, la capacità dei flagelli di innescare una risposta pro-infiammatoria era legata alla glicosilazione della flagellina. Pertanto, in P. aeruginosa, la flagellina glicosilata induce una risposta pro-infiammatoria più elevata rispetto a23 non glicosilata.
Aeromonas sono batteri Gram-negativi onnipresenti nell'ambiente, che consente loro di essere all'interfaccia di tutti i componenti One Health 24. Gli Aeromonas mesofili hanno un singolo flagello polare, che è prodotto costitutivamente. Più della metà degli isolati clinici esprime anche flagellina laterale, inducibile in mezzi o piastre ad alta viscosità. Diversi studi hanno correlato entrambi i tipi di flagelli con le prime fasi della patogenesi batterica25. Mentre le flagelline polari riportate fino ad oggi sono O-glicosilate a 5-8 residui di Ser o Thr dei suoi domini immunogenici centrali, le flagelline laterali non sono O-glicosilate in tutti i ceppi. Sebbene i glicani flagella polari di diversi ceppi mostrino diversità nella loro composizione di carboidrati e lunghezza della catena20, lo zucchero di collegamento ha dimostrato di essere un derivato dell'acido pseudaminico.
L'obiettivo di questo manoscritto è quello di descrivere un metodo per ottenere mutanti nulli in specifici GT o regioni cromosomiche contenenti GT per analizzare il loro coinvolgimento nella biosintesi di polisaccaridi rilevanti e nella patogenicità batterica, nonché il ruolo del glicano stesso. Ad esempio, identifichiamo ed eliminiamo una regione cromosomica contenente GT di Aeromonas per stabilire il suo coinvolgimento nella glicosilazione della flagellina polare e analizzare il ruolo del glicano flagellino. Mostriamo come eliminare un GT specifico per stabilirne la funzione nella biosintesi di questo glicano e il ruolo del glicano modificato. Sebbene si utilizzi Aeromonas come esempio, il principio può essere utilizzato per identificare e studiare le isole di glicosilazione dei flagelli di altri batteri Gram-negativi e analizzare la funzione dei GT coinvolti nella biosintesi di altri glicani come il lipopolisaccaride dell'antigene O.

<table><tbody><tr><td>ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Kit di reazione pronto per il sequenziamento del ciclo</td><td>Biosystems Applied Biosystems</td><td></td><td>4337455 Utilizzato per il sequenziamento AccuPrime</td></tr><tr><td>Taq DNA polimerasi, alta fedeltà</td><td>Invitrogen</td><td>12346-086</td><td>Utilizzato per l'amplificazione di frammenti AB, CD e AD</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Conda-Pronadise</td><td>8008</td><td>Utilizzato per l'elettroforesi del DNA</td></tr><tr><td>Fosfatasi alcalina, intestino di vitello (CIAP)</td><td>Promega</td><td>M1821</td><td>Utilizzato per rimuovere il fosfato all'estremità 5'</td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>Utilizzato per l'analisi della motilità</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Promega</td><td>R6021</td><td>Utilizzato per la restrizione endonucleasica</td></tr><tr><td>BglII</td><td>Promega</td><td>R6081</td><td>Utilizzato per la restrizione endonucleasica</td></tr><tr><td>BioDoc-It Imagin System</td><td>UVP</td><td></td><td>Stazione di bio-imaging utilizzato per la visualizzazione del DNA</td></tr><tr><td>Biotaq polimerasi</td><td>Bioline</td><td>BIO-21040</td><td>Utilizzato per lo screening delle colonie</td></tr><tr><td>Cloruro di cesio</td><td>Applichem</td><td>A1126,0100</td><td>Utilizzato per la purificazione dei flagelli</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Applichem</td><td>A1806,0025</td><td>Utilizzato per l'accoppiamento triparentale</td></tr><tr><td>Cytiva illustra GFX PCR DNA e kit di purificazione della banda in gel</td><td>Cytivia</td><td>28-9034-71</td><td>Utilizzato per la purificazione di ampliconi PCR e frammenti di DNA.</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>131026.1211</td><td>Utilizzato per l'elettroforesi del DNA</td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione 2 mm gap</td><td>VWR</td><td>732-1133</td><td>Utilizzato per la trasformazione</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Applichem</td><td>A1152,0025</td><td>Utilizzare per la visualizzazione del DNA</td></tr><tr><td>HyperLadder 1 Kb marcatore</td><td>Bioline</td><td>BIO-33053</td><td>Marcatore DNA</td></tr><tr><td>Invitrogen Easy-DNA gDNA Kit</td> <td>di purificazioneInvitrogen</td><td>10750204</td><td>Utilizzato per la purificazione del DNA cromosomico batterico</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Miller agar</td><td>Condalab</td><td>996</td><td>Utilizzato per Escherichia coli colture</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) Brodo Miller</td><td>Condalab</td><td>1551</td><td>Utilizzato per Escherichia coli coltura</td></tr><tr><td>Nanodrop ND-1000</td><td>NanoDrop Techonologies Inc</td><td></td><td>Spettrofotometro utilizzato per la quantificazione del DNA</td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Applichem</td><td>A2220,0005</td><td>Utilizzato per l'accoppiamento triparentale</td></tr><tr><td>SOC Medium</td><td>Invitrogen</td><td>15544034</td><td>Utilizzato per il recupero dell'elettroporazione</td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Applichem</td><td>A3834,0005</td><td>Utilizzato per l'accoppiamento triparentale</td></tr><tr><td>SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor</td><td>Beckman</td><td>331362</td><td>Utilizzato per la purificazione</td></tr> <tr>dei flagelli<td>T4 DNA ligasi</td><td>Invitrogen</td><td>15224017</td><td>Utilizzato per la reazione di legatura</td></tr><tr><td>Tripticaseina agar di soia</td><td>Condalab</td><td>1068</td><td>Utilizzato per Aeromonas</td></tr><tr><td>Tripticaseina coltivata Brodo di soia</td><td>Condalab</td><td>1224</td><td>Utilizzato per Aeromonas Triptone coltivato</td></tr><tr><td></td><td>Condalab</td><td>1612</td><td>Utilizzare per l'analisi della motilità</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Applichem</td><td>A2264,0500</td><td>Utilizzato per l'elettroforesi del DNA e la purificazione dei flagelli</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Applichem</td><td>A4975,0100</td><td>Utilizzato per la lisi batterica</td></tr><tr><td>Provette ultra trasparenti (14 mm x 89 mm)</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td>Utilizzato per la purificazione dei flagelli</td></tr><tr><td>Veriti 96 well Thermal Cycler</td><td>Biosistemi</td><td></td> applicati <td>Utilizzato per le reazioni di PCR</td></tr><tr><td>Zyppy Plasmid Miniprep II Kit</td><td>Zymmo research</td><td>D4020</td><td>Utilizzato per l'isolamento del DNA plasmidico</td></tr></tbody></table>

generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility

Lo studio della glicosilazione nei procarioti è un'area in rapida crescita. I batteri ospitano diverse strutture glicosilate sulla loro superficie i cui glicani costituiscono un codice a barre specifico del ceppo. I glicani associati mostrano una maggiore diversità nella composizione e nella struttura dello zucchero rispetto a quelli degli eucarioti e sono importanti nei processi di riconoscimento batterico-ospite e nell'interazione con l'ambiente. Nei batteri patogeni, le glicoproteine sono state coinvolte in diverse fasi del processo infettivo e le modificazioni del glicano possono interferire con le funzioni specifiche delle glicoproteine. Tuttavia, nonostante i progressi compiuti nella comprensione della composizione, della struttura e delle vie di biosintesi del glicano, la comprensione del ruolo delle glicoproteine nella patogenicità o nell'interazione con l'ambiente rimane molto limitata. Inoltre, in alcuni batteri, gli enzimi necessari per la glicosilazione proteica sono condivisi con altre vie biosintetiche dei polisaccaridi, come il lipopolisaccaride e le vie biosintetiche delle capsule. L'importanza funzionale della glicosilazione è stata chiarita in diversi batteri attraverso la mutazione di geni specifici ritenuti coinvolti nel processo di glicosilazione e lo studio del suo impatto sull'espressione della glicoproteina bersaglio e del glicano modificante. Gli Aeromonas mesofili hanno un flagello polare singolo e O-glicosilato. I glicani flagellari mostrano diversità nella composizione dei carboidrati e nella lunghezza della catena tra i ceppi di Aeromonas . Tuttavia, tutti i ceppi analizzati fino ad oggi mostrano un derivato dell'acido pseudaminico come lo zucchero di collegamento che modifica i residui di serina o treonina. Il derivato dell'acido pseudaminico è necessario per l'assemblaggio dei flagelli polari e la sua perdita ha un impatto sull'adesione, sulla formazione di biofilm e sulla colonizzazione. Il protocollo dettagliato in questo articolo descrive come la costruzione di mutanti nulli può essere utilizzata per comprendere il coinvolgimento di geni o regioni del genoma contenenti glicosiltransferasi putative nella biosintesi di un glicano flagellare. Ciò include il potenziale per comprendere la funzione delle glicosiltransferasi coinvolte e il ruolo del glicano. Ciò sarà ottenuto confrontando il mutante carente di glicano con il ceppo wild-type.

Questa metodologia fornisce un sistema efficace per generare mutanti nulli in geni o regioni cromosomiche di Aeromonas che possono influenzare la glicosilazione dei flagelli e il ruolo del filamento flagello (Figura 1).
Il protocollo inizia con l'identificazione bioinformatica delle FGI putative e dei geni che codificano per le GT presenti in questa regione. In Aeromonas, la posizione cromosomica delle FGI si basa sulla rilevazione di tre tipi di...

Qui, descriviamo la costruzione di mutanti nulli di Aeromonas in specifiche glicosiltransferasi o regioni contenenti glicosiltransferasi, i saggi di motilità e la purificazione dei flagelli eseguiti per stabilire il coinvolgimento e la funzione dei loro enzimi codificati nella biosintesi di un glicano, nonché il ruolo di questo glicano nella patogenesi batterica.

Generazione di mutanti nulli per chiarire il ruolo delle glicosiltransferasi batteriche nella motilità batterica

The study of glycosylation in prokaryotes is a rapidly growing area. Bacteria harbor different glycosylated structures on their surface whose glycans ...

Quindi i derivati dell'acido neurminico sono presenti solo nei batteri patogeni, i flagelli aminiglycosilati contengono questo zucchero. Nella delezione della regione contenuta nei geni può aiutare a trovare i cluster di glicosilazione dei flagelli. Questa tecnica, l'ultima regione specifica o geni, come le glicosiltransferasi che hanno un'alta omologia tra loro e sono coinvolti in diversi processi, e analizza il suo coinvolgimento nel processo di glicosilazione dei flagelli.Questa tecnica può anche aiutare a trovare il ruolo delle glicosiltransferasi coinvolte nella biosintesi dei polisaccaridi rilevanti nei batteri patogeni e anche il ruolo delle proteine che codificano i geni coinvolte nella formazione dei flagelli. A dimostrare la procedura sarà Maite Polo, un tecnico del mio laboratorio. Progettare due coppie di primer che amplifichino le regioni del DNA a monte e a valle del gene o della regione selezionata da eliminare.I primer A e D devono includere all'estremità primaria cinque, un sito di restrizione per un'endonucleasi che consenta la clonazione in pDM4. Assicurarsi che i primer B e C siano all'interno del gene da eliminare o all'interno del primo e dell'ultimo gene della regione da eliminare. Assicurarsi che entrambi i primer siano nel frame e situati tra cinque e sei codoni all'interno del gene.Assicurarsi che entrambi i primer includano una sequenza complementare di 21 coppie di basi alle cinque estremità prime per unire gli ampliconi del DNA AB e CD.Utilizzare 100 nanogrammi di DNA cromosomico purificato come modello in due serie di PCR asimmetriche con primer AB e CD seguite dall'analisi dei prodotti risultanti in gel di agarosio all'1%. Purificare e quantificare gli ampliconi asportati dal gel elettroforetico. Mescolare 100 nanogrammi di ciascun amplicon con reagenti PCR senza primer.Dopo averlo esteso, aggiungi primer A e D e amplificali come un singolo frammento. Successivamente analizzare, purificare e quantificare i prodotti risultanti come precedentemente descritto. Digerire un microgrammo di pDM4 e 400 nanogrammi di AD amplicon con un'endonucleasi.Combinare il pDM4 digerito con l'amplicon AD in un vettore molare per inserire un rapporto da uno a quattro e preparare la reazione di legatura. Incubare durante la notte a 20 gradi Celsius. Successivamente, inattivare T4 ligasi a 70 gradi Celsius per 20 minuti.Inoculare il ceppo di Escherichia coli nel brodo di Luria Bertani Miller e incubare a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 RPM fino a quando non si osserva una densità ottica compresa tra 0,4 e 0,6. Pellet la coltura batterica mediante centrifugazione a 5.000 volte G e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Sospendere il pellet in acqua distillata refrigerata e ripetere il processo di pulizia altre due volte.Trasferire la sospensione batterica in tubi di microfuga e ripetere la centrifugazione a 14.000 volte G e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver risospeso il pellet in acqua refrigerata, aggiungere circa 3,5 microlitri della miscela di legatura e incubare sul ghiaccio per cinque minuti. Trasferire il contenuto in una cuvetta elettroporatoria refrigerata a due millimetri.Dopo l'elettroporazione aggiungere il mezzo SOC e trasferire il contenuto in un tubo di coltura. Incubare per un'ora a 30 gradi Celsius con agitazione a 200 RPM. Placcare le cellule trasformate su piastre di agar LB integrate con cloramfenicolo.Controllare l'inserimento del costrutto di eliminazione in pDM4 mediante PCR utilizzando primer che fiancheggiano il lato di clonazione pDM4. Preparare colture notturne in modo che il destinatario Aeromonas proponga resistente alla rifampicina e due diversi ceppi di Escherichia coli. Il ceppo donatore con il plasmide ricombinante pDM4 e il ceppo helper con il plasmide PRK 2073 a 30 gradi Celsius.Sospendere lo stesso numero di colonie dei ceppi donatore, ricevente e aiutante in tre tubi LB con 150 microlitri di LB. Quindi su una piastra di agar LB senza antibiotici mescolare le tre sospensioni batteriche in due gocce in un ricevente per aiutare il rapporto donatore di cinque a uno a uno, e incubare la piastra rivolta verso l'alto durante la notte a 30 gradi Celsius. Raccogli i batteri aggiungendo un millilitro di brodo LB alla piastra di agar LB. Trasferire la sospensione batterica in un tubo conico da 1,5 millilitri per microfughe e vortici vigorosamente.Distribuire 100 microlitri della sospensione batterica su piastre di agar LB con rifampicina e cloramfenicolo. Spin down 200 microlitri e 600 microlitri dei campioni, sospendere il pellet in 100 microlitri di brodo LB e piastra su LB agar con rifampicina e cloramfenicolo seguita da incubazione. Eseguire un test ossidasi per confermare che le colonie sono Aeromonas.Confermare ulteriormente l'inserimento del plasmide ricombinante pDM4 nella regione cromosomica specifica mediante PCR utilizzando i primer E e F. Coltiva le colonie ricombinanti in due millilitri di LB con il 10% di saccarosio e senza antibiotici durante la notte a 30 gradi Celsius. Dopo aver preparato diverse diluizioni di coltura, piastra 100 microlitri delle colture batteriche e diluizioni su piastra lb agar con 10% di saccarosio e incubare durante la notte a 30 gradi Celsius.Il giorno dopo, raccogliere le colonie e trasferirle in piastre LB con e senza cloramfenicolo. Dopo averli incubati durante la notte a 30 gradi Celsius, selezionare le colonie sensibili al cloramfenicolo. Analizzare le colonie sensibili mediante PCR utilizzando la coppia di primer EF e selezionare le colonie il cui prodotto PCR è correlato alla dimensione del costrutto eliminato.Metti una piccola goccia di silicone nei quattro angoli della diapositiva di copertura e monta la cultura coltivata durante la notte di Aeromonas su una diapositiva di copertura. Posizionare una diapositiva scavata sulla diapositiva di copertura e capovolgere la diapositiva. Analizzare la motilità del nuoto al microscopio ottico utilizzando un microscopio ottico, quindi trasferire tre microlitri della coltura sul centro di una piastra di agar morbida.Incubare la piastra rivolta verso l'alto durante la notte tra 25 e 30 gradi Celsius. Usando un righello alla fine dell'incubazione, misurare la migrazione batterica dal centro della piastra verso la periferia attraverso l'agar. Cultura Aeromonas ceppi durante la notte in 900 millilitri TSB tra 25 e 30 gradi Celsius.Dopo la centrifugazione, sospendere il pellet in 20 millilitri di tampone trizolare di acido cloridrico da 100 millimolari di pH 7,8. Per rimuovere i flagelli ancorati, versare la sospensione in un vortice con una barra di vetro per tre o quattro minuti, quindi passare ripetutamente attraverso una siringa calibro 21. Pellet i batteri con due centrifugazioni consecutive a quattro gradi Celsius e raccogliere il surnatante in un tubo separato.Dopo aver ultracentrifugato il surnatante, sospendere il pellet in 150 microlitri di 100 millimolari tris acido cloridrico contenenti due tamponi EDTA millimolari. Trasferire 150 microlitri della frazione arricchita di flagelli in un tubo ultra chiaro a pareti sottili e riempirlo con 12 millilitri di soluzione di cloruro di cesio. Ultracentrifugare il tubo a 60.000 volte G per 48 ore a quattro gradi Celsius in un rotore a benna oscillante.Raccogliere la banda del flagello nel gradiente del cloruro di cesio con una siringa e dializzare contro 100 millimolari di cloruro di idrogeno Tris più due EDTA millimolari seguiti da analisi mediante elettroforesi e colorazione blu di Coomassie o spettrometria di massa. Nella figura seguente, la corsia WT è Aeromonas piscicola AH3. Le corsie da uno a otto mostrano colonie sensibili al cloramfenicolo della seconda ricombinazione.ST è un marcatore iper vescicale da 1 KB. Le corsie da uno a tre e da cinque a otto mostrano le colonie con gene FGI4 di tipo selvaggio come lane WT. La corsia quattro mostra una colonia con il gene FGI4 cancellato. I saggi al microscopio ottico hanno mostrato che le modifiche dei flagelli polari o laterali portano solo a riduzioni dei diametri di migrazione, quindi i mutanti AH-3 FGI e AH-3 FGI-4 mostrano solo una ridotta motilità in relazione al ceppo wild type.La figura mostra il flagello polare da AH-3 della corsia uno, e i non mutanti nella regione FGI della corsia due e il gene FGI-4 della corsia tre, in cui entrambi i mutanti hanno flagelline polari con peso molecolare inferiore rispetto al ceppo wild type, il che suggerisce alterazioni nel glicano flagello. È importante assicurarsi che le mutazioni non influenzino i geni a valle e portino all'incapacità all'assemblaggio dei flagelli o all'incapacità dei filamenti di flagelli. Quando il cambiamento nelle proteine della flagellina non è rilevabile, è necessaria l'analisi della spettrometria di massa utilizzando la proteina totale dei peptidi flagellina per conoscere la massa glicanica.

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