Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish
28 dicembre 2021
Qui, abbiamo usato la colorazione rosso alizarina per dimostrare che l'esposizione all'acetato di piombo provoca un cambiamento di massa ossea nelle larve di zebrafish. Questo metodo di colorazione può essere adattato allo studio della perdita ossea nella perdita di larve di zebrafish indotta da altre sostanze tossiche pericolose.
Questo metodo può aiutare a rilevare la tossicità ossea indotta dalle sostanze chimiche nel pesce zebra. La colorazione rosso alizarina del tessuto fisso genera una registrazione permanente dei cambiamenti scheletrici che può facilitare il confronto di diversi campioni. Questa tecnica potrebbe essere utile per studiare l'osteoporosi nel modello zebrafish, poiché una delle caratteristiche dell'osteoporosi è la diminuzione della massa ossea.
Rimuovere 10 larve di zebrafish a caso da ciascun gruppo a nove giorni dopo la fecondazione e fissare il pesce in un millilitro di aldeide paraforme al 2% e 1X PBS per due ore. Decantare la soluzione e lavare la larva di zebrafish usando 100 millimolari Tris HCL con un pH di 7,5 o 10 millimolari di cloruro di magnesio. Per decolorare, decantare la soluzione e incubare la larva per cinque minuti in una serie di soluzioni come descritto nel manoscritto.
Dopo l'incubazione finale, decantare la soluzione e rimuovere il pigmento sbiancando con una soluzione composta da perossido di idrogeno al 3% e idrossido di potassio allo 0,5%. Osservare una volta ogni 10 minuti fino a quando il pigmento non viene completamente rimosso. Risciacquare la larva di zebrafish più volte con glicerina al 25%, idrossido di potassio allo 0,1% per 10 minuti ciascuno fino a quando non ci sono bolle.
Macchia nella larva immergendo in un millilitro di 0,01% di alizarina. Decantare la soluzione e aggiungere un millilitro di glicerina al 50% o idrossido di potassio allo 0,1% per cancellare lo sfondo. Conservare il pesce in 50% di glicerina fresca o idrossido di potassio allo 0,1% per la successiva osservazione.
Trasferire una larva alla volta sul vetrino mantenendo la larva al centro della goccia di liquido. Osserva la larva sotto uno stereomicroscopio. Accendere la fotocamera.
Aprire il software e mantenere le impostazioni predefinite. Clicca su AE e scegli un tempo di esposizione appropriato per ottenere l'immagine migliore. Cattura tutte le immagini con le stesse impostazioni.
Salvate le immagini in formato dot tiff per un'analisi successiva. Fare doppio clic sull'icona imageJ. Per analizzare le immagini salvate, fare clic su file, quindi aprire, quindi fare clic sull'immagine, quindi digitare e selezionare otto bit.
Fare clic su modifica e invertire. Fare clic su Analizza, quindi calibrare. Selezionare OD non calibrato nell'interfaccia pop-up.
Controllare la calibrazione globale nella parte inferiore sinistra dell'interfaccia inferiore e fare clic su OK. Fare clic su analizza, impostare la scala, quindi rimuovere la scala. Controlla globale di seguito e fai clic su OK.
Fare clic su analizza, quindi impostare le misurazioni. Seleziona l'area dell'elemento nell'interfaccia pop-up. Controllare il limite alla soglia riportato di seguito per misurare solo l'intervallo selezionato e fare clic su OK.
Fai clic sull'immagine, regola, quindi sulla soglia e fai scorrere il cursore al centro dell'interfaccia pop-up. Selezionare la soglia appropriata in modo che vengano selezionate tutte le destinazioni da testare in un'immagine. E fai clic su imposta.
Fare clic su analizzare, quindi misurare, salvare le date. La colorazione rosso alizarina è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish. A nove giorni dalla fecondazione, molte ossa dello scheletro della testa come parasfenoide, opercolare, ceratobranchiale e notocorda sono mineralizzate e quindi colorate di rosso.
Al contrario, le strutture non ossee come gli otoliti, appaiono marrone nero. L'analisi digitale eseguita per quantificare l'area totale colorata, ha mostrato una significativa diminuzione dell'area colorata per i gruppi di trattamento con acetato di piombo da 10 e 20 milligrammi per litro. I cambiamenti nella mineralizzazione ossea hanno mostrato una dipendenza dalla dose.
Per un migliore effetto di colorazione e osservazione, è importante rimuovere il pigmento originale delle larve di zebrafish e rimuovere le bolle dopo lo sbiancamento.
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Panoramica
Questo studio utilizza la colorazione con rosso alizarina per dimostrare che l'esposizione all'acetato di piombo provoca alterazioni della massa ossea nei larve di zebrafish. Il metodo è adattabile per lo studio della perdita ossea causata da diversi tossici pericolosi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tossicologia
- Biologia dello sviluppo
Sfondo
- La colorazione con rosso alizarina è una tecnica utilizzata per visualizzare le strutture scheletriche.
- Il pesce zebra è un organismo modello per lo studio dello sviluppo osseo e della tossicità.
- Si sa che l'acetato di piombo ha effetti tossici sui sistemi biologici.
- L'osteoporosi è caratterizzata da una riduzione della massa ossea, condizione che può essere modellata nel pesce zebra.
Scopo dello studio
- Valutare l'impatto dell'acetato di piombo sulla massa ossea nei larve di pesce zebra.
- Stabilire un metodo per rilevare la tossicità ossea indotta da sostanze chimiche.
- Facilitare il confronto tra modifiche dello scheletro in diversi campioni.
Metodi Utilizzati
- Colorazione con rosso alizarina di tessuti di pesce zebra fissati.
- Fissazione delle larve di pesce zebra in paraformaldeide e PBS.
- Lavaggio delle larve con Tris HCl o cloruro di magnesio.
- Procedure di decolorazione come descritte nel manoscritto.
Risultati principali
- L'esposizione all'acetato di piombo ha determinato cambiamenti osservabili nella massa ossea.
- Il metodo di colorazione ha fornito una registrazione permanente dei cambiamenti dello scheletro.
- I risultati sostengono l'uso del pesce zebra come modello per lo studio dell'osteoporosi.
- La metodologia consente l'indagine su altri agenti tossici pericolosi.
Conclusioni
- La colorazione con rosso alizarina è efficace per valutare la tossicità ossea nel pesce zebra.
- Lo studio evidenzia il potenziale del pesce zebra nella ricerca tossicologica.
- Ulteriori ricerche possono approfondire gli effetti di vari tossicanti sulla salute ossea.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
Questo metodo consente la rilevazione precoce della perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di pesce zebra, supportando la riduzione del rischio meccanicistica in tossicologia e la validazione degli obiettivi per le vie metaboliche legate alla salute scheletrica. Quantificando le variazioni nei tessuti mineralizzati mediante colorazione con rosso alizarina, fornisce un’osservazione riproducibile e dipendente dalla dose per valutare gli effetti dei composti sulla mineralizzazione ossea. L’approccio favorisce una previsione affidabile nell’ottimizzazione dei composti principali e nel controllo preclinico della sicurezza per composti attivi sul tessuto osseo.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche relative alla mineralizzazione ossea e all'integrità scheletrica.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico fornendo un registro permanente e quantificabile dei cambiamenti scheletrici tra i diversi campioni.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio identificando precocemente composti con effetti dose-dipendenti sulla massa ossea durante la fase di scoperta.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni quantitative basate su soglia dell'area colorata per un confronto oggettivo tra gruppi sottoposti a diversi trattamenti.
- Valore operativo: Standardizza le procedure di preparazione del campione e di acquisizione delle immagini per garantire riproducibilità e scalabilità in formati a multi-pozzetto.
- Prontezza del saggio: Genera output digitali compatibili con l'analisi tramite ImageJ, consentendo lo screening ad alto contenuto di fenotipi di tossicità ossea.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Modella le risposte scheletriche rilevanti per l'uomo ai tossicanti, supportando l'allineamento traslazionale dei biomarcatori per la perdita ossea.
- Valore operativo: Collega le fasi di scoperta e preclinica fornendo un saggio conservato, basato su vertebrati, per la mineralizzazione ossea.
- Contenimento del rischio: Informa le decisioni di avanzamento con adeguamento del rischio rilevando segnali di perdita ossea prima degli studi su mammiferi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica della sicurezza, in particolare per composti con possibili effetti fuori bersaglio sui sistemi scheletrici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sugli effetti chimici nelle vie di sviluppo e mineralizzazione ossea in un modello vertebrale.
- Screening: Permette la standardizzazione dei saggi e letture quantitative per rilevare variazioni dipendenti dalla dose nell'area colorata.
- Analisi: Fornisce misurazioni d'area calibrate e basate su soglie che consentono il confronto statistico della mineralizzazione ossea tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando risposte scheletriche conservate a tossici nei larve di zebrafish.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per lo screening di diverse librerie chimiche finalizzato all'identificazione di potenziali tossicità ossee.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica nei percorsi correlati alle ossa.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la scalabilità attraverso passaggi standardizzati di fissazione, colorazione e quantificazione digitale.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di proseguimento/cessazione fornendo segnali precoci e quantitativi di rischio di perdita ossea.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione basata sul rischio identificando i rischi di tossicità scheletrica prima di investimenti significativi.
Considerazioni relative all'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dei zebrafish, nell'istologia e nell'analisi di immagini fluorescenti/colorimetriche.
- Dipende dalla microscopia stereoscopica e da software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ) per una quantificazione standardizzata.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro nei protocolli di colorazione e nelle impostazioni delle soglie per ottenere risultati riproducibili.
- Richiede considerazioni adattative quando si estende ad altri sistemi modello o classi chimiche diverse dall'acetato di piombo.
- È limitato dalla necessità di rimuovere i pigmenti e di effettuare passaggi di chiarificazione dello sfondo per garantire un'accurata rilevazione del segnale.
