Name: Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 3 s
Description: Impara la colorazione con rosso alizarina per rilevare la tossicità ossea indotta da sostanze chimiche nelle larve di zebrafish. Questo metodo permette di studiare l'osteoporosi e valutare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81872646; 81811540034; 81573173) e dal Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).

Tutte le procedure per animali descritte qui sono state esaminate e approvate dall'Animal Care Institute del Comitato Etico della Soochow University.
1. Allevamento ittico e raccolta di embrioni 14
<ol><li>Dai da mangiare ai pesci tre volte al giorno; assicurarsi che i pesci zebra siano mantenuti a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.</li>
	<li>Separare il pesce adulto maschio e femmina da tavole di isolamento in vasche di deposizione delle uova con un rapporto maschio-femmina di 2: 1 la sera.</li>
	<li>La mattina seguente, rimuovere le tavole di isolamento alle 9:00 e raccogliere gli embrioni 2 ore dopo.</li>
	<li>Mettere gli embrioni in un incubatore biochimico mantenuto a 28,5 °C prima dell'esperimento.</li>
</ol>2. Esposizione chimica
<ol><li>Preparare il brodo madre: pesare l'acetato di piombo triidrato (5 g) e scioglierlo in acqua ultrapura (50 ml) agitando. ATTENZIONE: PbAc è tossico. Indossare maschere antipolvere, indumenti protettivi e guanti adatti. Eseguire l'esperimento sotto una cappa aspirante.</li>
	<li>Selezionare e distribuire casualmente gli embrioni di zebrafish in piastre pulite a 6 pozzetti (30 embrioni per pozzetto in 3 ml di acqua di riproduzione del pesce zebra; vedere Tabella 1 per la sua composizione). Trattare gli embrioni con PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) da 2 a 120 ore dopo la fecondazione (hpf). NOTA: Le concentrazioni di PbAc sono state scelte in base agli esperimenti di determinazione del range di dose. I risultati hanno mostrato che la LC50 di acetato di piombo sugli embrioni di zebrafish era 41.044 mg/L a 120 hpf. Quindi, la concentrazione più alta è stata fissata a metà della LC50 e una serie di soluzioni preparate mediante diluizione 2 volte.</li>
	<li>Nutrire le larve due volte al giorno da 5 giorni dopo la fecondazione (dpf). Mantenere gli embrioni di zebrafish a 28,5 ± 0,5 °C con un ciclo luce/buio di 14:10 h.</li>
	<li>Rinfrescare il terreno privo di Pb (acqua di riproduzione del pesce zebra) ogni 24 ore fino a 9 dpf. NOTA: Al termine degli esperimenti, tutte le soluzioni contenenti piombo sono state versate in un serbatoio di liquido designato e trattate dal centro di gestione dell'esperimento.</li>
</ol>3. Colorazione rosso alizarina
NOTA: Indossare maschere antipolvere, indumenti protettivi e guanti adatti durante l'intero processo di colorazione. Le composizioni di tutte le soluzioni sono mostrate nella Tabella 1.
<ol><li>Fasi specifiche di colorazione NOTA: Il processo di tintura è stato effettuato in una piastra da 24 pozzetti a temperatura ambiente. Dopo aver aggiunto ogni soluzione, posizionare la piastra a 24 pozzetti sul tavolo vibrante impostato a bassa velocità.<ol><li>Rimuovere 10 larve di zebrafish a caso da ciascun gruppo a 9 dpf e fissare il pesce in 1 ml di paraformaldeide al 2% / 1x soluzione salina tamponata con fosfato per 2 ore.</li>
		<li>Decantare la soluzione e lavare le larve di zebrafish con 100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2 per 10 min.</li>
		<li>Decantare la soluzione e incubare le larve nelle seguenti soluzioni per 5 minuti ciascuna per la decolorazione: soluzione di etanolo anidro (EtOH) (80% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH 7,5)/10 mM MgCl2, 50% EtOH/100 mM Tris-HCl (pH=7,5) e 25% EtOH/100mM Tris-HCl (pH=7,5).</li>
		<li>Decantare la soluzione, rimuovere il pigmento mediante sbiancamento con una soluzione composta da 3%H 2 O2 e 0,5% KOH, e osservare una volta ogni 10 minuti fino a completa rimozione del pigmento.</li>
		<li>Risciacquare le larve di zebrafish più volte con glicerina al 25% / KOH allo 0,1% per 10 minuti ciascuna fino a quando non ci sono bolle. NOTA: È importante evitare le bolle; Altrimenti, le bolle nel corpo del pesce zebra appariranno come un campo visivo nero al microscopio, che influenzerà le osservazioni e l'analisi quantitativa.</li>
		<li>Macchiare le larve immergendo in 1 ml di alizarina allo 0,01% per 50 minuti.</li>
		<li>Decantare la soluzione e aggiungere 1 ml di glicerina al 50% / KOH allo 0,1% per 10 minuti per cancellare lo sfondo. Conservare i pesci in 50% glicerina fresca/0,1% KOH per la successiva osservazione.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Acquisizione di immagini
<ol><li>Trasferire una larva sul vetrino ogni volta, mantenendo la larva nel mezzo della goccia di liquido.</li>
	<li>Osserva le larve al microscopio stereo.</li>
	<li>Accendere la fotocamera, aprire il software (vedere la tabella dei materiali) e mantenere le impostazioni predefinite.</li>
	<li>Fare clic su AE e scegliere un tempo di esposizione appropriato (60 ms in questo esperimento) per ottenere l'immagine migliore.</li>
	<li>Cattura tutte le immagini con le stesse impostazioni. Salvate le immagini in formato .tif per un'analisi successiva.</li>
</ol>5. Analisi delle immagini
NOTA: vedere il file supplementare per un esempio con una serie di grafici di esempio per l'analisi delle immagini.
<ol><li>Fare doppio clic sull'icona di ImageJ e analizzare le immagini salvate nel passaggio 4.5.<ol><li>Clicca su File | Aprire per aprire le immagini salvate nel passaggio 4.5.</li>
		<li>Clicca sull'immagine | Digitare, selezionare 8 bit.</li>
		<li>Clicca su Modifica | Inverti.</li>
		<li>Clicca su Analizza | Calibrare, selezionare OD non calibrato nell'interfaccia popup, selezionare Calibrazione globale nella parte inferiore sinistra dell'interfaccia inferiore e fare clic su OK.</li>
		<li>Clicca su Analizza | Imposta scala | Fare clic per rimuovere la scala nell'interfaccia popup, selezionare Globale di seguito e fare clic su OK.</li>
		<li>Clicca su Analizza | Imposta misure, seleziona l'area dell'elemento nell'interfaccia popup, seleziona la soglia Limita a di seguito (per misurare solo l'intervallo selezionato) e fai clic su OK.</li>
		<li>Clicca sull'immagine | Regola| Soglia, fai scorrere il cursore al centro dell'interfaccia popup per selezionare la soglia appropriata (modifica la soglia per ogni immagine) in modo che siano selezionate tutte le destinazioni da testare in un'immagine, quindi fai clic su Imposta.</li>
		<li>Clicca su Analizza | Misura. Registra le date di ciascun gruppo.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per analizzare le differenze e impostare il livello di significatività a p < 0,001 (***).</li>
</ol>

<ol><li>Compston, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendations+for+the+registration+of+agents+for+prevention+and+treatment+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%3A+an+update+from+the+Group+for+the+Respect+of+Ethics+and+Excellence+in+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporosis+International%22%5BJournal%5D)">Recommendations for the registration of agents for prevention and treatment of glucocorticoid-induced osteoporosis: an update from the Group for the Respect of Ethics and Excellence in Science.</a> Osteoporosis International. 19 (9), 1247-1250 (2008).</li>
<li>Rachner, T. D., Gobel, A., Jaschke, N. P., Hofbauer, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+in+preventing+bone+loss+induced+by+aromatase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Challenges in preventing bone loss induced by aromatase inhibitors.</a> Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 105 (10), (2020).</li>
<li>Kataba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+exposure+to+environmentally+relevant+lead+levels+induces+oxidative+stress+and+neurobehavioral+alterations+in+larval+zebrafish+%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Acute exposure to environmentally relevant lead levels induces oxidative stress and neurobehavioral alterations in larval zebrafish (Danio rerio).</a> Aquatic Toxicology. 227, 105607(2020).</li>
<li>Morin, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+fracture+prevalence+and+in+bone+mineral+density+between+Chinese+and+White+Canadians%3A+the+Canadian+Multicentre+Osteoporosis+Study+%28CaMos%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Osteoporosis%22%5BJournal%5D)">Differences in fracture prevalence and in bone mineral density between Chinese and White Canadians: the Canadian Multicentre Osteoporosis Study (CaMos).</a> Archives of Osteoporosis. 15 (1), 147(2020).</li>
<li>Lee, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+lead+poisoning+magnifies+bone+detrimental+effects+in+an+ovariectomized+rat+model+of+postmenopausal+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Chronic lead poisoning magnifies bone detrimental effects in an ovariectomized rat model of postmenopausal osteoporosis.</a> Experimental Toxicologic Pathology. 68 (1), 47-53 (2016).</li>
<li>Theppeang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Associations+of+bone+mineral+density+and+lead+levels+in+blood%2C+tibia%2C+and+patella+in+urban-dwelling+women%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Associations of bone mineral density and lead levels in blood, tibia, and patella in urban-dwelling women.</a> Environmental Health Perspectives. 116 (6), 784-790 (2008).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoporosis+in+a+Chinese+population+due+to+occupational+exposure+to+lead%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+Industrial+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoporosis in a Chinese population due to occupational exposure to lead.</a> American Journal Industrial Medicine. 51 (6), 436-442 (2008).</li>
<li>Guadalupe-Grau, A., Fuentes, T., Guerra, B., Calbet, J. A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+and+bone+mass+in+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Exercise and bone mass in adults.</a> Sports Medicine. 39 (6), 439-468 (2009).</li>
<li>Ottani, V., Raspanti, M., Ruggeri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+structure+and+functional+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Collagen structure and functional implications.</a> Micron. 32 (3), 251-260 (2001).</li>
<li>Kelly, W. L., Bryden, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+differential+stain+for+cartilage+and+bone+in+whole+mount+preparations+of+mammalian+fetuses+and+small+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technology%22%5BJournal%5D)">A modified differential stain for cartilage and bone in whole mount preparations of mammalian fetuses and small vertebrates.</a> Stain Technology. 58 (3), 131-134 (1983).</li>
<li>Barrett, R., Chappell, C., Quick, M., Fleming, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid%2C+high+content%2C+in+vivo+model+of+glucocorticoid-induced+osteoporosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">A rapid, high content, in vivo model of glucocorticoid-induced osteoporosis.</a> Biotechnology Journal. 1 (6), 651-655 (2006).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Fernandez, I., Gavaia, P. J., Laize, V., Cancela, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fish+as+a+model+to+assess+chemical+toxicity+in+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Aquatic+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Fish as a model to assess chemical toxicity in bone.</a> Aquatic Toxicology. 194, 208-226 (2018).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+GH%2FIGF+axis+in+arsenite-induced+developmental+toxicity+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+Environmental+Safety%22%5BJournal%5D)">Role of GH/IGF axis in arsenite-induced developmental toxicity in zebrafish embryos.</a> Ecotoxicology Environmental Safety. 201, 110820(2020).</li>
<li>Bergen, D. J. M., Kague, E., Hammond, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+an+emerging+model+for+osteoporosis%3A+a+primary+testing+platform+for+screening+new+osteo-active+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as an emerging model for osteoporosis: a primary testing platform for screening new osteo-active compounds.</a> Frontiers in Endocrinology. 10, 6(2019).</li>
<li>Charles, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utility+of+quantitative+micro-computed+tomographic+analysis+in+zebrafish+to+define+gene+function+during+skeletogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Utility of quantitative micro-computed tomographic analysis in zebrafish to define gene function during skeletogenesis.</a> Bone. 101, 162-171 (2017).</li>
<li>Hammond, C. L., Moro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+transgenic+reporters+to+visualize+bone+and+cartilage+signaling+during+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Using transgenic reporters to visualize bone and cartilage signaling during development in vivo.</a> Frontiers in Endocrinology. 3, 91(2012).</li>
<li>Bensimon-Brito, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+in+vivo+staining+with+alizarin+red+S--a+valuable+approach+to+analyse+zebrafish+skeletal+mineralization+during+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Revisiting in vivo staining with alizarin red S--a valuable approach to analyse zebrafish skeletal mineralization during development and regeneration.</a> BMC Developmental Biology. 16, 2(2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Il pesce zebra è un modello adatto per studiare la malattia metabolica ossea. Rispetto ai modelli di roditori, i modelli di zebrafish sono relativamente veloci da stabilire e la misurazione della gravità della malattia è più facile. Nelle larve di zebrafish wild-type, la mineralizzazione dello scheletro della testa avviene a 5 dpf e lo scheletro assiale a 7 dpf15. Pertanto, le ossa craniche come PS, OP, CB e NC sono ben sviluppate a 9 dpf. Dopo che le larve sono state completamente decolorate e sb...

Studi recenti hanno confermato che l'osteoporosi dovuta a glucocorticoidi, inibitori dell'aromatasi e consumo eccessivo di alcol è comune 1,2. Il piombo (Pb) è un metallo tossico presente nelle piante, nel suolo e negli ambienti acquatici3. Sebbene gli effetti avversi del Pb sul corpo umano abbiano attirato molta attenzione, il suo impatto irreversibile sull'osso deve essere studiato ulteriormente. L'intossicazione da piombo provoca una vasta gamma di cambiamenti patologici sia nello scheletro in via di sviluppo che in quello adulto, influenzando le normali attività della vita. Gli studi hanno trovato un'associazione tra esposizione cronica a Pb e danno osseo4, tra cui strutture ossee compromesse5,6, ridotta densità minerale ossea e persino aumento del rischio di osteoporosi7.
Il tessuto mineralizzato è di grande importanza per la resistenza ossea8 e la deposizione della matrice di mineralizzazione ossea è un indice critico della formazione ossea9. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e la colorazione rosso alizarina è una procedura standard per valutare la formazione ossea10. Secondo questo metodo, il tessuto mineralizzato è colorato di rosso, mentre tutto il resto del tessuto rimane trasparente. L'area colorata viene quindi quantificata mediante analisi digitale delle immagini11.
Il pesce zebra è un importante organismo modello ampiamente utilizzato nella scoperta di farmaci e nei modelli di malattia. Studi genetici nel pesce zebra e nell'uomo hanno dimostrato somiglianze nei meccanismi alla base della morfogenesi scheletrica a livello molecolare12. Inoltre, lo screening di farmaci o biomolecole ad alto rendimento è più fattibile in grandi covate di zebrafish rispetto ai modelli murini, facilitando lo studio meccanicistico di molecole proosteogeniche o osteotossiche13. La colorazione differenziale dello scheletro in toto10 è frequentemente utilizzata nello studio della displasia scheletrica nei piccoli vertebrati e nei feti di mammiferi. La colorazione rossa dell'alizarina è stata eseguita per studiare la tossicità dello sviluppo osseo delle sostanze chimiche nelle larve di zebrafish. Qui, abbiamo usato il piombo come esempio per descrivere un protocollo per rilevare difetti ossei indotti dall'acetato di piombo nelle larve di zebrafish.

<table><tbody><tr><td>1 M Tris-HCl (pH = 7,5)</td> <td>Solarbio, Pechino, Cina</td><td>21</td><td>per la detenzione del</td></tr><tr><td>4% Paraformaldeide Fix Solution</td><td>BBI, Shanghai, Cina</td><td>14</td><td>tessuti di fissaggio</td></tr><tr><td>10x tampone PBS</td><td>BBI, Shanghai, Cina</td><td>15</td><td>per il fissaggio</td></tr><tr><td>del 35% H2O2</td><td>Yonghua, Jiangsu, Cina</td><td>8</td><td>rimozione del pigmento</td></tr><tr><td>50 mL provetta da centrifuga</td><td>AKX, Jiangsu, Cina</td><td>4</td><td></td></tr><tr><td>95% etanolo anidro</td><td>Enox, Jiangsu, Cina</td><td>2</td><td>decolorazione</td></tr><tr><td>Alizarina rossa (purezza 99,5%)</td> <td>Solarbio, Pechino, Cina</td><td>1</td><td>colorazione</td></tr><tr><td>Incubatore biochimico</td><td>Yiheng, Shanghai, Cina</td><td>3</td><td>allevamento di embrioni di zebrafish</td></tr><tr><td>Bilancia elettronica</td><td>Sartorius, Germania</td><td>5</td><td>pesatura delle materie prime solide</td></tr><tr><td>Glicerina (purezza 99,5%)</td><td>BBI,Shanghai,Cina</td><td>7</td><td>conservazione del pesce macchiato</td></tr><tr><td>ImageJ (software)</td><td>USA</td><td>9</td><td>analisi digitale</td></tr><tr><td>KOH (purezza 99,9%)</td><td>Sigma,America</td><td>10</td><td>soluzione sbiancante</td></tr><tr><td>Acetato di piombo triidrato (purezza 99,5%)</td><td>Aladino,Shanghai,Cina</td><td>11</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (Purezza 99,9%)</td><td>Aladdin,Shanghai,Cina</td><td>12</td><td>soluzione detergente</td></tr><tr><td>NIS-Elements F (software)</td><td>Nikon, Giappone</td><td>13</td><td>osservare e scattare foto</td></tr><tr><td>Pipe</td><td>AKX, Jiangsu, Cina</td><td>18</td><td>rimozione di embrioni e piastre di soluzione</td></tr><tr><td>(24 pozzetti)</td><td>Corning,America</td><td>17</td><td>contenitore per la colorazione di piastre di embrioni</td></tr><tr><td>(6 pozzetti)</td><td>Corning,America</td><td>16</td><td>contenitore per l'allevamento di embrioni</td></tr><tr><td>Tavolo vibrante</td><td>Beyotime, Cina</td><td>19</td><td>miscelazione della soluzione</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Nikon, Giappone</td><td>20</td><td>osservazione e scatto di foto</td></tr><tr><td>Zebrafish</td><td>Zebrafish Experiment Center of Soochow University, Suzhou, Cina</td><td>22</td><td>animale da esperimento</td></tr></tbody></table>

utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

Using Alizarin Red Staining to Detect Chemically Induced Bone Loss in Zebrafish Larvae

La perdita ossea indotta chimicamente dovuta all'esposizione al piombo (Pb) potrebbe innescare una serie di impatti avversi sui sistemi scheletrici sia umani che animali. Tuttavia, gli effetti e i meccanismi specifici del pesce zebra rimangono poco chiari. Il rosso alizarina ha un'alta affinità per gli ioni calcio e può aiutare a visualizzare l'osso e illustrare la massa minerale scheletrica. In questo studio, abbiamo mirato a rilevare la perdita ossea indotta dall'acetato di piombo (PbAc) nelle larve di zebrafish utilizzando la colorazione rosso alizarina. Gli embrioni di zebrafish sono stati trattati con una serie di concentrazioni di PbAc (0, 5, 10, 20 mg/L) tra 2 e 120 ore dopo la fecondazione. La colorazione scheletrica a montaggio intero è stata condotta sulle larve a 9 giorni dopo la fecondazione e l'area totale colorata è stata quantificata utilizzando il software ImageJ. I risultati hanno indicato che i tessuti mineralizzati erano colorati in rosso e l'area colorata diminuiva significativamente nel gruppo di esposizione al PbAc, con un cambiamento dose-dipendente nella mineralizzazione ossea. Questo documento presenta un protocollo di colorazione per studiare i cambiamenti scheletrici nei difetti ossei indotti da PbAc. Il metodo può essere utilizzato anche nelle larve di zebrafish per la rilevazione della perdita ossea indotta da altre sostanze chimiche.

La colorazione rosso alizarina è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish. In questo studio, abbiamo osservato che PbAc ha avuto effetti avversi sulle larve di zebrafish, tra cui morte, malformazione, diminuzione della frequenza cardiaca e riduzione della lunghezza del corpo. Inoltre, le aree dello scheletro minerale delle larve di zebrafish sono state valutate per esaminare la perdita ossea indotta da PbAc. A 9 dpf (Figura 1A</s...

Qui, abbiamo usato la colorazione rosso alizarina per dimostrare che l'esposizione all'acetato di piombo provoca un cambiamento di massa ossea nelle larve di zebrafish. Questo metodo di colorazione può essere adattato allo studio della perdita ossea nella perdita di larve di zebrafish indotta da altre sostanze tossiche pericolose.

Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

Chemically induced bone loss due to lead (Pb) exposure could trigger an array of adverse impacts on both human and animal skeletal systems. However, the ...

Questo metodo può aiutare a rilevare la tossicità ossea indotta dalle sostanze chimiche nel pesce zebra. La colorazione rosso alizarina del tessuto fisso genera una registrazione permanente dei cambiamenti scheletrici che può facilitare il confronto di diversi campioni. Questa tecnica potrebbe essere utile per studiare l'osteoporosi nel modello zebrafish, poiché una delle caratteristiche dell'osteoporosi è la diminuzione della massa ossea.Rimuovere 10 larve di zebrafish a caso da ciascun gruppo a nove giorni dopo la fecondazione e fissare il pesce in un millilitro di aldeide paraforme al 2% e 1X PBS per due ore. Decantare la soluzione e lavare la larva di zebrafish usando 100 millimolari Tris HCL con un pH di 7,5 o 10 millimolari di cloruro di magnesio. Per decolorare, decantare la soluzione e incubare la larva per cinque minuti in una serie di soluzioni come descritto nel manoscritto.Dopo l'incubazione finale, decantare la soluzione e rimuovere il pigmento sbiancando con una soluzione composta da perossido di idrogeno al 3% e idrossido di potassio allo 0,5%. Osservare una volta ogni 10 minuti fino a quando il pigmento non viene completamente rimosso. Risciacquare la larva di zebrafish più volte con glicerina al 25%, idrossido di potassio allo 0,1% per 10 minuti ciascuno fino a quando non ci sono bolle.Macchia nella larva immergendo in un millilitro di 0,01% di alizarina. Decantare la soluzione e aggiungere un millilitro di glicerina al 50% o idrossido di potassio allo 0,1% per cancellare lo sfondo. Conservare il pesce in 50% di glicerina fresca o idrossido di potassio allo 0,1% per la successiva osservazione.Trasferire una larva alla volta sul vetrino mantenendo la larva al centro della goccia di liquido. Osserva la larva sotto uno stereomicroscopio. Accendere la fotocamera.Aprire il software e mantenere le impostazioni predefinite. Clicca su AE e scegli un tempo di esposizione appropriato per ottenere l'immagine migliore. Cattura tutte le immagini con le stesse impostazioni.Salvate le immagini in formato dot tiff per un'analisi successiva. Fare doppio clic sull'icona imageJ. Per analizzare le immagini salvate, fare clic su file, quindi aprire, quindi fare clic sull'immagine, quindi digitare e selezionare otto bit.Fare clic su modifica e invertire. Fare clic su Analizza, quindi calibrare. Selezionare OD non calibrato nell'interfaccia pop-up.Controllare la calibrazione globale nella parte inferiore sinistra dell'interfaccia inferiore e fare clic su OK. Fare clic su analizza, impostare la scala, quindi rimuovere la scala. Controlla globale di seguito e fai clic su OK.Fare clic su analizza, quindi impostare le misurazioni. Seleziona l'area dell'elemento nell'interfaccia pop-up. Controllare il limite alla soglia riportato di seguito per misurare solo l'intervallo selezionato e fare clic su OK.Fai clic sull'immagine, regola, quindi sulla soglia e fai scorrere il cursore al centro dell'interfaccia pop-up. Selezionare la soglia appropriata in modo che vengano selezionate tutte le destinazioni da testare in un'immagine. E fai clic su imposta.Fare clic su analizzare, quindi misurare, salvare le date. La colorazione rosso alizarina è un metodo sensibile e specifico per misurare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea nelle larve di zebrafish. A nove giorni dalla fecondazione, molte ossa dello scheletro della testa come parasfenoide, opercolare, ceratobranchiale e notocorda sono mineralizzate e quindi colorate di rosso.Al contrario, le strutture non ossee come gli otoliti, appaiono marrone nero. L'analisi digitale eseguita per quantificare l'area totale colorata, ha mostrato una significativa diminuzione dell'area colorata per i gruppi di trattamento con acetato di piombo da 10 e 20 milligrammi per litro. I cambiamenti nella mineralizzazione ossea hanno mostrato una dipendenza dalla dose.Per un migliore effetto di colorazione e osservazione, è importante rimuovere il pigmento originale delle larve di zebrafish e rimuovere le bolle dopo lo sbiancamento.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia dello sviluppo

Questo video mostra una tecnica di colorazione per rilevare l'entità della mineralizzazione o della deposizione di calcio in osteoblasti primari in coltura utilizzando il colorante rosso alizarina.

Colorazione con rosso di alizarina: una tecnica per visualizzare la mineralizzazione da parte di osteoblasti in coltura

In questo video, descriviamo un metodo per la rilevazione dei depositi di calcio secreti dagli osteoblasti utilizzando un colorante anionico, Alizarin Red S. Gli osteoblasti in coltura vengono prima colorati e quindi il colorante viene recuperato per la quantificazione colorimetrica dei depositi di calcio o del grado di mineralizzazione degli osteoblasti.

Saggio di mineralizzazione in vitro: un metodo colorimetrico per quantificare i depositi di calcio degli osteoblasti sul sostituto dell'innesto osseo mediante colorazione ed estrazione del rosso di alizarina

Poiché molti modelli di zebrafish di malattie neurologiche e non neurologiche sono studiate nei pesci adulti piuttosto che l'embrione / larve, abbiamo sviluppato una linea laterale rigenerativo dosaggio quantitativo che può essere applicato a modelli di malattia di zebrafish adulto. Il saggio coinvolto risoluzione al neuromast 1) e 2) livelli di cellule singolo capello.

Un test per Lateral Rigenerazione Line in Zebrafish adulti

In questo studio, descriviamo un metodo semplice per eseguire l'analisi del colorante blu di Evans (EBD) sulle larve di pesce zebra.  Questa tecnica è un potente strumento per la caratterizzazione dell'integrità del muscolo scheletrico e la delineazione di modelli di distrofia muscolare di zebrafish, ed è un metodo prezioso per lo sviluppo di nuove terapie.

Analisi delle larve Zebrafish muscolo scheletrico Integrità con Blu di Evans Dye

Piccoli pesci da laboratorio sono diventati modelli popolari per la ricerca sulle ossa sui meccanismi alla base dei disturbi ossei umani e per lo screening di farmaci modulanti le ossa. In questo rapporto, descriviamo un protocollo per valutare l'effetto dell'alendronato sulle cellule ossee nelle larve di medaka con lesioni osteoporotiche.

Il trattamento di droga e<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di osteoblasti-osteoclasti interazioni in un modello di Medaka pesce osteoporosi

L'obiettivo del presente protocollo è di alterare la penetranza dei fenotipi mutanti scheletrici letale in zebrafish allevamento selettivo. Mutanti letali non possono essere coltivate all'età adulta e si sono allevati, pertanto questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio e selezione penetranza attraverso più generazioni di progenie test.

Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test

Qui, descriviamo 3 modelli di lesione di zebrafish adulto e loro uso combinato con il trattamento di droga immunosopressiva. Siamo fornire indicazioni su formazione immagine di rigenerare i tessuti e il rilevamento di mineralizzazione dell'osso in esso.

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Questo protocollo descrive la raccolta e la visualizzazione delle squame elasmoidi del pesce zebra durante la rigenerazione in vivo . Inoltre, viene presentata la coltura ex vivo di queste scaglie fino a 7 giorni dopo la raccolta.

Rigenerazione delle squame di zebrafish in toto e cultura delle squame ex vivo

Questo protocollo offre un metodo per studiare la dinamica cellulare utilizzando una semplice tecnica di coltura in vitro . Offre ai ricercatori e agli educatori del pesce zebra l'opportunità di studiare i processi cellulari, come quelli legati all'omeostasi ossea e alla biologia cellulare di base, visualizzando nuclei fluorescenti e cellule apoptotiche all'interno delle squame.

Tecnica di coltura in vitro per lo studio della dinamica cellulare nelle squame di zebrafish

Questo protocollo descrive un approccio di ablazione laser a due fotoni effettuato su larve di zebrafish, che funge da modello per studiare la rigenerazione ossea e gli effetti della risposta immunitaria all'ablazione.

Ablazione mediata da laser a due fotoni di osteoblasti nello sviluppo di larve di zebrafish

Il protocollo qui descritto presenta una procedura semplice e facile da seguire per la colorazione e la dissezione delle cartilagini craniofacciali in una larva di pesce zebra di 5 giorni. Può essere utilizzato per studiare l'anatomia, la forma e le dimensioni di queste strutture in varie condizioni di sviluppo.

Dissezione dei tessuti craniofacciali di pesce zebra dopo colorazione con blu di Alcian

Impara la colorazione con rosso alizarina per rilevare la tossicità ossea indotta da sostanze chimiche nelle larve di zebrafish. Questo metodo permette di studiare l'osteoporosi e valutare i cambiamenti nella mineralizzazione ossea.

Utilizzo della colorazione rosso alizarina per rilevare la perdita ossea indotta chimicamente nelle larve di zebrafish

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