Valutazione quantitativa della reazione a catena della polimerasi in tempo reale dell'espressione di microRNA nel rene e nel siero di topi con compromissione renale dipendente dall'età
29 aprile 2022
Presentiamo un metodo per valutare l'espressione di microRNA nel rene e nel siero di topi con compromissione renale dipendente dall'età mediante reazione quantitativa a catena della polimerasi a trascrizione inversa.
Questo metodo qRT-PCR può affrontare questioni relative al profilo di espressione dei microRNA nel siero di topi in condizioni come la compromissione renale dipendente dall'età. La tecnica consente il rilevamento dell'espressione di microRNA con elevata precisione e sensibilità mediante un semplice processo che consente di risparmiare tempo e prevenire errori tecnici. Per iniziare, incidi la pelle dell'addome usando pinzette e forbici chirurgiche.
Tagliare i muscoli della membrana peritoneale dalla vescica al bordo inferiore sinistro delle costole. Sollevare la membrana peritoneale usando una pinzetta e fare un'incisione laterale nel bordo superiore con le forbici chirurgiche. Continuare l'incisione lungo il bordo più basso delle costole.
Identificare la vena cava inferiore utilizzando due tamponi di cotone inumiditi con PBS. Inserire un ago da 30 G collegato a una siringa da 1 millilitro nella vena cava inferiore e tirare la siringa. Estrarre lentamente l'ago per evitare l'emolisi.
Trasferire il sangue in un tubo spitz da 1 millilitro con eparina e mescolare invertendo. Centrifugare il tubo spitz per 10 minuti a 3000 volte G a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Prelevare 200 microlitri di campione di siero e aggiungere 1.000 microlitri di reagente di lisi a base di fenolo/guanidina. Vortice la miscela per 5 secondi e incubare a temperatura ambiente per 5 minuti. Aggiungere 200 microlitri di cloroformio e mescolare capovolgendo il tubo 15 volte.
Incubare il campione a temperatura ambiente per 3 minuti, seguito da centrifugazione. Senza disturbare il pellet, trasferire il surnatante in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere 450 microlitri di etanolo al 100% e vortice il tubo per 5 secondi.
Quindi caricare 700 microlitri del campione su una colonna di rotazione ancorata a membrana e centrifugarla. Scartare il flusso e aggiungere 700 microlitri di Wash Buffer 1 fornito nel kit. Centrifugare di nuovo ed eliminare il flusso continuo.
Ripetere il lavaggio con 500 microlitri di Wash Buffer 2 per rimuovere i sali in tracce. Aggiungere 500 microlitri di etanolo all'80%, centrifugare e scartare il flusso dal tubo di raccolta. Centrifugare nuovamente la colonna di rotazione e trasferire la colonna in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri.
Quindi aggiungere 14 microlitri di acqua priva di RNasi e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Ruotare nuovamente la colonna per 1 minuto a 15000 volte G a temperatura ambiente. Preparare una soluzione master mix e aggiungere 8 microlitri per pozzetto in un tubo a 8 pozzetti.
Aggiungere 12 microlitri dell'RNA totale estratto in ciascuna provetta e centrifugare la provetta per 15 secondi a 2000 volte G a temperatura ambiente. Posizionare il tubo in un termociclatore e avviare l'incubazione per sintetizzare il cDNA. Dopo l'incubazione, trasferire il cDNA in una provetta da microcentrifuga fresca.
Diluire il cDNA dieci volte con acqua distillata. Quindi vortice, seguito da centrifugazione per 5 secondi a 2000 volte G a temperatura ambiente. In una provetta per microcentrifuga, preparare la soluzione master mix come descritto nel protocollo di testo e vortice la soluzione.
Aggiungi aliquote da 22,5 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti, seguita da 2,5 microlitri di cDNA. Sigillare la piastra utilizzando una pellicola adesiva e centrifugare la piastra per 30 secondi a 1000 volte G.Posizionare la piastra nel sistema di PCR in tempo reale. Modifica le impostazioni fornendo un nome per l'esperimento.
Quindi selezionare 96 pozzetti 0,2 millilitri come tipo di esperimento, CT comparativa come metodo di quantificazione, standard come modalità di funzionamento del sistema e reagenti SYBR Green come reagenti per rilevare la sequenza target. Fornire i nomi per il campione e il miRNA bersaglio in ciascun pozzetto. Assegna campioni duplicati, scegli un campione di riferimento e un controllo endogeno e seleziona nessuno per il colorante da utilizzare come riferimento passivo.
Per eliminare la contaminazione incrociata del reagente, impostare la trascrittasi inversa negativa e un controllo non-modello per l'espressione dei miRNA. Quindi assicurarsi che il volume di reazione sia impostato su 20 microlitri e che le condizioni di ciclo PCR siano impostate a 95 gradi Celsius per 15 minuti, quindi 40 cicli di denaturazione a 94 gradi Celsius per 15 secondi, ricottura a 55 gradi Celsius per 30 secondi ed estensione a 70 gradi Celsius per 30 secondi. Al termine del processo, fare clic su Analizza per analizzare i dati qRT-PCR.
Verificare che la linea di soglia selezionata automaticamente dal programma sia appropriata per ciascun pozzetto. Controllare il valore del ciclo soglia del controllo endogeno e dei miRNA bersaglio analizzati in ciascun campione. Determinare i valori CT mediante l'intersezione della curva di amplificazione e della linea di soglia.
I dati di qRT-PCR di miRNA per il modello di compromissione renale dipendente dall'età hanno mostrato che, rispetto ai topi di controllo SAMR1, il livello renale di miRNA-7219-5p è aumentato significativamente nei topi sperimentali SAMP1, mentre il livello renale di miRNA-7218-5p è diminuito. I livelli di espressione di miRNA-223-3p non sono cambiati in nessuno dei due ceppi. I livelli sierici di entrambi i miRNA-7219-5p e miRNA-7218-5p erano considerevolmente aumentati nei topi SAMP1, mentre i livelli di miRNA-223-3p erano invariati.
È necessario inserire l'ago nella vena cava inferiore ed estrarre il sangue senza penetrare nella nave. Questo metodo può essere utilizzato per rispondere a domande chiave nel profilo di espressione dei microRNA nel siero dei topi per una vasta gamma di condizioni patologiche.
Panoramica
Questo studio presenta un metodo di reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR) per la valutazione dell'espressione di microRNA nel rene e nel siero di topi con danno renale dipendente dall'età. La tecnica consente un'elevata accuratezza e sensibilità nella rilevazione dell'espressione di microRNA, facilitando la ricerca in questo campo.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia
- Ricerca sui microRNA
Sfondo
- I microRNA svolgono un ruolo cruciale nella regolazione genica.
- L'insufficienza renale dipendente dall'età influisce sull'espressione dei microRNA.
- Comprendere i profili dei microRNA può fornire informazioni sulle malattie renali.
- La qRT-PCR è un metodo ampiamente utilizzato per analizzare l'espressione dell'RNA.
Scopo dello studio
- Valutare l'espressione dei microRNA in topi con danno renale.
- Stabilire un metodo qRT-PCR affidabile per campioni di siero e rene.
- Identificare microRNA specifici associati a modifiche renali legate all'età.
Metodi Utilizzati
- Prelievo di campioni di siero e reni da topi.
- Estrazione di RNA totale mediante reagente lisante a base di fenolo/guanidina.
- Sintesi di cDNA seguita da qRT-PCR per la quantificazione dei microRNA.
- Analisi dei dati di qRT-PCR per determinare i livelli di espressione dei microRNA bersaglio.
Risultati principali
- In topi SAMP1, i livelli renali di miRNA-7219-5p sono aumentati significativamente.
- I livelli renali di miRNA-7218-5p sono diminuiti nei topi SAMP1.
- I livelli sierici di miRNA-7219-5p e miRNA-7218-5p sono aumentati notevolmente.
- I livelli di miRNA-223-3p sono rimasti invariati in entrambe le ceppi.
Conclusioni
- Il metodo qRT-PCR consente efficacemente il profilo dell'espressione di microRNA nel danno renale.
- Specifici microRNA sono associati a modificazioni renali dipendenti dall'età.
- Questo metodo può essere applicato per studiare diverse condizioni patologiche.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Un’analisi accurata dell’espressione dei microRNA nel rene e nel siero consente la rilevazione precoce dei meccanismi di danno renale legati all’età, supportando la validazione degli obiettivi in modelli preclinici. Questo metodo di qRT-PCR fornisce dati quantitativi e riproducibili che aumentano la fiducia predittiva nei processi di scoperta di biomarcatori. Tale approccio colma una lacuna fondamentale nella standardizzazione dell’analisi dei miRNA nella ricerca renale traslazionale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche quantificando le variazioni di espressione di miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p nel rene e nel siero.
- Valore operativo: Fornisce un metodo affidabile per l'estrazione e la valutazione di miRNA da campioni biologici murini, riducendo la variabilità tecnica.
- Valore strategico: Supporta la riduzione del rischio biologico dei bersagli renali chiarificando i modelli di disregolazione dei miRNA in modelli di danno dipendente dall'età.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera valori CT quantitativi da qRT-PCR, consentendo una misurazione standardizzata dell'espressione di miRNA tra diversi tipi di campioni.
- Valore operativo: Stabilisce un flusso di lavoro riproducibile per l'estrazione di miRNA da siero e rene, la sintesi di cDNA e l'amplificazione.
- Valore strategico: Favorisce la prontezza del saggio per campagne di screening mirate a percorsi mediati da miRNA nei modelli di malattia renale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Chiarisce la relazione tra i livelli di miRNA renali e sierici, favorendo la traduzione del biomarcatore dal tessuto al liquido biologico.
- Valore operativo: Permette il monitoraggio longitudinale di miRNA-7218-5p e miRNA-7219-5p in modelli preclinici di danno renale.
- Valore strategico: Supporta decisioni di avanzamento basate sulla valutazione del rischio fornendo informazioni meccanicistiche sui cambiamenti renali legati all'età.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla verifica dell'ipotesi su un bersaglio specifico fino alla validazione preclinica, in particolare per le vie associate alla fibrosi renale e all'invecchiamento.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi rilevando cambiamenti significativi nell'espressione dei miRNA tra ceppi di topi di controllo e ceppi con deficit.
- Screening: Fornisce risultati quantitativi riproducibili (valori CT) che permettono il confronto dei livelli di miRNA tra diverse condizioni sperimentali.
- Analisi: Utilizza il metodo comparativo dei valori CT con controlli endogeni per normalizzare i dati di espressione, garantendo confronti affidabili tra campioni.
- Ricerca traslazionale: Collega le alterazioni dei miRNA renali a modifiche rilevabili nel siero, favorendo lo sviluppo di biomarcatori non invasivi.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un protocollo standardizzato per la quantificazione dei miRNA che può essere riutilizzato in diversi modelli di malattia renale.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi grazie a un rilevamento preciso e sensibile delle variazioni nell'espressione dei miRNA.
- Valore operativo: Migliora la riproducibilità e la standardizzazione tra laboratori definendo passaggi chiari per l'estrazione dell'RNA e la qRT-PCR.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti fornendo dati meccanicistici per la riduzione del rischio relativi ai percorsi renali guidati dai miRNA.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei bersagli in base al rischio, sulla base di una disregolazione consistente dei miRNA nei modelli preclinici.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella manipolazione dell'RNA, nella trascrizione inversa e nell'uso di strumentazione per qRT-PCR.
- Presuppone l'accesso a reagenti lisanti a base di fenolo/guanidina, colonnine a centrifugazione e sistemi di PCR in tempo reale con rilevamento mediante SYBR Green.
- Necessita della standardizzazione di controlli endogeni e campioni di riferimento tra diversi gruppi per l'analisi comparativa dei valori CT.
- Comporta la necessità di adattamenti quando il protocollo viene applicato a diverse linee di topi o a volumi di campione differenti.
- Comprende limitazioni pratiche, come la necessità di un'accurata raccolta del sangue per evitare emolisi e di tempi di incubazione appropriati durante l'estrazione.
