Name: Purificazione dei canali potenziali del recettore transitorio della drosophila endogena (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara a purificare i canali TRP endogeni di Drosophila per studiare le loro proprietà elettrofisiologiche e strutturali. Questo metodo utilizza perline di nichel a basso costo e il complesso proteico INAD.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) e Natural Science Foundation of Guangdong Province, Cina (n. 2021A1515010796) a W. L. Ringraziamo LetPub (www.letpub.com) per la sua assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.

1. Purificazione di TRP con tag GST e frammenti NORPA con tag His
<ol><li>Purificare il frammento TRP 1261-1275 con tag GST<ol>
<li>Trasformare il plasmide 10 pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 in celle Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) utilizzando il metodo di trasformazione dello shock termico CaCl2 21. Inoculare una singola colonia in 10 mL di terreno di Luria Bertani (LB) e crescere durante la notte a 37 °C. Quindi, amplificare i 10 mL di coltura di semina in 1 L di terreno LB a 37 °C.</li>
		<li>Dopo che la densità ottica (OD600) delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 °C e aggiungere 0,1 mM isopropil β-D-1-tiogalatopoliranoside (IPTG; concentrazione finale) per indurre la sovraespressione della proteina bersaglio e incubare a 16 °C per 18 ore.</li>
		<li>Dopo sovraespressione, pellet 1 L di cellule coltivate mediante centrifugazione a 3.993 × g per 20 minuti e risospeso in 40 mL di tampone salino tamponato con fosfato (PBS).</li>
		<li>Caricare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione pre-raffreddato a 4 °C. Aumentare lentamente la pressione dell'omogeneizzatore a 800 bar. Aprire il rubinetto di ingresso e lasciare che le celle risospese passino circolarmente attraverso una valvola con fessure molto strette. NOTA: Le celle sono omogeneizzate dalle elevate forze di taglio causate da una grande caduta di pressione e cavitazione.</li>
		<li>Caricare 5 mL di perline di glutatione su una colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 50 mL di tampone PBS per un totale di tre volte.</li>
		<li>Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48.384 x g. Aggiungere il surnatante del lisato cellulare centrifugato (40 mL) alle perle di glutatione equilibrate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le perle di glutatione ogni 10 minuti.</li>
		<li>Dopo 30 minuti di incubazione, aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Scartare la frazione di flusso. Risciacquare due volte le restanti perle di glutatione con 50 ml di tampone PBS.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL di tampone di eluizione alle perle di glutatione e incubare per 30 minuti. Sospendere le perline ogni 10 minuti.</li>
		<li>Dopo 30 minuti di incubazione, eluire il frammento TRP 1261-1275 con tag GST in un tubo conico da 50 mL e caricare in una colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione), che viene bilanciata utilizzando un buffer Tris da 50 mM (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
		<li>Mantenere la portata di eluizione della colonna di esclusione delle dimensioni a 3 ml/min. Raccogliere le proteine eluite alla velocità di 5 ml/tubo.</li>
		<li>Identificare il picco della proteina bersaglio nella colonna di esclusione dimensionale analizzando i segnali di assorbimento UV a 280 nm e verificare mediante analisi del gel SDS-PAGE (parametri di elettroforesi: 150 V per il gel impilante; 200 V per il gel risolutivo). Macchiare il gel con Coomassie blu R250.</li>
		<li>Concentrare il frammento TRP 1261-1275 purificato con tag GST dalla colonna di esclusione delle dimensioni a 1 mL utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da 15 mL centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata da scrivania.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di proteine concentrate utilizzando la legge di Beer-Lambert. Misurare l'assorbimento UV del frammento TRP 1261-1275 con tag GST a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.</li>
		<li>Ottenere il coefficiente di estinzione a 280 nm importando le sequenze proteiche nel programma Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, 1 L di coltura di TRP 1261-1275 con tag GST produce 1 mL di 600 μM di proteine (6 x 10-7 mol). Vedere la Tabella 1 per i materiali necessari.</li>
	</ol></li>
	<li>Purificazione del frammento NORPA 863-1095 con tag His<ol>
<li>Trasformare il plasmide 20 pETM.3C NORPA 863-1095 in celle E. coli BL21 (DE3) utilizzando il metodo di trasformazione da shock termico CaCl2 21. Inoculare una singola colonia in 10 ml di LB medium e crescere durante la notte a 37 °C. Quindi, amplificare la coltura di semina da 10 ml in 1 L di terreno LB a 37 °C.</li>
		<li>Dopo che l'OD600 delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 °C e aggiungere 0,1 mM IPTG (concentrazione finale) per indurre la sovraespressione della proteina bersaglio e incubare a 16 °C per 18 h.</li>
		<li>Dopo sovraespressione, pellet 1 L di cellule coltivate mediante centrifugazione a 3.993 x g per 20 minuti e risospeso in 40 mL di tampone legante. Successivamente, lisare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione a 4 °C come descritto al punto 1.1.4.</li>
		<li>Caricare 5 mL di Ni-beads in una colonna di flusso gravitazionale e lavare tre volte con 50 mL di tampone di legame.</li>
		<li>Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48.384 x g. Aggiungere il surnatante del lisato cellulare centrifugato alle perle di Ni bilanciate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le Ni-beads ogni 10 minuti.</li>
		<li>Dopo 30 minuti di incubazione, aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Scartare la frazione passante e lavare due volte le restanti perline ni con 50 ml di tampone di lavaggio.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL di tampone di eluizione alle ni-perline e incubare per 30 minuti. Sospendere le Ni-beads ogni 10 minuti.</li>
		<li>Dopo 30 minuti di incubazione, raccogliere il frammento NORPA 863-1095 eluito his-tagged in un tubo conico da 50 mL e caricarlo in una colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione), che viene bilanciata utilizzando 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).</li>
		<li>Mantenere la portata di eluizione della colonna di esclusione delle dimensioni a 3 ml/min. Raccogliere la proteina eluita alla velocità di 5 ml/tubo.</li>
		<li>Identificare il picco della proteina bersaglio nella colonna di esclusione dimensionale analizzando i segnali di assorbimento UV a 280 nm e verificare mediante analisi del gel SDS-PAGE (parametri di elettroforesi: 150 V per il gel impilante; 200 V per il gel risolutivo). Macchiare il gel usando Coomassie blu R250.</li>
		<li>Concentrare il frammento NORPA 863-1095 purificato con tag His dalla colonna di esclusione delle dimensioni a 1 mL utilizzando una colonna di centrifuga di ultrafiltrazione da 15 mL centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata da banco.</li>
		<li>Determinare la concentrazione di proteine concentrate utilizzando la legge di Beer-Lambert. Misurare l'assorbimento UV del frammento NORPA 863-1095 con tag His a 280 nm utilizzando uno spettrofotometro.</li>
		<li>Ottenere il coefficiente di estinzione a 280 nm importando le sequenze proteiche nel programma Protparam (https://web.expasy.org/protparam/). Tipicamente, la coltura da 1 L del frammento NORPA 863-1095 con tag His produce 1 mL di 600 μM di proteine (6 x 10-7 mol). Vedere la Tabella 2 per i materiali necessari.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparazione delle teste di Drosophila
<ol><li>Raccogliere mosche adulte in tubi di centrifugazione conica da 50 ml utilizzando il metodo di anestesia CO2 22,23; congelare immediatamente in azoto liquido per 10 minuti e conservare in un congelatore a -80°C.</li>
	<li>Dopo aver raccolto un numero sufficiente di mosche, scuotere vigorosamente i tubi conici congelati da 50 ml a mano per separare le gambe, le teste, le ali e i corpi delle mosche. Trasferire la miscela in tre setacci in acciaio inossidabile preraffreddati in sequenza (rispettivamente 20/30/40 dimensioni di maglia) e agitare i setacci.</li>
	<li>Successivamente, poiché le teste non possono passare attraverso il setaccio a 40 maglie, utilizzare una spazzola per spazzare via le teste di mosca dal setaccio a 40 maglie, trasferirle in tubi conici da 50 ml e conservarle a -80 ° C.</li>
	<li>Raccogliere continuamente le mosche e le loro teste e conservarle in un congelatore a -80 °C fino a quando non raggiungono la quantità necessaria per la sperimentazione (0,5 g). In genere, per raccogliere 0,5 g di teste, sono necessari 35 ml di mosche in un tubo conico da 50 ml. Vedere la Tabella 3 per i materiali necessari.</li>
</ol>3. Purificazione del canale TRP di Drosophila
<ol><li>Pesare un totale di 0,5 g di teste e omogeneizzare completamente in azoto liquido utilizzando un pestello di mortaio pre-raffreddato. Sciogliere le teste omogeneizzate in un tampone di lisi 10x v/w (5 mL), incubare in uno shaker a 4 °C per 20 min e quindi centrifugare a 20.817 x g per 20 min a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante spin-down ("20817 g S", Figura 4) e centrifugarlo ulteriormente a 100.000 x g per 60 minuti a 4 °C. Utilizzare il surnatante spin-down ("100.000 g S", Figura 4) per il seguente test pull-down.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di Ni-beads nella colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 10 mL di H2O (ddH2O) a doppio distillato a 4 °C per un totale di tre volte. Equilibrare le perline con 10 volumi di colonne di tampone di lisi tre volte a 4 °C.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di 600 μM purificata con la proteina NORPA 863-1095 purificata (3 x 10-7 mol) nella colonna Ni e incubare per 30 minuti a 4 °C. Sospendere le perline ogni 10 minuti.</li>
	<li>Aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso. Prendere la frazione di flusso per l'analisi SDS-PAGE (NORPA F, Figura 4). In questa sezione, le proteine dell'esca sono immobilizzate sulle perle di Ni.</li>
	<li>Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi (10 ml) a 4 °C e mantenere la frazione di lavaggio per l'analisi SDS-PAGE (Wash 1, Figura 4A). Ripetere i passaggi precedenti e conservare il campione per l'analisi SDS-PAGE (Wash 2, Figura 4A). In questa sezione, le proteine eccessive dell'esca sulle perline Ni vengono rimosse.</li>
	<li>Aggiungere il surnatante dell'omogeneizzato di testa di Drosophila dopo 100.000 x g di centrifugazione nella colonna Ni a 4 °C, dove il frammento NORPA 863-1095 con etichetta His è stato immobilizzato.</li>
	<li>Incubare il surnatante con le Ni-perline a 4 °C per 30 min. Sospendere le perline ogni 10 minuti. Quindi, apri il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante per l'analisi SDS-PAGE (lisi della testa di Dro F, Figura 4A). In questa sezione, i complessi proteici INAD (INAD/TRP/ePKC) negli omogeneizzati della testa sono catturati dai frammenti immobilizzati NORPA 863-1095 sulle ni-perline.</li>
	<li>Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi (10 ml) a 4 °C e mantenere il surnatante dalla precipitazione per gravità per l'analisi SDS-PAGE (Wash 3, Figura 4A). Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere il surnatante per l'analisi SDS-PAGE (Wash 4, Figura 4A). In questa sezione, le proteine non legate sulle perline Ni vengono rimosse.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di 600 μM di proteina TRP 1261-1275 con tag GST (3 x 10-7 mol) nelle Ni-beads e incubare per 20 minuti a 4 °C. Sospendere le perline ogni 10 minuti.</li>
	<li>Raccogliere la frazione eluita dalla colonna gravitazionale (TRP E1, Figura 4B), che contiene il canale Endogeno Drosophila TRP. Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere la frazione di eluizione (TRP E2, Figura 4B). In questa fase, utilizzando i frammenti TRP 1261-1275 con tag GST come concorrente, i canali TRP vengono eluiti dai complessi proteici INAD catturati (INAD / TRP / ePKC) sulle ni-perline.</li>
	<li>Lavare le ni-perline con 10 volumi di colonna di tampone di rilegatura (10 ml; Tabella 1) a 4 °C e raccogliere la frazione di lavaggio per l'analisi SDS-PAGE (Wash 5, Figura 4B).</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di tampone di eluizione (Tabella 1) nelle ni-perline e incubare per 20 minuti a 4 °C. Raccogliere la frazione di eluizione dalla colonna del flusso gravitazionale (NORPA E1, Figura 4B). Ripetere i passaggi precedenti e raccogliere la frazione di eluizione (NORPA E2, Figura 4B).</li>
	<li>Utilizzando il tampone di eluizione, eluire il frammento NORPA 863-1095 his-tagged accompagnato dai complessi proteici INAD/ePKC. Successivamente, risospese le Ni-beads in 500 μL di buffer di legame.</li>
	<li>Prendi le Ni-beads risospese per eseguire la SDS-PAGE (colorata da Coomassie blue R250) per analizzare l'efficienza dell'eluizione e valutare se il buffer elute funziona (perline, Figura 4B). Vedere la Tabella 4 per i materiali necessari.</li>
</ol>4. Purificazione della colonna di esclusione delle dimensioni del canale TRP di Drosophila
<ol><li>Installare una colonna di esclusione dimensionale (grado analitico) sul sistema di purificazione delle proteine. Equilibrare la colonna con il buffer di colonna (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), che viene filtrato da un filtro da 0,45 μm.</li>
	<li>Concentrare la frazione TRP E1 ed E2 dalla fase 3.14 utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da 4 mL, centrifugata a 3.000 x g a 4 °C in una centrifuga refrigerata.</li>
	<li>Risciacquare il ciclo di campionamento con il buffer di colonna e caricare il campione nel ciclo di campionamento. Iniettare il campione nella colonna di esclusione dimensionale ed eluire le proteine con una portata adeguata (0,5 ml/min).</li>
	<li>Identificare il picco della proteina bersaglio per assorbimento a 280 nm ed eseguire un gel SDS-PAGE per rilevare il canale Endogeno Drosophila TRP purificato (Figura 5). Vedere la Tabella 5 per i materiali necessari.</li>
</ol>

<ol><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).</li>
<li>Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyunsaturated+fatty+acids+activate+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL.</a> Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).</li>
<li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li>
<li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+binds+to+Drosophila+TRP+with+an+unexpected+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode.</a> Structure. 29 (4), 330-344 (2021).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+intracellular+Ca2%2B+chelation+on+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Physiology.+A%2C+Sensory%2C+Neural%2C+and+Behavioral+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).</li>
<li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li>
<li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphoinositide-mediated+phototransduction+in+Drosophila+photoreceptors%3A+the+role+of+Ca2%2B+and+trp%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp.</a> Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).</li>
<li>Delgado, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+opening+of+the+TRP+channel+in+isolated+membrane+patches+excised+from+photosensitive+microvilli+from+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors.</a> Neuroscience. 396, 66-72 (2019).</li>
<li>Lev, S., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+activity+of+the+TRP-like+channel+depends+on+its+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">The activity of the TRP-like channel depends on its expression system.</a> Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).</li>
<li>Hardie, R. C., Raghu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+heterologously+expressed+Drosophila+TRPL+channels%3A+Ca2%2B+is+not+required+and+InsP3+is+not+sufficient%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient.</a> Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).</li>
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<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INAD+scaffold+is+a+dynamic%2C+redox-regulated+modulator+of+signaling+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye.</a> Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).</li>
<li>Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exquisitely+specific+PDZ%2Ftarget+recognition+revealed+by+the+structure+of+INAD+PDZ3+in+complex+with+TRP+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel.</a> Structure. 24 (3), 383-391 (2016).</li>
<li>Ye, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+unexpected+INAD+PDZ+tandem-mediated+plc%CE%B2+binding+in+Drosophila+photo+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors.</a> eLife. 7, (2018).</li>
<li>Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+heat+shock+step+on+bacterial+transformation+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency.</a> Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).</li>
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<li>Nicolas, G., Sillans, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+latent+effects+of+carbon+dioxide+on+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects.</a> Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).</li>
<li>Arachea, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detergent+selection+for+enhanced+extraction+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins.</a> Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).</li>
<li>Hellmich, U. A., Gaudet, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+of+TRP+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Experimental+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Structural biology of TRP channels.</a> Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

INAD, che contiene cinque domini PDZ, è l'organizzatore principale del macchinario di fototrasduzione Drosophila. Studi precedenti hanno dimostrato che INAD PDZ3 si lega al canale TRP C-terminale coda con squisita specificità (KD = 0,3 μM)18. Il tandem INAD PDZ45 interagisce con il frammento NORPA 863-1095 con un'affinità di legame estremamente elevata (KD = 30 nM). Questi risultati forniscono una solida base biochimica per progettare la purificazione dell'affinità p...

La fototrasduzione è un processo in cui i fotoni assorbiti vengono convertiti in codici elettrici dei neuroni. Trasmette esclusivamente opsine e la successiva cascata di segnalazione accoppiata alla proteina G sia nei vertebrati che negli invertebrati. In Drosophila, utilizzando i suoi cinque domini PDZ, l'inattivazione della proteina scaffold-no-after-potential D (INAD) organizza un complesso di segnalazione supramolecolare, che consiste in un canale del potenziale recettore transitorio (TRP), potenziale del recettore Cβ / No della fosfolipasi A (PLCβ / NORPA) e chinasi C (ePKC) specifica dell'occhio. La formazione di questo complesso di segnalazione supramolecolare garantisce la corretta localizzazione subcellulare, l'alta efficienza e la specificità del macchinario di fototrasduzione Drosophila. In questo complesso, i canali TRP sensibili alla luce agiscono come effettori a valle del NORPA e mediano l'afflusso di calcio e la depolarizzazione dei fotorecettori. Studi precedenti hanno dimostrato che l'apertura del canale TRP di Drosophila è mediata da protoni, interruzione dell'ambiente lipidico locale o forza meccanica 2,3,4. Il canale Drosophila TRP interagisce anche con calmodulina5 ed è modulato dal calcio con feedback sia positivo che negativo 6,7,8.
Finora, gli studi di elettrofisiologia sul meccanismo di gating dei canali Drosophila TRP e TRP-like (TRPL) erano basati su patch di membrana asportate, registrazioni di cellule intere da fotorecettori Drosophila wild-type dissociati e canali etero-espressi in cellule S2, SF9 o HEK 2,9,10,11,12,13, ma non su canali purificati. Anche le informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera rimangono poco chiare. Al fine di studiare le proprietà elettrofisiologiche della proteina purificata in un ambiente di membrana ricostituito e di ottenere informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera, ottenere canali TRP purificati a lunghezza intera è il primo passo necessario, simile alle metodologie utilizzate negli studi sui canali TRP dei mammiferi 14,15,16,17.
Recentemente, sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD 18,19,20, è stata sviluppata per la prima volta una strategia di purificazione dell'affinità più competizione per purificare il canale TRP dagli omogeneizzati della testa di Drosophila da perline di streptavidina 5. Considerando la bassa capacità e il costo costoso delle perle di streptavidina, qui viene introdotto un protocollo di purificazione migliorato che utilizza la proteina esca his-tagged e le corrispondenti perle Ni a basso costo con capacità molto più elevata. Il metodo proposto aiuterà a studiare il meccanismo di gating del canale TRP da angoli strutturali e a misurare le proprietà elettrofisiologiche del canale TRP con proteine purificate.

<table><tbody><tr><td> ceppi batterici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Cellule competenti</td><td>Novagen</td><td>69450</td><td>Sovraespressione proteica</td></tr><tr><td>Modelli di esperimento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D.melanogaster: W1118 ceppo</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>BDSC:3605</td><td>Drosophila preparazione della testa</td></tr><tr><td>Material</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20/30/40 setacci in acciaio inossidabile a maglia</td><td>Jiufeng azienda di reti metalliche GB</td><td>/T6003.1</td><td>Drosophila preparazione della testa</td></tr><tr><td>30% acrilammide-N,N&prime;-Metilenbisacrilammide (29:1)</td><td>Lablead</td><td>A3291</td><td>SDS-PAGE preparazione del gel</td></tr><tr><td>Persolfato di ammonio</td><td>Invitrogen</td><td>HC2005</td><td>Preparazione del gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Cocktail Inibitore della proteasi</td><td>Roche</td><td>05892953001</td><td>Inibitore della proteasi</td></tr><tr><td>Coomassie blu brillante R-250</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100472-0025</td><td>Colorazione del gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A620058-0100</td><td>Preparazione</td></tr> <tr><td>del tampone della colonna ad esclusione dimensionaleSale disodico dell'acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500838-0500</td><td>Preparazione del tampone della colonna ad esclusione dimensionale</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610235-0005</td><td>Preparazione del tampone SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Glutatione Sepharose 4 perle Fast Flow</td><td>Cytiva</td><td>17513202</td><td>Cromatografia di affinità</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500529-0001</td><td>Tampone di eluizione preparato per Ni-colonna</td></tr><tr><td>Isopropil-beta-D-tiogalattopiranoside (IPTG)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600168-0025</td><td>Induzione della sovraespressione proteica</td></tr><tr><td>LB Brodo in polvere</td><td>Sangon Biotech</td><td>A507002-0250</td><td>E.coli. coltura cellulare</td></tr><tr><td>L-Glutatione ridotto (GSH)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G4251-100G</td><td>Preparazione del tampone di eluizione per perle di glutatione</td></tr><tr><td>Perle di Ni-Sepharose excel</td><td>Cytiva</td><td>17371202</td><td>Cromatografia di affinità</td></tr><tr><td>N-Dodecil beta-D-maltoside (DDM)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610424-001</td><td>Detergente per la purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T9281-100ML</td><td>Preparazione gel SDS-PAGE</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sangon Biotech</td><td>E607008-0500</td><td>Tampone di omogeneizzazione per cellule E.coli.</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Lablead</td><td>P0754-25G</td><td>Inibitore della proteasi</td></tr><tr><td>Marcatore proteico prestainato</td><td>Thermo Scientific</td><td>26619/26616</td><td>Scala proteica prestained</td></tr><tr><td>Colonna di esclusione dimensionale (grado di preparazione)</td><td>Cytiva</td><td>28989336</td><td>Colonna HiLoad 26/60 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>Colonna di esclusione dimensionale (grado analitico)</td><td>Cytiva</td><td>29091596</td><td>Superose 6 Increase 10/300 GL</td></tr><tr><td>colonna Cloruro di sodio</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501218-0001</td><td>Preparazione del tampone per la purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Dodecil solfato di sodio (SDS)</td><td>Sangon Biotech</td><td>A500228-0001</td><td>SDS-PAGE preparazione del gel/tampone</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-aldrich</td><td>T1503-10KG</td><td>Preparazione del tampone per la purificazione delle proteine</td></tr><tr><td>Spin per ultrafiltrazione colonna</td><td>Millipore</td><td>UFC901096/801096</td><td>Concentrazione di proteine</td></tr><tr><td><forte>Attrezzatura</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>DENVER</td><td>APX-60</td><td>Metage di Drosophila head</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata da tavolo ad alta velocità per provette da centrifugazione coniche da 15 ml e 50 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td>Concentrazione di proteine</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata ad alta velocità da tavolo Provette per centrifugazione da 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Centrifugazione del lisato di testa Drosophila dopo l'omogeneizzazione</td></tr><tr><td>Colonna di flusso per gravità vuota (diametro interno = 1,0 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0015</td><td>Purificazione delle proteine TRP</td></tr><tr><td>Colonna di flusso per gravità vuota (diametro interno = 2,5 cm)</td><td>Bio-Rad</td><td>738-0017</td><td>Purificazione di esche e proteine concorrenti da E.coli.</td></tr><tr><td>Gel Sistema</td><td>di documentazione Bio-Rad</td><td>Universal Hood II Gel Doc XR System</td><td>SDS-PAGE imaging</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata ad alta velocità</td><td>Coltro Beckman</td><td>Avanti J-26 XP</td><td>Centrifugazione di cellule E.coli./lisato cellulare</td></tr><tr><td>Omogeneizzatore ad alta pressione</td><td>UNION-BIOTECH</td><td>UH-05</td><td>Omogeneizzazione delle cellule E.coli.</td></tr><tr><td>Serbatoio di azoto liquido</td><td>Taylor-Wharton</td><td>CX-100</td><td>Drosophila preparazione della testa Sistema di</td></tr><tr><td>purificazione delle proteine Cytiva</td><td>AKTA Purificatore</td><td>di</td><td>proteine</td></tr><tr><td>Frigorifero (-80&deg; C)</td><td>Thermo</td><td>900GP</td><<td>em>Drosophila preparazione della testa</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>MAPADA</td><td>UV-1200</td><td>OD600 Misurazione di cellule E.coli.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop 2000c</td><td>Determinazione della concentrazione proteica</td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Coltro</td><td>Beckman Optima XPN-100 Ultracentrifuga</td><td>Ultracentrifugazione</td></tr></tbody></table>

purificazione dei canali potenziali del recettore transitorio della drosophila endogena

Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels

La fototrasduzione della drosophila è una delle vie di segnalazione accoppiate alla proteina G più veloci conosciute. Per garantire la specificità e l'efficienza di questa cascata, il canale cationico permeabile al calcio (Ca2+), il potenziale recettore transitorio (TRP), si lega strettamente alla proteina dello scaffold, all'inattivazione-no-after-potential D (INAD) e forma un grande complesso proteico di segnalazione con proteina chinasi C (ePKC) specifica per l'occhio e fosfolipasi Cβ / Nessun potenziale recettore A (PLCβ / NORPA). Tuttavia, le proprietà biochimiche del canale TRP Drosophila rimangono poco chiare. Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale TRP endogeno. In primo luogo, il frammento NORPA 863-1095 purificato con istidina (His) è stato legato a Ni-beads e utilizzato come esca per abbattere il complesso proteico INAD endogeno dagli omogeneizzati della testa di Drosophila. Quindi, un eccessivo frammento di glutatione S-transferasi (GST) purificato con tag TRP 1261-1275 è stato aggiunto alle ni-perline per competere con il canale TRP. Infine, il canale TRP nel surnatante è stato separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 mediante cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo metodo consente di studiare il meccanismo di gating del canale Drosophila TRP sia da angolazioni biochimiche che strutturali. Le proprietà elettrofisiologiche dei canali TRP di Drosophila purificati possono anche essere misurate in futuro.

In questo articolo, viene dimostrato un metodo di purificazione delle proteine per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP (Figura 1).
In primo luogo, l'espressione e la purificazione delle proteine ricombinanti vengono applicate per ottenere l'esca e le proteine concorrenti. Quindi, un frammento TRP 1261-1275 con tag GST viene espresso in cellule E. coli BL21 (DE3) in mezzo LB e purificato utilizzando perline di glutatione e una colonna di ...

Sulla base del meccanismo di assemblaggio del complesso proteico INAD, in questo protocollo è stata sviluppata una strategia di purificazione dell'affinità modificata più concorrenza per purificare il canale Endogeno Drosophila TRP.

Purificazione dei canali potenziali del recettore transitorio della drosophila endogena

Drosophila phototransduction is one of the fastest known G protein-coupled signaling pathways. To ensure the specificity and efficiency of this cascade, ...

In questo protocollo, dimostriamo il processo di purificazione per ottenere canali TRP purificati a lunghezza intera, che è il primo passo necessario per studiare le proprietà elettrofisiologiche e ottenere informazioni strutturali del canale TRP Drosophila a lunghezza intera. Sulla base del meccanismo di campionamento del complesso proteico INAD e utilizzando perle di nichel a basso costo con capacità molto più elevata, una quantità sufficiente di canali TRP può essere purificata dalle teste di mosca. A dimostrare la procedura sarà Yuyang Liu, un tecnico del nostro laboratorio.Per iniziare, trasformare il plasmide pGEX 4T-1 TRP 1261-1265 in cellule E.coli BL21, utilizzando il metodo di trasformazione dello shock termico del cloruro di calcio. Inoculare una singola colonia in 10 millilitri di Luria Bertani medium, e crescere durante la notte a 37 gradi Celsius. Aggiungere i 10 millilitri di coltura di semina in un litro di Luria Bertani medium e incubare a 37 gradi Celsius.Dopo che la densità ottica delle cellule raggiunge 0,5, raffreddare le cellule a 16 gradi Celsius e aggiungere 0,1 millimolari isopropil-beta-D-1-tiogalattopoliranoside. Dopo la sovraespressione, pellet un litro di cellule coltivate per centrifugazione e risospeso in 40 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato. Caricare le celle risospese in un omogeneizzatore ad alta pressione, pre-raffreddato a quattro gradi Celsius.Aumentare lentamente la pressione dell'omogeneizzatore a 800 bar. Aprire la linguetta di ingresso e lasciare che le celle risospese passino circolarmente attraverso una valvola con fessure strette. Caricare cinque millilitri di perline di glutatione in una colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline con 50 millilitri di tampone salino tamponato con fosfato, per un totale di tre volte.Centrifugare il lisato cellulare dall'omogeneizzatore ad alta pressione a 48, 384 volte G.Aggiungere circa 40 millilitri del surnatante del lisato cellulare centrifugato alle perle di glutatione equilibrate nella colonna di flusso gravitazionale e incubare per 30 minuti a 4 gradi Celsius. Sospendere le perle di glutatione ogni 10 minuti. Dopo 30 minuti di incubazione, aprire la linguetta di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso.Scartare la frazione di flusso e risciacquare due volte le restanti perle di glutatione, con 50 millilitri di tampone salino tamponato con fosfato. Aggiungere 15 millilitri di tampone di eluizione alle perle di glutatione e risospesciare le perline ogni 10 minuti. Eluire il frammento TRP 1261-1275 con tag GST in un tubo conico da 50 ml e caricarlo in una colonna di esclusione delle dimensioni.Raccogliere cinque millilitri delle proteine eluite per tubo e concentrare i frammenti purificati in un millilitro mediante centrifugazione in una colonna di centrifuga di ultrafiltrazione in una centrifuga refrigerata. Per purificare il frammento NORPA 863-1095 con etichetta His, seguire la procedura precedentemente dimostrata utilizzando perline di nichel. Raccogliere mosche adulte in tubi centrifughi conici da 50 millilitri e congelarli in azoto liquido per 10 minuti.Agitare vigorosamente i tubi congelati a mano e trasferire la miscela su tre setacci in acciaio inossidabile impilati in sequenza e preraffreddati. Agitare i setacci e spazzare via le teste di mosca dal setaccio a 40 maglie usando un pennello. Trasferirli in cinque tubi conici millilitri e conservarli a meno 80 gradi Celsius.Omogeneizzare 0,5 grammi di teste in azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello pre-raffreddati. Sciogliere le teste omogeneizzate in cinque millilitri di tampone di lisi 10X, seguito da centrifugazione a 20, 817 volte G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Il surnatante spin down viene ulteriormente centrifugato 100.000 volte G a quattro gradi Celsius per 60 minuti.Aggiungere un millilitro di perline di nichel nella colonna di flusso gravitazionale e lavare le perline tre volte con 10 millilitri di acqua a doppia distillazione a quattro gradi Celsius. Equilibrare le perline con 10 volumi di colonna di tampone di lisi, tre volte a quattro gradi Celsius. Aggiungere 500 microlitri di 600 micromolari purificati his-tagged proteina NORPA 863-1095 nella colonna di nichel e incubare la colonna.Sospendere le perline ogni 10 minuti. Aprire il rubinetto di uscita della colonna per separare le perline e la frazione di flusso e lavare le perle di nichel con 10 millilitri di tampone di lisi fredda. Quindi, aggiungere il surnatante freddo di omologenato della testa di Drosophila nella colonna di nichel.Dopo l'incubazione, lavare le perline con 10 millilitri di tampone di lisi e aggiungere 500 microlitri di 600 micromolari gst-tagged TRP 1261-1275 proteina nelle perline. Raccogliere la frazione eluita dalla colonna di gravità. Lavare le perle di nichel con 10 millilitri di tampone legante.Quindi, aggiungere il tampone di eluizione e raccogliere la frazione di eluizione dalla colonna del flusso di gravità. Concentrare le frazioni eluite dalla purificazione del canale TRP di Drosophila, utilizzando una colonna di spin di ultrafiltrazione da quattro millilitri. Iniettare il campione nella colonna di esclusione delle dimensioni ed eluire le proteine con una portata ragionevole.Il frammento TRP 1261-1275 con tag GST è stato espresso in cellule di E.coli e purificato utilizzando perline di glutatione e una colonna di esclusione delle dimensioni. Allo stesso modo, il frammento NORPA 863-1095 con tag His è stato espresso e purificato utilizzando perline di nichel e colonna di esclusione delle dimensioni. Il canale TRP eluito è separato dall'eccessivo peptide TRP 1261-1275 marcato con GST, per cromatografia di esclusione dimensionale.Come sottoprodotto, i complessi INAD, ePKC, NORPA 863-1095 sono ottenuti dopo la competizione peptidica TRP 1261-1275. La cosa più importante da ricordare quando si tenta questo protocollo, è omogeneizzare le teste di mosca in azoto liquido e risolvere l'omogeneizzato in tampone contenente un detergente chiamato DDM. Seguendo questa procedura, possiamo anche purificare l'intero complesso proteico INAD che può essere utilizzato per studiarne i meccanismi di assemblaggio e regolazione.Una potenziale applicazione futura di questo metodo sarà quella di studiare le informazioni strutturali del canale Endogeno Drosophila TRP utilizzando tecniche Cryo-EM. Inoltre, è anche possibile misurare le proprietà elettrofisiologiche dei canali Endogeni Drosophila TRP purificati nella membrana lipidica a doppio strato artificiale.

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