Espressione batterica e purificazione della metalloproteinasi-3 della matrice umana mediante cromatografia di affinità
30 marzo 2022
La purificazione, la dialisi e l'attivazione di His-tag sono impiegate per aumentare le rese di espressione proteica del dominio catalitico solubile e a matrice attiva metalloproteinasi-3 nei batteri. Le frazioni proteiche vengono analizzate tramite gel SDS-PAGE.
Questo protocollo dettagliato descrive un metodo altamente efficiente ed economico di espressione batterica per il dominio catalitico MMP-3 ricombinante in E.Coli, che può essere applicato ad altri bersagli terapeutici MMP. E.coli manca di un complesso sistema di ripiegamento proteico e di elaborazione post-traduzionale. Questo metodo utilizza il ceppo cellulare R2DP per migliorare l'espressione della proteina eucariotica in E.coli.
La sovrapproduzione di MMP specifiche porta a diverse malattie come il cancro, le malattie cardiovascolari e neurodegenerative. Le MMP solubili attive sono necessarie per lo sviluppo di terapie inibitorie del MMP. Inoculare una singola colonia isolata di pET His-tag pro MMP-3 catalytic domain transformant da una piastra LB ampicillina resistente al cloramfenicolo in cinque millilitri di LB ampicillina chloramphenicol resistant media a 37 gradi Celsius.
Risparmia aliquote da ogni coltura e prepara il 40% di scorte di glicerolo. Inoculare un pallone da un litro contenente 500 millilitri di LB ampicillina cloramfenicolo resistente mezzo ad una densità ottica da 0,05 a 0,1 a 600 nanometri con la coltura notturna. Misurare la densità ottica a 600 nanometri in diversi punti temporali, in genere per tre o quattro ore fino a quando non cade tra 0,4 e 0,6.
Indurre le colture con un ceppo molare IPTG ad una concentrazione finale di un millimolare. Incubare nello shaker a 37 gradi per altre tre o quattro ore. Centrifugare le celle in flaconi conici da 250 millilitri a 13.000 G e quattro gradi Celsius per 10 minuti, ripetendo fino a quando le colture non saranno interamente pellettate.
Aggiungere tre millilitri di tampone di lisi per grammo di pellet e risospesciare il pellet mediante vortice o pipettaggio. Aggiungere 1,25 millilitri del 10% in peso in volume di desossicolato di sodio per un litro di coltura. Aggiungere 10 microlitri di DNasi I per un litro di cultura.
Agitare a temperatura ambiente per 30 minuti a 150 RPM. Centrifugare per 10 minuti a 13.000 G e quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante.
Risospesciare il pellet in 100 millilitri per litro di coltura del tampone corporeo di inclusione mediante pipettaggio su e giù. Mantenere i campioni sul ghiaccio durante la sonicazione per evitare il surriscaldamento. Sonicare ogni campione per sei cicli di 15 secondi, un'uscita di cinque e un impulso del 50%.
Centrifugare i campioni per 10 minuti a 13.000 G e quattro gradi Celsius. Controllare il pellet. Se il pellet è compatto, scartare il surnatante.
Sospendere ogni pellet da una coltura da un litro e cinque millilitri di tampone di solubilizzazione. Incubare per almeno 30 minuti sul ghiaccio per permettere alle proteine di solubilizzarsi. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 13.000 volte G in quattro gradi Celsius.
Se il pellet si forma dopo la centrifugazione, versare il surnatante in un tubo conico separato da 50 millilitri. Risospesciare il pellet in altri cinque millilitri di tampone di solubilizzazione per un litro di coltura tubando su e giù. Centrifugare per 10 minuti a 13.000 G e quattro gradi Celsius.
Quindi, tira i supernatanti. Scartare il pellet o conservarlo a meno 80 gradi Celsius per un'ulteriore sonicazione. Blank contro il tampone di lavaggio HT e registrare l'A280 della prima frazione di lavaggio.
Ripetere con altre frazioni fino a quando A280 si avvicina alla linea di base. Eluire immediatamente le proteine his-tagged aggiungendo cinque millilitri di tampone di eluizione HT. Raccogliere il flusso attraverso frazioni da 0,5 a un millilitro in tubi di microfuga etichettati come eluizione HT.
Misurare l'A280 della frazione di eluizione. Se l'A280 è maggiore di 0,3 milligrammi per millilitro, diluire la frazione con tampone di equilibrio HT. Immergere le frazioni MMP eluite in tubi di dialisi in un litro di tampone di dialisi uno e mescolare il tubo e il suo contenuto su un agitato magnetico per almeno otto ore a quattro gradi Celsius.
Trasferire in un litro di tampone di dialisi due e mescolare il tubo e il suo contenuto su una agitazione magnetica per almeno otto ore a quattro gradi Celsius. Quindi, trasferire su un litro di tampone per dialisi tre e mescolare il tubo e il suo contenuto su un agitato magnetico per non meno di otto ore a quattro gradi Celsius. Trasferire il campione in un contenitore appropriato ed etichettarlo come MMP dializzato.
Esaminare il tubo per qualsiasi precipitato. Per un'aliquota millilitro di un milligrammo per millilitro MMP, aggiungere 50 microlitri di APMA millimolare per raggiungere una concentrazione finale di APMA di un millimolare. Se si forma un precipitato, centrifugarlo alla massima velocità per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Conservare il surnatante in un tubo di microfuga da 1,5 millilitri etichettato MMP attivato. Gettare il precipitato in un contenitore contrassegnato per i rifiuti APMA. SDS-PAGE è stato eseguito per confrontare le frazioni di eluizione di purificazione His-tag del dominio catalitico His-tag pro MMP-3 dalle celle BL21 DE3 nelle celle R2DP.
Le prime otto frazioni di eluizione del dominio catalitico MMP con tag His e delle cellule BL21 DE3 hanno mostrato meno proteine rispetto a quelle nel dominio catalitico MMP con tag His nelle cellule R2DP. Vengono mostrate le frazioni indotte, ripiegate, concentrate, attivate e dissalate delle cellule MMP3 CD e R2DP. Al momento dell'attivazione, il peso molecolare della banda CD MMP-3 attivata è di circa 20 kilodalton, al contrario dello zimogeno His-tagged che rimane a circa 30 kilodalton.
Quando centrifugazione la cella lisata, i pellet potrebbero non essere compatti. Quando ciò accade, sonicare di più e centrifugare più a lungo. Quando si riconcentra la proteina, possono verificarsi precipitazioni.
Scioglierlo nel tampone di solubilizzazione e ripetere il processo. La procedura qui descritta fornisce un metodo dettagliato per l'espressione solubile di MMP umane attive che può eventualmente essere utilizzato per comprendere il meccanismo molecolare dell'attività enzimatica MMP. Metodi alternativi di purificazione delle proteine come FPLC possono essere eseguiti a proteine MMP purificate.
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Panoramica
Questo protocollo delinea un metodo efficiente per esprimere il dominio catalitico ricombinante MMP-3 in E. coli, utilizzando la linea cellulare R2DP per migliorare le rese proteiche. Il processo include la purificazione con tag His, la dialisi e l'attivazione per ottenere proteina attiva e solubile adatta per applicazioni terapeutiche.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Biochimica
- Ingegneria proteica
- Sviluppo di terapie
Sfondo
- Le metalloproteinasi della matrice (MMP) sono implicate in varie malattie, inclusi il cancro e i disturbi neurodegenerativi.
- Le MMP solubili attive sono essenziali per lo sviluppo di inibitori MMP.
- E. coli è comunemente utilizzato per l'espressione proteica grazie alla sua semplicità e convenienza economica.
- La linea R2DP migliora l'espressione di proteine eucariotiche nei sistemi batterici.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo economico per produrre il dominio catalitico attivo MMP-3 in E. coli.
- Fornire un protocollo che possa essere adattato per altri bersagli terapeutici MMP.
- Facilitare la ricerca sulle MMP e il loro ruolo nei meccanismi delle malattie.
Metodi utilizzati
- Inoculazione di E. coli trasformata da terreni selettivi.
- Purificazione con tag His per isolare il dominio catalitico MMP-3.
- Dialisi per rimuovere le impurità e concentrare la proteina.
- Analisi delle frazioni proteiche utilizzando gel SDS-PAGE.
Risultati principali
- Espressione di successo del dominio catalitico solubile MMP-3 in E. coli.
- Alte rese di proteina attiva adatta per applicazioni terapeutiche.
- Metodi di purificazione e analisi efficaci dimostrati.
- Protocollo applicabile ad altre MMP e proteine simili.
Conclusioni
- Il metodo descritto fornisce un approccio affidabile per la produzione di MMP-3 in un sistema batterico.
- Miglioramenti nella resa proteica e nella solubilità possono aiutare nello sviluppo terapeutico.
- Questo protocollo può servire come base per futuri studi sulle MMP.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables cost-effective, high-yield production of active human MMP-3 catalytic domain in E. coli, addressing a key bottleneck in target validation for MMP-related therapeutics. By improving soluble expression and purification yields, it supports early-stage hypothesis testing and mechanistic de-risking in oncology, neurodegenerative, and cardiovascular drug discovery programs. The method enhances portfolio readiness by providing reliable access to bioactive protein for inhibitor screening and assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of MMP-3 therapeutic hypothesis through production of active, soluble catalytic domain for functional assays.
- Operational Value: Reduces reliance on expensive mammalian systems by improving bacterial expression yield and solubility via R2DP strain.
- Predictive Value: Supports target confidence by providing consistent, native-conformation protein for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified MMP-3 suitable for developing biochemical and cell-based assays to evaluate inhibitor potency and selectivity.
- Operational Value: Delivers standardized, quantifiable protein output via His-tag purification and dialysis, enabling reproducible compound screening.
- Scalability: Uses simple induction and lysis steps compatible with multi-liter culture scale-up for assay reagent production.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Supports progression from target validation to preclinical studies by supplying active MMP-3 for mechanism-of-action and biomarker studies.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of MMP-3 inhibition effects on ECM remodeling pathways linked to disease phenotypes.
- Predictive Confidence: Enables structure-function correlation using purified protein to inform lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, enabling target validation through recombinant protein production, which informs lead identification and preclinical evaluation of MMP inhibitors.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by providing active MMP-3 to clarify its role in proteolytic pathways and disease mechanisms.
- Screening: Delivers purified protein suitable for high-throughput biochemical assays to identify and rank inhibitor candidates.
- Analytics: Enables quantitative assessment via A280 measurement and SDS-PAGE to compare expression yields and purification efficiency across strains.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical work by supplying protein for ex vivo tissue degradation and cytokine interaction studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, adaptable platform for producing other MMP catalytic domains, reducing re-optimization effort across targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in MMP-3 as a therapeutic target by enabling consistent production of active protein.
- Operational Value: Improves reproducibility and yield compared to BL21(DE3), reducing batch failure and reagent cost in protein production.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions by providing reliable access to target protein for early inhibitor profiling.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of MMP-targeted programs through improved target validation throughput.
Implementation Considerations
- Requires molecular biology expertise in cloning, transformation, and inducible expression systems.
- Depends on standard laboratory equipment including shakers, centrifuges, sonicators, and dialysis apparatus.
- Necessitates optimization of induction time and temperature for solubility across different MMP targets.
- Involves handling of denaturing and solubilizing agents requiring appropriate safety protocols.
- Activation efficiency may vary and requires monitoring via APMA treatment and SDS-PAGE to confirm zymogen cleavage.
