Isolamento e caratterizzazione del ficobilisoma intatto nei cianobatteri

L'attuale protocollo descrive in dettaglio l'isolamento dei ficobilisomi dai cianobatteri mediante centrifugazione attraverso un gradiente di densità discontinuo di saccarosio. Le frazioni di ficobilisomi intatti sono confermate dallo spettro di emissione fluorescente 77K e dall'analisi SDS-PAGE. Le frazioni ficobilisomiali risultanti sono adatte per la colorazione negativa del TEM e l'analisi della spettrometria di massa.

È un protocollo semplice e veloce che consente alle persone che non hanno familiarità con i cianobatteri di isolare il ficobilisoma a proprio agio. Il vantaggio di questa tecnica è che è adattata a una piccola scala ed è facile da eseguire. È un metodo semplice, affidabile ed efficiente per isolare ficobilisomi intatti di cinobatteri modello e non modello.

Inizia trasferendo la coltura cellulare di 0,8 OD a 750 nanometri in un pallone da un litro e diluiscila in 500 millilitri di mezzo B-HEPES per ottenere l'OD di 0,2 a 750 nanometri. Coltiva la coltura con agitazione costante a 30 gradi Celsius fino a quando l'OD raggiunge 0,8 a 1, indicando una fase di crescita esponenziale tardiva. Centrifugare la coltura ad una velocità di 10.000 volte g per 20 minuti a temperatura ambiente ed eliminare il surnatante.

Sospendere i pellet cellulari e lavare due volte con tampone fosfato di potassio molare 0,75, pH sette. Pellet le celle in un tubo di centrifuga da 50 millilitri mediante centrificazione a temperatura ambiente. Scartare il surnatante e risospese le cellule con 0,75 tampone di fosfato di potassio molare.

Misurare il peso umido del pellet con una bilancia elettronica e risospesare il peso umido di un grammo del pellet in cinque millilitri del buffer. Aggiungere un millilitro di sospensione cellulare e da 0,4 a 0,6 grammi di perle di vetro da 0,1 millimetri in un flaconcino con tappo a vite da due millilitri. Rompere le celle per 30 secondi da un battitore di perline.

Lasciare raffreddare i tubi a bagnomaria a temperatura ambiente per due minuti. Dopo la lisi, centrifugare i flaconcini per 10 secondi a temperatura ambiente ad una velocità di 500 volte g. Raccogliere il surnatante con una pipetta in un tubo centrifugo da 15 millilitri.

Lavare le perline con 0,5 millilitri di tampone fosfato di potassio molare 0,75 una volta, quindi trasferirle nello stesso tubo centrifuga. Aggiungere Triton X-100 alla sospensione a cellule lisate e incubare su uno shaker a dondolo a temperatura ambiente e 40 RPM per 20 minuti o fino a quando la soluzione diventa omogenea. Centrifugare i tubi per 20 minuti a 17, 210 volte g e conservare il surnatante senza lo strato superiore di micella Triton a temperatura ambiente per un massimo di un'ora.

Fare quattro concentrazioni di saccarosio in 0,75 molare tampone di fosfato di potassio a pH sette. Posizionare 2,8 millilitri di due tamponi di saccarosio molare sul fondo del tubo della centrifuga da 40 millilitri e sovrapporre con tre strati di soluzioni di saccarosio. Infine, aggiungere tre millilitri di PBS contenenti la frazione surnatante e centrifugare i gradienti risultanti.

Dopo l'ultracentrificazione, condensare il PBS frazionato e le ficobiliproteine tra gli strati e osservare le bande blu in Syn6803 e le interfacce. Rimuovere il saccarosio concentrando e diluendo ripetutamente le frazioni con tampone fosfato di potassio molare 0,75 e membranare le unità filtranti centrifughe. Per misurare la fluorescenza PBS diluire il campione PBS concentrato con tampone fosfato di potassio molare 0,75 per ottenere un volume di microlitri fino a 500 microlitri.

Aggiungere il campione PBS diluito in un tubo di vetro trasparente e congelare il tubo in azoto liquido fino a quando non è completamente congelato. Spostare il tubo congelato in un contenitore dewar trasparente preriempito con azoto liquido. La lisi cellulare completa mostra il colore surnatante e blu-verde scuro prima della centrificazione.

La separazione del gradiente di densità del saccarosio del PBS isolato mostra diverse frazioni di ficobiliproteine dissociate e la frazione più bassa rappresenta il PBS intatto. Gli spettri di assorbimento dal PBS dissociato e intatto di JSC one e Syn6803 hanno lo stesso picco a 622 nanometri, corrispondente alla ficocianina. Inoltre, il picco di assorbimento della ficoeritrina a 571 nanometri sia nel PBS dissociato che intatto di JSC-1.

Gli spettri di emissione del PBS dissociato hanno un forte picco a circa 650 nanometri in Syn6803 e JSC-1, che rappresenta l'emissione di ficociani. I picchi massimi di emissione fluorescente a 651 nanometri e 684 nanometri rivelano che l'energia raccolta dalla ficocianina è stata trasferita in modo efficiente all'alloficocianina e agli emettitori terminali, che sono ApcD e ApcE, nel nucleo. La figura mostra SDS-PAGE colorato di zinco sotto irradiazione UV dove le subunità ficobiliproteine sono fortemente fluorescenti e l'ApcE ha mostrato una debole fluorescenza, indicata con la freccia.

La colorazione blu di Kumasi mostra che le frazioni superiori contengono altre proteine idrosolubili non PBS e le PBS intatte e Syn6803 mostrano una banda ApcE prominente, indicata con una freccia, priva delle frazioni PBS dissociate. L'ultracentrifugazione dimostra che il gradiente di saccarosio preparato in un rapporto di 1:3 mostra bande più larghe rispetto al gradiente realizzato con un rapporto di 1:10. È importante lisi delle cellule e solvolisi completamente i supernatanti per ottenere più ficobilisomi.

Altri metodi, come la crio-EM o la spettrometria mista, possono essere utilizzati per studiare la struttura proteica o la composizione proteica dei ficobilisomi.