Name: Rapido isolamento dei nematodi selvatici di Baermann Funnel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: Impara l'isolamento rapido dei nematodi selvatici con il metodo Baermann Funnel per studi di ecologia e genetica di popolazione usando Caenorhabditis. Questa tecnica semplice consente di estrarre vermi da substrati naturali e creare colture pulite per ricerche sul campo.

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Questo lavoro è stato supportato dalle sovvenzioni NIH R35GM141906 e R21ES031364 e da Damon Runyon Fellowship DRG-2371-19.

1. Preparazione di piastre NGM seminate sul campo
<ol><li>Prima del viaggio, pesare 23,005 g di polvere di Nematode Growth Medium (NGM) (vedi Tabella dei materiali) e preconfezionare in un sacchetto di plastica sigillabile. Fai un sacchetto per ogni litro di supporto desiderato. NOTA: il preconfezionamento prima del viaggio evita la necessità di un equilibrio funzionale sul campo.</li>
	<li>Prima del viaggio, preparare 1 mL di 1M MgSO4, 1 mL di 1M CaCl2 e 25 mL di tampone fosfato di potassio 1M per ogni litro di fluido desiderato. Per produrre 1 L di tampone fosfato di potassio, sciogliere 108,3 g di KH2PO4 e 35,6 g di K2HPO4 in acqua, come descritto in WormBook20.</li>
	<li>Prima del viaggio, fai una coltura notturna di OP50 (vedi Tabella dei materiali) coltivata in LB a 37 ° C, come descritto in WormBook20. Aliquotare la coltura in tubi conici da 50 ml e avvolgere le cime con pellicola di paraffina per evitare perdite.</li>
	<li>Sul campo, sciogliere il contenuto della confezione NGM in 973 mL di acqua a doppia distillazione (ddH20) o nell'acqua più pura e sterile disponibile in un pallone da 1 L o in una bottiglia.</li>
	<li>Posizionare il pallone o la bottiglia, con un cappuccio sciolto o un coperchio di alluminio, in un bagno di acqua calda bollente su una piastra calda o una stufa. Mescolare di tanto in tanto fino a quando tutta la polvere è sciolta ed è chiara (questo richiede ~ 30 minuti). NOTA: se è disponibile una piastra calda magnetica, una barra di agitazione è un'opzione eccellente per limitare la quantità di agitazione manuale.</li>
	<li>Rimuovere il fluido dal bagno d'acqua e raffreddare a ~ 58 ° C con agitazione occasionale o con una barra di agitazione. Una volta raffreddato il fluido a 58 ° C, utilizzare pipette sierologiche o standard per aggiungere 25 mL di tampone fosfato di potassio 1M, 1 mL di 1M MgSO4 e 1 mL di 1M CaCl2, mescolando bene tra ogni passaggio.</li>
	<li>Nell'ambiente più sterile disponibile, pipettare o versare il supporto in piastre della dimensione desiderata e consentire di raffreddare e solidificare durante la notte. Versare una piastra da 60 mm (~10 mL) per ogni campione di substrato. Versare una piastra da 35 mm (~3,5 ml) per ogni linea isofema; il numero di piccole piastre necessarie è difficile da prevedere in anticipo.</li>
	<li>Pipettare 50 μL di coltura OP50 su ogni piastra e lasciarla asciugare e crescere durante la notte prima dell'uso.</li>
</ol>2. Raccolta dei substrati dei nematodi
<ol><li>Identificare un substrato ricco di batteri sul campo. Alcuni esempi includono frutta in decomposizione, fiori, funghi e steli di piante erbacee. Anche la lettiera di terra e foglie è adatta, anche se raramente contengono Caenorhabditis.</li>
	<li>Con una mano guantata, posizionare un campione di questo substrato (1-15 cm3) in un sacchetto di plastica sigillabile (vedere Tabella dei materiali) etichettato con un ID campione univoco (Figura 1A).</li>
	<li>Registrare l'ID del campione, la latitudine, la longitudine, la data, la descrizione del substrato e qualsiasi altra misurazione ambientale locale rilevante per l'esperimento, tra cui la temperatura ambiente e del substrato, il tempo di raccolta, le condizioni del substrato, la presenza di macroinvertebrati associati al substrato e così via. È disponibile un'app per smartphone per semplificare questo processo21.</li>
</ol>3. Preparazione di una serie di imbuti Baermann
<ol><li>Per ogni imbuto, utilizzare le forbici per tagliare un segmento di tubi di gomma (vedi Tabella dei materiali) lungo ~ 3 cm.</li>
	<li>Montare il segmento del tubo sopra l'estremità di un imbuto di plastica (vedere Tabella dei materiali). Questo potrebbe richiedere un certo sforzo in quanto la vestibilità è molto stretta.</li>
	<li>Far scorrere un morsetto per tubi sul tubo di gomma e bloccarlo.</li>
	<li>Per realizzare un portaimbuto, utilizzare un bisturi per tagliare fori circolari di 35 mm di diametro sul fondo di un vassoio di cartoncino per fiale volanti (vedere Tabella dei materiali) che non è stato piegato insieme dal suo orientamento di spedizione piatto. Un vassoio standard può ospitare 12 di questi fori in un array 3 x 4.</li>
	<li>Capovolgere il cartone, piegare i lati una volta (non due volte, come si farebbe per fare un vassoio di fiala mosca) e fissare i lati insieme per elevare il vassoio di cartone invertito (Figura 2).</li>
	<li>Posizionare gli imbuti nei fori, assicurandosi innanzitutto che i morsetti dei tubi siano in posizione chiusa.</li>
</ol><img alt="Impianto di asciugatura a goccia in cartone per bicchieri di plastica rovesciati in laboratorio; processo di essiccazione, uso delle attrezzature." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: Vassoi per fiale volanti di cartone riutilizzati, piegati e tagliati per supportare 12 imbuti Baermann ciascuno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
4. Trasferimento di campioni negli imbuti
<ol><li>Versare acqua (sterile quanto disponibile) in ogni imbuto, riempiendolo di circa 3 cm sotto il bordo. Se le bolle d'aria sono intrappolate nel tubo, toccare l'imbuto per rilasciarle.</li>
	<li>Con le mani guantate, posizionare una salvietta senza lanugine o in particolare un Kimwipe (piegato a metà per fare un quadrato) sopra l'imbuto e premere verso il basso sul centro in modo che sia immerso nell'acqua.</li>
	<li>Rompere manualmente grandi pezzi solidi di substrati naturali (frutta, fiore, terreno, lettiera di foglie, ecc.) in frammenti più piccoli per ridurre al minimo la distanza che i vermi devono percorrere per cadere dal substrato. NOTA: la lettiera di foglie e i campioni di forma goffa possono essere preelaborati in un robot da cucina o in un frullatore.</li>
	<li>Posizionare delicatamente un campione del substrato naturale (1-15 cm3) sulla salvietta priva di tessuto/lanugine in un imbuto senza perforare il tessuto e senza che il campione sporga sopra il bordo.</li>
	<li>Etichetta l'imbuto, o il cartone accanto all'imbuto, con l'ID campione corrispondente alle note di raccolta del campo.</li>
	<li>Piegare gli angoli della salvietta senza tessuto/lanugine sul campione (Figura 1B). Fare attenzione a mantenere il campione contenuto all'interno della salvietta priva di tessuti / lanugine in modo che nessun terreno o detriti possa passare sul fondo dell'imbuto. NOTA: questo passaggio serve a evitare che gli angoli si drappeggino sul bordo dell'imbuto, dove impedirebbero all'acqua di aspirare l'acqua dall'imbuto sui lati.</li>
	<li>Con le mani, una spatola o una punta di pipetta, scegli eventuali insetti attivi, millepiedi o altri animali che possono viaggiare da un imbuto all'altro, contaminando i campioni incrociati. Avvolgere interamente la salvietta priva di tessuti/lanugine attorno al campione o stendere un secondo tessuto sulla parte superiore del campione per evitare la contaminazione incrociata.</li>
	<li>Aggiungere più acqua agli imbuti in modo che l'intero campione sia sommerso (Figura 3).</li>
</ol><img alt="Esperimento del campione di tè con le tecniche di infusione, l'analisi del tempo di macerazione e la configurazione della degustazione." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Imbuti Baermann assemblati. Ogni campione viene avvolto in una salvietta priva di tessuti / lanugine e immerso sott'acqua nell'imbuto, che viene bloccato chiuso. Per un periodo di ~ 12 ore, i nematodi migreranno attraverso il tessuto e sul fondo dell'imbuto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
5. Estrazione dei nematodi dagli imbuti
<ol><li>Attendere ~ 12 ore o durante la notte. Durante questo periodo, i vermi attivi si divincoleranno dal substrato, attraverso la salvietta priva di tessuti / lanugine e giù fino al fondo dell'imbuto bloccato. NOTA: Aspettare molto più a lungo di 12 ore rischia la mortalità dei vermi a causa di ipossia o infezione patogena, che può anche essere un rischio a durate più brevi per campioni particolarmente affollati di vermi e batteri.</li>
	<li>Scrivi l'ID del campione di un imbuto sul fondo di una piastra di verme NGM da 60 mm seminata con una macchia di batteri OP50 E. coli . Rimuovere il coperchio dalla piastra.</li>
	<li>Rimuovere l'imbuto contenente quel campione dal supporto dell'imbuto. Usando una mano per tenere l'imbuto in posizione verticale sopra la piastra a vite senza fine aperta, utilizzare l'altra mano per rilasciare la pressione sul morsetto del tubo, consentendo a una goccia d'acqua di cadere dal tubo sulla piastra a vite senza fine (Figura 1C). Non appena l'acqua scende dall'imbuto, bloccalo rapidamente per evitare di allagare la piastra NGM. NOTA: Per selezionare i vermi attratti da OP50, comprese le specie di Caenorhabditis, rilasciare la goccia lontano dal prato batterico. Quando l'acqua si immerge nel piatto o evapora, i nematodi caenorhabditis strisciano nel prato batterico.</li>
	<li>Pulisci: elimina il contenuto degli imbuti. Lavare gli imbuti con acqua calda per il successivo riutilizzo.</li>
</ol>6. Stabilire le culture
<ol><li>Osservare i nematodi isolati sotto lo stereomicroscopio con un ingrandimento di 5x-50x. Le placche dovrebbero includere nematodi e, a frequenze molto più basse, piccoli anellidi oligocheti, tardigradi, rotiferi e piccoli crostacei (Figura 4). NOTA: se l'imbuto è stato impostato correttamente, nessun acaro, insetto o materiale non vivente visibile avrà attraversato l'imbuto.</li>
</ol><img alt="Immagine al microscopio di nematodi che mostra la densità di popolazione; utile per l'analisi di studi biologici." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: Contenuto della prima goccia rilasciata da un imbuto di Baermann su una piastra NGM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"><li>Per stabilire linee isormafrodite o isofeme, utilizzare un plettro a verme per trasferire ogni ermafrodita L4 o femmina adulta accoppiata (riconoscibile per le loro dimensioni corporee maggiori e la mancanza della coda maschile distinta22) in una piastra NGM separata da 35 mm seminata con OP50 (Figura 1D). Utilizzare un accendino per sterilizzare il plettro prima e dopo il trasferimento dei vermi.</li>
	<li>Utilizzare la pellicola di paraffina per avvolgere accuratamente le piastre per i viaggi.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il principio centrale di questo metodo è che i nematodi passeranno attraverso il tessuto immerso nell'acqua, mentre il loro substrato e i contaminanti invertebrati più grandi non lo faranno. I passaggi critici del protocollo sono (1) la raccolta di un substrato appropriato, (2) l'immersione del substrato, avvolto in un materiale filtrante, in acqua, (3) la raccolta di vermi che sono passati attraverso il filtro e affondati sul fondo dell'acqua e (4) l'isolamento di singoli vermi per creare linee isofemale o isoermafrodite. Tutte le altre parti del metodo sono suscettibili di modifica, se necessario, in base alle risorse disponibili, alla natura dei substrati o agli obiettivi del lavoro sul campo. Alcune modifiche che vale la pena considerare sono le seguenti.
Adescare i vermi piantando frutta Se non c'è un'ampia scorta di materiale in decomposizione ricco di batteri da trovare nel sito di campo, si potrebbe voler portare un campione, come un pezzo di mela o pomodoro, da lasciare marcire. Blocca bene l'esca con alcuni paletti in modo che gli animali più grandi non li rimuovano e quindi possa essere facilmente trovata in seguito per la raccolta. Evitare la luce solare diretta, dove l'esca potrebbe asciugarsi prima che marcisca.
Costruire apparecchi a imbuto con qualsiasi materiale disponibile Qualsiasi struttura con fori abbastanza grandi da ospitare il morsetto del tubo e abbastanza stabile da supportare un imbuto pesante funzionerà. Per un singolo imbuto, un bicchiere da bere è un supporto adatto. È possibile utilizzare qualsiasi tipo di fazzoletto - velina facciale, carta igienica o asciugamani di carta.
Mettere meno materiale negli imbuti o regolare il tempo di attesa per prevenire l'ipossia o l'infezione Se il campione ha una concentrazione molto elevata di vermi o batteri, i nematodi possono iniziare a morire di ipossia o infezione prima che l'incubazione di 12 ore sia completa. Se questo è un problema, il ricercatore può controllare gli imbuti prima o preparare un imbuto aggiuntivo con un sottocampione molto piccolo del substrato altamente popolato.
Adattamento della preparazione della piastra NGM alle esigenze e ai vincoli sperimentali Le piastre NGM possono essere preparate con qualsiasi mezzo e fonte di cibo sia appropriata per l'esperimento. Il protocollo di campo sopra descritto è progettato per ridurre al minimo il peso del bagaglio. A seconda delle limitazioni del bagaglio e dei tempi di lavoro sul campo, portare piastre NGM già versate - preparate in laboratorio o acquistate commercialmente - può essere preferibile piuttosto che versare piastre sul campo.
Esecuzione degli isolamenti dell'imbuto in laboratorio Il protocollo descrive l'esecuzione della procedura completa in condizioni di campo per catturare la popolazione di nematodi come si verifica in natura. Per alcuni obiettivi di ricerca, potrebbe essere sufficiente isolare i nematodi in seguito, dopo essere tornati in laboratorio con campioni in sacchetti sigillati. Anche allora, il metodo dell'imbuto di Baermann fornisce un campione più pulito e completo dei nematodi sopravvissuti rispetto ad altri metodi di isolamento. Tuttavia, i campioni in sacchetti sigillati possono subire la selezione durante il viaggio, in quanto sono esposti a potenziali estremi di temperatura e ipossia. Questo può essere ridotto al minimo eseguendo isolamenti il prima possibile dopo la raccolta del campione.
Un metodo alternativo comune all'imbuto di Baermann prevede il posizionamento del substrato direttamente su una piastra NGM e l'attesa che i vermi strisciano fuori, il che è altamente laborioso o si traduce nella raccolta incompleta della popolazione. Produce anche piastre contaminate da acari e larve di insetti. Il metodo dell'imbuto di Baermann è una strategia a basso costo, a bassa tecnologia e a basso lavoro per separare rapidamente l'intera popolazione di vermi attivi dal loro substrato.
Il metodo dell'imbuto di Baermann non è universalmente applicabile per la raccolta di tutti i tipi di nematodi selvatici. Alcuni nematodi che vivono nelle piante impiegano molto più di 12 ore per emergere dal loro substrato e saranno assenti da una goccia rilasciata troppo presto, mentre alcuni parassiti di insetti strisciano verso la parte superiore dell'imbuto piuttosto che verso il basso, eludendo anche la raccolta14. Le alternative all'imbuto di Baermann richiedono attrezzature più specializzate o più manodopera per recuperare i vermi. Tuttavia, possono ancora essere preferiti se gli avvertimenti di cui sopra sono un problema per l'esperimento. Le opzioni alternative, esaminate da van Bezooijen14, includono il metodo di spruzzatura a imbuto, che fornisce una nebbia costante di acqua agli imbuti, aggiungendo ossigeno e consentendo il trabocco di batteri in sospensione. Ciò consente un periodo di estrazione più esteso dei nematodi dalle piante. Il metodo di flottazione centrifuga del frullatore recupera i nematodi a movimento lento, inattivi o striscianti verso l'alto separandoli in base al loro peso specifico, l'elutriatore Oostenbrink applica una corrente sotterranea per separare i sedimenti di sedimentazione dai nematodi sospesi e il metodo di Cobb utilizza una serie di setacci per isolare i nematodi in base alle loro dimensioni, forma e velocità di sedimentazione14. Per raccogliere i rabditidi, tuttavia, l'imbuto di Baermann produce efficacemente campioni puliti rapidamente e con il minimo sforzo.

Preziose intuizioni biologiche stanno emergendo mentre i ricercatori che studiano C. elegans in laboratorio espandono la loro attenzione a C. elegans e ai relativi nematodi rabditidi in natura. Gli studi sui nematodi selvatici collocano geni e genomi nel loro contesto naturale, rivelando funzioni potenzialmente oscurate dalle condizioni di laboratorio1,2,3,4,5. Questi studi generano approfondimenti sul prerequisito per l'evoluzione stessa, la variazione genetica6,7,8,9,10. La variazione genetica naturale catturata da campioni selvatici fornisce anche incursioni nella base genetica di molti tratti complessi11,12,13.
Quando si progettano studi che richiedono l'isolamento di popolazioni naturali di nematodi, in particolare quando si esegue il lavoro sul campo a distanza, le considerazioni pratiche vengono alla ribalta. Questo protocollo mira a isolare in modo pulito intere popolazioni di nematodi attivi che possono essere coltivati su OP50 da esche o substrati selvatici. Il metodo è adatto per l'estrazione di nematodi rabditidi e diplogasteridi a vita libera, tra cui Caenorhabditis, Oscheius e Pristionchus.
Esistono molte tecniche per isolare i nematodi dai loro substrati14,15. L'approccio più semplice è quello di posizionare il substrato direttamente su una piastra media di nematodi, raccogliendo gli animali mentre strisciano fuori8,15. Questo metodo richiede grandi quantità di tempo e lavoro se l'obiettivo è isolare tutti i nematodi da un campione. Tecniche più sofisticate sfruttano il peso, le dimensioni, la mobilità o una combinazione di questi animali14. Ogni metodo ha i suoi vantaggi e svantaggi in termini di configurazione e throughput. Differiscono anche nei loro pregiudizi di campionamento e possono selezionare alcuni nematodi se gli animali nel campione variano lungo l'asse del principio di separazione del metodo.
Il metodo dell'imbuto di Baermann fu descritto per la prima volta nel 1917 dal medico olandese G. K. T. F. Baermann, che inventò il dispositivo su Giava mentre studiava i nematodi che abitavano il suolo, incluso l'anchilostoma parassita16. L'imbuto Baermann funziona in base al principio della mobilità. Il substrato viene posto in un imbuto rivestito con un filtro di stoffa o carta (per questo studio viene utilizzato un "Kimwipe", indicato come "salvietta senza lanugine" nel protocollo corrente) e sigillato chiuso nella parte inferiore. L'imbuto viene quindi riempito d'acqua, immergendo il campione mentre il filtro lo separa dall'uscita sigillata. I nematodi attivi nel campione si rilasciano nell'acqua e nuotano attraverso il filtro, depositandosi infine sul fondo dell'imbuto. L'uscita dell'imbuto viene aperta e una goccia di nematodi viene espulsa su una piastra (Figura 1).
<img alt="Processo di decomposizione, estrazione dell'imbuto Berlese, diagramma di isolamento degli insetti, impostazione dello studio entomologico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: Sintesi della tecnica dell'imbuto di Baermann. (A) Raccolta di un campione ricco di batteri da un sito di interesse. (B) Immergere il campione in un imbuto di Baermann e attendere che i vermi si divincolino e affondino. (C) Rilascio di una singola goccia dall'imbuto. (D) Spostamento di singoli ermafroditi o femmine accoppiate in piastre separate. Illustrazione creata da Ramin Rahni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
L'imbuto di Baermann non funziona per ogni tipo di nematode (vedere la sezione Discussione per alternative specifiche) ed è più adatto a quelle che sono forme attive nella gamma di dimensioni di Caenorhabditis o più piccole14. Tuttavia, se uno studio può utilizzare l'imbuto Baermann, ci sono molti vantaggi. Il metodo è pratico sul campo, richiede una configurazione limitata, tempo pratico e costi. Il ricercatore viene lasciato con un campione pulito senza l'ostruzione del substrato sulla piastra, il che rende facile la raccolta. L'uso di un filtro impedisce anche la contaminazione della piastra da parte di larve di insetti o acari, che masticano piastre o predano i nematodi nel campione. Ancora più importante, l'imbuto di Baermann estrae in modo efficiente quasi l'intera popolazione dal substrato14, che può essere richiesto a seconda del disegno dello studio. Ad esempio, i ricercatori interessati a contare lo stadio o la distribuzione del sesso delle popolazioni selvatiche, a trovare genotipi rari o a crescita lenta o a campionare nematodi non attratti da OP50 potrebbero trarre beneficio da questo metodo. Questo è appropriato per i ricercatori che studiano domande ecologiche17, genetiche di popolazione18 o metagenetiche19 poiché lo schema di campionamento scatta un'istantanea della popolazione al momento del campionamento.
Il presente manoscritto descrive un protocollo completo per isolare popolazioni di nematodi utilizzando l'imbuto di Baermann e stabilire linee isofemale e isormafrodite sul campo, utilizzando attrezzature scelte per un facile trasporto. Per i ricercatori che conducono il lavoro sul campo vicino ai loro laboratori, molti di questi passaggi possono essere omessi o semplificati.

<table><tbody><tr><td>Bottiglia di vetro da 1 L</td><td>NA</td><td></td><td>Fase 1 - recipiente per la produzione di piastre per piastre</td></tr><tr>1<td>ml di puntali per pipette</td><td>qualsiasi</td><td>NA</td><td>Fase 1 - erogazione di additivi per terreni a vite senza fine e piastre di semina</td></tr> 1 <tr><td>ml di pipetta</td><td>qualsiasi</td><td>NA</td><td>Fase 1 - erogazione di additivi per terreni a vite senza fine e piastre di semina</td></tr> piastre <tr><td>a vite senza fine da 35 mm</td><td>Tritech</td><td>T3500</td><td>Fase 1 - piastre a vite senza fine</td></tr><tr><td>tubo in gomma con ID da 4 mm</td><td>Fisher</td><td>14178A</td><td>Passaggio 3 - parte dell'imbuto</td></tr><tr><td>Piastre a vite senza fine da 60 mm</td><td>Greiner</td><td>628161</td><td>Passaggio 1 - Piastre a vite senza fine</td></tr><tr><td>Imbuto da 65 mm</td><td>Fisher</td><td>22170156</td><td>Passaggio 3 - parte dell'imbuto</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Fisher</td><td>C79-500</td><td>Passaggio 1 - piastra a vite senza fine medio</td></tr><tr><td>Pentola</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Passaggio 1 - un bagno d'acqua per sciogliere l'agar per versare le piastre</td></tr><tr><td>E. coli ceppo OP50</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP50</td><td>Passaggio 1 - cibo per vermi</td></tr><tr><td>Microscopio da campo</td><td>OMAX</td><td>G223CS</td><td>Passaggio 6 - per la visualizzazione dei vermi sul campo</td></tr><tr><td>Vassoio per la conservazione delle fiale di mosche</td><td>Azer Scientific</td><td>ES-260T</td><td>Passaggio 3 - per costruire una piattaforma per contenere 12 imbuti</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante o stufa</td><td>NA</td><td>NA Passaggio</td><td>1 - per riscaldare il bagno d'acqua</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>KimberlyClark</td><td>34120</td><td>Passaggio 4 - filtro per gli imbuti</td></tr><tr><td>LB media</td><td>Gibco</td><td>10855021</td><td>Passaggio 1 - per la coltivazione OP50</td></tr><tr><td>Lighter</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Passaggio 6 - sterilizzare il raccoglitore di vite senza fine</td></tr><tr><td>Solfato</td><td>di magnesio Fisher</td><td>M63-500</td><td>Passaggio 1 - mezzo per piastra a vite senza fine</td></tr><tr><td>NGM-lite agar</td><td>USBiological</td><td>N1000</td><td>Passaggio 1 - mezzo</td></tr> <tr><td>per piastra a vite senza finePellicola di avvolgimento Parafilm M</td><td>Fisher</td><td>13-374-10</td><td>Passaggio 6 - confezione piastre a vite senza fine per viaggi</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio bibasico</td><td>Fisher</td><td>BP363-500</td><td>Passaggio 1 - piastra a vite senza fine media</td></tr><tr><td>Fosfato di potassio monobasico</td><td>Fisher</td><td>P285-3</td><td>Passaggio 1 - piastra a vite senza fine bisturi medio</td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td>NA</td><td>Passaggio 3 - tagliare i fori per le forbici a imbuto</td></tr><tr><td></td><td>NA</td><td>NA</td><td>Passaggio 3 - tagliare il tubo di gomma</td></tr><tr><td>Nastro</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Passaggio 3 - fissare insieme il supporto dell'imbuto</td></tr><tr><td>Morsetti per tubi</td><td>Fisher</td><td>5869</td><td>Passaggio 3 - parte dell'imbuto</td></tr><tr><td>Raccoglitore di vermi</td><td>NA</td><td>NA Passaggio</td><td>6 - per isolare i singoli vermi</td></tr><tr><td>Sacchetti di conservazione in stile chiusura lampo</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Passaggio 2 - per insaccare un campione di substrato</td></tr></tbody></table>

rapido isolamento dei nematodi selvatici di baermann funnel

Rapid Isolation of Wild Nematodes by Baermann Funnel

Oltre ad essere robusti organismi modello sperimentali, Caenorhabditis elegans e i suoi parenti sono anche veri animali che vivono in natura. Gli studi sui nematodi selvatici nei loro ambienti naturali sono preziosi per comprendere molti aspetti della biologia, compresi i regimi selettivi in cui si evolvono caratteri genomici e fenotipici distintivi, la base genetica per la variazione dei tratti complessi e la diversità genetica naturale fondamentale per tutte le popolazioni animali. Questo manoscritto descrive un metodo semplice ed efficiente per estrarre i nematodi dai loro substrati naturali, tra cui frutti in decomposizione, fiori, funghi, lettiera di foglie e suolo. Il metodo dell'imbuto di Baermann, una tecnica classica di nematologia, isola selettivamente i nematodi attivi dai loro substrati. Poiché recupera quasi tutti i vermi attivi dal campione, la tecnica dell'imbuto di Baermann consente il recupero di genotipi rari e a crescita lenta che coesistono con genotipi abbondanti e a crescita rapida, che potrebbero mancare nei metodi di estrazione che coinvolgono più generazioni di riproduzione. La tecnica è anche adatta ad affrontare questioni metagenetiche, genetiche di popolazione ed ecologiche. Cattura l'intera popolazione in un campione contemporaneamente, consentendo una visione imparziale della distribuzione naturale di età, sessi e genotipi. Il protocollo consente l'implementazione su larga scala sul campo, convertendo rapidamente i substrati in piastre worm, e gli autori lo hanno convalidato attraverso il lavoro sul campo in più continenti.

Questo protocollo è stato utilizzato per isolare i nematodi da frutta, fiori, funghi, suolo e steli sull'isola di Barro Colorado, Panamá, presso la stazione di campo dello Smithsonian Tropical Research Institute nell'agosto del 2018. Dei 131 substrati elaborati da un singolo investigatore in quattro giorni, 130 substrati (99,2%) hanno prodotto nematodi. Quarantaquattro dei substrati (33,6%) hanno prodotto nematodi Caenorhabditis (Figura 5). Successive analisi di colture stabilite da questi quarantaquattro substrati, mediante PCR e test di accoppiamento23, hanno rivelato la presenza di sei diverse specie di Caenorhabditis : C. becei, C. tropicalis, C. briggsae, C. sp. 24, C. sp. 57 e C. panamensis.
Questo protocollo è stato nuovamente utilizzato per isolare i nematodi da vari substrati nella zona di esclusione di Chernobyl, in Ucraina, per quattro giorni nell'agosto del 2019. I vermi vivi sono stati recuperati da 62 su 63 campioni di suolo, 1 su 17 campioni di invertebrati, 31 su 75 campioni di frutta, 1 su 12 campioni di esca (vedi sezione Discussione) e nessun verme è stato recuperato da campioni di funghi, canne di fiume o feci di lupo (un campione raccolto di ciascuno). Il successivo sequenziamento del DNA ribosomiale 18S15 ha identificato questi nematodi come Oscheius, Panagrolaimus, Acrobeloides, Mesorhabditis, Panagrellus, Pristionchus e Pelodera, ma non è stata identificata alcuna Caenorhabditis (Figura 5).
<img alt="Grafico a barre dei campioni di nematodi e Caenorhabditis a Panama, Ucraina per località e percentuale raccolta." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63287/63287fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: Percentuali di successo di due viaggi di raccolta. Panama nel 2018 (a sinistra) e Ucraina nel 2019 (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63287/63287fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo delinea un metodo per estrarre in modo efficiente nematodi vivi da substrati naturali sul campo.

Rapido isolamento dei nematodi selvatici di Baermann Funnel

Beyond being robust experimental model organisms, Caenorhabditis elegans and its relatives are also real animals that live in nature. Studies of wild ...

I nematodi Caenorhabditis sono animali reali, che vivono in natura. La raccolta di nematodi selvatici, ci permette di studiare geni e genomi nel loro contesto naturale rivelando funzioni, che possono essere oscurate dalle condizioni artificiali del laboratorio. Questa tecnica, estrae i vermi, da substrati organici ricchi di batteri nel campo, e crea colture pulite su piastre di Petri, catturando un'istantanea di ogni popolazione, al momento della raccolta.Queste popolazioni sono adatte all'ecologia, alla genetica delle popolazioni o alle domande di metagenetica. Le colture di ceppi selvatici sono anche preziose per studi genetici quantitativi. Questa tecnica è semplice e facile da eseguire, anche per un principiante della ricerca sul campo.Tuttavia, un viaggio di raccolta di successo, richiede una preparazione ponderata dei materiali, prima di viaggiare. Identifica un substrato ricco di batteri nel campo, come frutta in decomposizione, fiori, funghi, steli di piante erbacee, terreno o lettiera di foglie. Posizionare un piccolo volume del substrato, in un sacchetto di plastica etichettato.Se il materiale in decomposizione è raro nel lato di interesse del campo, posiziona un po 'di frutta come esca. Lascialo dondolare, quindi recuperalo e tutti i vermi che lo hanno colonizzato. Registrare l'ID campione, la latitudine, la longitudine, la data e la descrizione del substrato.Registrare qualsiasi altra misurazione ambientale locale, rilevante per l'esperimento, come la temperatura ambiente e del substrato, le condizioni del substrato, il tempo di raccolta e la presenza di macro invertebrati associati al substrato. Usa le forbici per tagliare un segmento di tre centimetri, di tubi di gomma da ogni imbuto. Montare il tubo sopra l'estremità di un imbuto di plastica.Far scorrere un morsetto per tubi sul tubo di gomma e bloccarlo. Per realizzare un supporto a imbuto, tagliare fori circolari, al centro di un vassoio vile di cartone aperto. Capovolgere il cartone, piegare i lati una volta e fissarli insieme.Questo creerà gambe, che elevano i fori sopra la panca. Assicurarsi che i morsetti per tubi siano in posizione chiusa e posizionare gli imbuti nei fori. Versare acqua sterile in ogni imbuto, riempiendolo di circa tre centimetri sotto il bordo.Toccare l'imbuto, per rilasciare eventuali bolle d'aria intrappolate nel tubo. Piegare una salvietta senza lanugine a metà, per fare un quadrato, e posizionarla sopra l'imbuto. Quindi, premere il pulire verso il basso, per immergerlo nell'acqua.Rompere manualmente eventuali pezzi solidi di grandi dimensioni, del substrato naturale. Posizionare delicatamente parte del campione sulla salvietta nell'imbuto. Assicurarsi di non forare la salvietta o lasciare qualsiasi campione sporgente sopra il bordo.Piegare con cura gli angoli della salvietta, sopra il campione, per evitare che l'acqua fuoriesca, oltre il bordo dell'imbuto. Etichettare l'imbuto con l'ID campione, corrispondente alle note di raccolta dei campi. Scegli eventuali insetti attivi, o altri animali, che possono viaggiare e contaminare i campioni.Aggiungere più acqua ad ogni imbuto, per immergere l'intero campione. Durante l'incubazione a temperatura ambiente durante la notte, i nematodi attivi si muoveranno attraverso il tessuto e affonderanno sul fondo dell'imbuto. Scrivi l'ID campione di un imbuto, sul fondo di una piastra di verme NGM di sei centimetri, seduto con una macchia di batteri OP50 E.coli.Rimuovere il coperchio dalla piastra, rimuovere l'imbuto, contenente il campione dal supporto dell'imbuto, e tenerlo in posizione verticale, sopra la piastra a vite senza fine aperta, con una mano. Rilasciare la pressione sul morsetto del tubo con l'altra mano e lasciare che una o due gocce d'acqua cadano dal tubo, sulla piastra di verme accanto al prato batterico. Non appena l'acqua scende dall'imbuto, bloccalo rapidamente di nuovo, per evitare di allagare la piastra NGM.Per pulire, buttare via il contenuto degli imbuti e lavarli con acqua calda, per il successivo riutilizzo. Osservare i nematodi isolati al microscopio stereo. Oltre ai nematodi, ci saranno occasionalmente piccoli, Oligo kit anellidi, tardigradi, rotiferi e piccoli crostacei.Per stabilire linee ermafrodite ISO, o linee femminili ISO, trasferire ogni ermafrodita L4 o femmina adulta accoppiata, in una piastra NGM separata di 3,5 centimetri, seduta con OP50. Sterilizzare il prelievo del verme, prima e dopo ogni trasferimento. Infine, avvolgere accuratamente le piastre per i viaggi, con un film di paraffina.Sull'isola di Barro Colorado Panama, nel 2018, 131 substrati sono stati elaborati con questo metodo. Il 99% dei quali ha prodotto nematodi. Il 34% ha prodotto nematodi Caenorhabditis.Nella zona di esclusione di Chernobyl in Ucraina, nel 2019, 170 substrati sono stati elaborati con questo metodo. Il 56% dei quali produceva nematodi, nessuno dei quali era Caenorhabditis. Questo metodo funziona perché i nematodi nuotano attraverso la salvietta.ma il substrato e altri animali rimangono in cima. Molti aspetti di un protocollo possono essere modificati, per utilizzare qualsiasi risorsa disponibile sul campo. I campioni raccolti utilizzando questo metodo, consentono ai ricercatori di affrontare una vasta gamma di domande di biologia della popolazione in colture consolidate per successivi studi di laboratorio.

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Visualizzare batteri nei nematodi usando la microscopia a fluorescenza

Fonte: Morgan, E., et al. Pulizia selettiva dei nematodi selvatici Caenorhabditis per arricchire i batteri del microbioma intestinale. J. Vis. Esp. (2021)Questo video mostra un protocollo per isolare batteri intestinali di interesse provenienti dai vermi selvatici di Caenorhabditis . I vermi vengono prima affamati e lavati per eliminare i batteri residui che si nutrono dalla superficie e dal lumen intestinale, preservando al contempo i microrganismi bersaglio. Dopo la pulizia della superficie e...

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Rapido isolamento dei nematodi selvatici di Baermann Funnel

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