Manipolazione subcellulare spaziotemporale del citoscheletro del microtubulo nell'embrione di topo vivente preimpianto utilizzando le fotostattine

Questo protocollo è il primo del suo genere ad applicare fotottina sull'embrione di topo vivente preimpianto e riguarda l'uso di farmaci commutabili dalla luce su altri sistemi fisiologici 3D. Le fototizzate commutabili alla luce consentono di manipolare la crescita dei microtubuli, nello spazio e nel tempo, e di essere riconvertite in uno stato spento. Esporre involontariamente le fotottina alla luce blu, prima dell'esperimento, può attivarle prematuramente.

Quindi ti consigliamo di lavorare in completa oscurità, o in condizioni di luce rossa, in ogni momento durante la preparazione dei campioni. In condizioni di buio rigoroso, utilizzando solo la luce rossa per l'illuminazione, iniziare a fare stock e soluzione di lavoro intermedia di PST-1P in acqua ultrapura. Come descritto nel testo manoscritto.

Quindi, diluire PST-1P in KSOM fresco per raggiungere la concentrazione finale di 40 M.To preparare il vetrino della camera per l'imaging dal vivo, aggiungere 10 L di KSOM trattato con PST-1P al centro di un pozzo, per formare una goccia emisferica. Per evitare che la goccia evapori, coprirla con olio minerale sufficiente. Quindi, avvolgere liberamente il piatto di coltura preparato in un foglio o posizionare il piatto di coltura in un contenitore opaco non ermetico nell'incubatrice per garantire che non vi sia esposizione alla luce.

Dopo aver trasferito gli embrioni nella goccia KSOM trattata con PST-1P, assicurarsi che gli embrioni siano raggruppati al centro della goccia e sistemati sul fondo del piatto. Una volta preparata la lente dell'obiettivo ad immersione, montare il vetrino della camera sul microscopio, all'interno di una camera ambientale. Impostato a 37 C e 5% di CO2, e nella completa oscurità, per garantire che tutti i PST-1P siano nella trans-configurazione inattiva e che gli embrioni possano affondare sul fondo del piatto.

Utilizzare una torcia a luce rossa per posizionare l'obiettivo a contatto con il mezzo di immersione. Quindi, individuare il bordo della goccia del mezzo e posizionare l'obiettivo direttamente su di esso. Utilizzando la modalità di scansione dal vivo e un laser a 561 nm, individuare gli embrioni all'interno della goccia.

Usa i controller di scena e la modalità di scansione dal vivo per impostare i punti di inizio e fine per acquisire uno z-stack dell'intero embrione. Regola le impostazioni di potenza del laser fino a un massimo del 5% in base al tuo segnale. E imposta l'offset digitale su un massimo di 0,900, in base al tuo segnale, per ottimizzare l'aspetto delle comete EB3-dTomato.

Ridurre al minimo il rumore di fondo. Impostare il foro stenopeico a 2 m. Risoluzione pixel a 512 per 512.

E il tempo di permanenza dei pixel a 3,15 s. E imposta lo zoom su 2x. Acquisire una pila z dell'intero embrione con intervalli di sezione di 1 m per valutare le aree di crescita dei microtubuli nell'intero organismo.

Per gli esperimenti di tracciamento delle comete EB3-dTomato, aprire l'immagine z-stack 3D, aumentare lo zoom a tre volte. E disegna un ROI rettangolare attorno alla specifica area subcellulare di interesse. Quindi, acquisire il filmato time lapse di un singolo piano z, utilizzando i parametri impostati, con l'intervallo di tempo di 500 ms.

Per attivare PST-1P, passare a un laser a 405 nm e acquisire un altro time-lapse, con il laser impostato al 10% di potenza, il foro stenopeico aperto al massimo, la risoluzione dei pixel di 512 per 512, il tempo di permanenza dei pixel di 3,15 s, lo zoom di tre volte, a un intervallo di tempo di 500 ms e impostare 20 fotogrammi da acquisire. Immediatamente dopo l'attivazione, tornare al laser a 561 nm e ripetere l'acquisizione, come dimostrato in precedenza, per confermare la perdita di comete EB3-dTomato dopo l'attivazione di PST-1P. Ora, per invertire PST-1P al suo trans-stato inattivo, attivare un laser a 514 nm e acquisire un altro time-lapse con i parametri impostati.

Per visualizzare il recupero delle comete EB3-dTomato, tornare al laser a 561 nm e ripetere l'acquisizione. Negli embrioni di controllo non trattati, prima dell'illuminazione con un laser a 405 nm, il segnale EB3-dTomato era alto all'interno dell'intero citoplasma della cellula, ad eccezione dell'area nucleare. Post illuminazione, i cambiamenti nel segnale non sono stati rilevati.

Indicando che il laser a 405 nm non ha causato danni fotografici all'embrione o alla dinamica dei microtubuli. Durante il trattamento PST-1P di embrioni in stadio a 16 cellule, in condizioni di oscurità rigorose, nell'immagine 3D è stata rilevata una forte espressione di EB3-dTomato, dimostrando che PST-1P inattivo non ha provocato l'inibizione della polimerizzazione dei microtubuli in condizioni di oscurità. Prima dell'attivazione di PST-1P, l'imaging time-lapse di un singolo piano z ha confermato una forte espressione di EB3-dTomato e la polimerizzazione dei microtubuli in una regione subcellulare.

Dopo l'attivazione della luce a 405 nm, in pochi secondi, è stata rilevata una riduzione del segnale della cometa EB3-dTomato. E il recupero del segnale è stato ottenuto dopo la disattivazione di PST-1P, utilizzando un laser a 514 nm. Gli embrioni micro iniettati con EB3-dTomato e incubati con PST-1P, hanno mostrato un potenziale embrionale normale, sviluppandosi fino allo stadio di blastocisti.

E la normale dinamica dei microtubuli durante la mitosi. Indicare la non tossicità di un PST-1P attivo per l'embrione. Nei filmati time-lapse acquisiti, l'etichettatura EB3-dTomato appariva come strutture simili a comete e consentiva il tracciamento dei filamenti di microtubuli in crescita.

Negli embrioni trattati con PST-1P, tenuti in condizioni di oscurità, le singole comete EB3-dTomato emanavano dal ponte interfase, che agisce come un centro di organizzazione dei microtubuli non centrosomiali nell'embrione di topo precoce. Un t-stack mostra le comete EB3-dTomato nella regione del ponte interfase. Dopo l'attivazione di PST-1P, le comete EB3-dTomato sono state ridotte alla base del ponte interfase e nel t-stack.

Ricorda che la luce bianca può attivare PST-1P prematuramente. Quindi usa solo fonti di luce rossa per la visibilità. La luce verde disattiva anche PST-1P, quindi evita di utilizzare marcatori di etichette fluorescenti verdi.

Questa tecnica è stata utilizzata in drosophila, ameba, topi e sistemi multipli in vitro, per indirizzare la crescita dei microtubuli al fine di studiare la migrazione cellulare e la formazione dei tessuti.