Visualizzazione del traffico citoscheletro-dipendente di organelli contenenti lipidi in embrioni di Drosophila

Nel primo embrione di Drosophila, molti organelli subiscono un movimento su larga scala. Il nostro protocollo descrive come monitorare questo movimento utilizzando coloranti fluorescenti sviluppati per la coltura cellulare. Rispetto alle proteine fluorescenti, le sonde fluorescenti disponibili in commercio sono più luminose e coprono una gamma più ampia dello spettro.

Consentono la colabeling multiplex e possono essere utilizzati in qualsiasi background genetico. Ci vuole pratica e tentativi ed errori per sapere quanto tempo per essiccare gli embrioni, in modo che scoppino durante l'iniezione o si secchino e smettano di svilupparsi. Per iniziare, iniziare a preparare gli aghi per iniezione posizionando il capillare in un supporto capillare sull'estrattore dell'ago e fissandolo con i dadi alari.

Allineare il centro del capillare con l'elemento riscaldante. Secondo le istruzioni del produttore, scegliere le impostazioni appropriate sull'estrattore dell'ago. Utilizzando un microscopio di dissezione, eseguire il test di controllo qualità.

Premere gli aghi nello stucco orizzontalmente con le punte dell'ago sospese nell'aria. Coprire gli aghi con il coperchio e conservare fino all'uso. Utilizzando punte di carico dell'ago attaccate a una micropipetta, aspirare un microlitro della soluzione di iniezione nella punta senza intrappolare bolle d'aria.

Usando i guanti, tenere l'ago in una mano con la punta rivolta verso l'esterno e inserire la punta di carico in esso. Erogare il liquido vicino alla punta dell'ago, rimuovere la pipetta e tenere l'ago verticalmente fino a quando il liquido scorre verso la punta. Coprire il contenitore con un foglio di alluminio senza danneggiare le punte degli aghi per evitare lo sbiancamento dei coloranti.

Utilizzando una pipetta di trasferimento o un micropipettero, posizionare una piccola goccia di colla eptana al centro di una scivolata di copertura rettangolare e lasciarla evaporare. Per rimuovere meccanicamente il corion, coprire la piastra embrionale opportunamente invecchiata con un sottile strato di olio di alocarbonio 27 per trasformare il guscio d'uovo trasparente. Visualizza la piastra sotto un microscopio di dissezione con illuminazione trans per confermare lo stadio embrionale e selezionare gli embrioni nelle fasi di scissione.

Usando una pinzetta fine, raccogli un embrione dello stadio desiderato afferrando le appendici dorsali e trasferiscilo sul vetrino preparato coperto con nastro biadesivo. Posizionare l'embrione sul nastro e ridurre al minimo il trasferimento di olio. Arrotolare delicatamente l'embrione sulla superficie del nastro spingendo con il lato della punta della pinzetta senza colpirlo direttamente.

Continuare a rotolare l'embrione fino a quando il corion aderisce al nastro e si incrina. Dopo che il corion si è incrinato, continua a rotolare l'embrione per separarlo dal corion, che rimane attaccato al nastro. Arrotolare l'embrione sul corion, che è meno adesivo del nastro.

Strofinare delicatamente l'embrione con le pinzette fino a quando non si attacca alle pinzette per il trasferimento. Quindi, trasferire l'embrione sul coperchio e portarlo a contatto con la colla per tenere l'embrione in posizione, separandolo dalle pinzette. Regolare l'orientamento dell'embrione sul coperchio.

Lasciare che gli embrioni si secchino per cinque-12 minuti posizionando il coperchio con gli embrioni nella camera di essiccazione e sigillandolo. Togliere il coperchio dalla camera e mettere una goccia di olio di alocarbonio 700, coprendo gli embrioni per evitare ulteriori essiccazioni. Esaminarli sotto l'ambito di dissezione e procedere alla microiniezione se gli embrioni sono stati essiccati correttamente.

Posiziona l'obiettivo 4X nel percorso della luce e, utilizzando la manopola di messa a fuoco sul microscopio, regola gli embrioni a fuoco. Sposta gli embrioni orizzontalmente al centro del campo visivo usando i controlli del palcoscenico. Tenere gli embrioni ai margini del campo visivo e allontanarsi in preparazione per abbassare l'ago.

Rimanendo sullo stesso piano focale, abbassare la punta dell'ago e assicurarsi che sia visibile nel campo visivo insieme agli embrioni. Controllare che l'ago funzioni erogando parte della soluzione di iniezione in olio di alocarbonio 700. In caso di successo, una bolla di soluzione apparirà nell'olio vicino alla punta dell'ago.

Usando i controlli di stadio, spostare l'embrione verso la punta dell'ago fino a quando la punta non perfora delicatamente l'embrione ed entra in esso. Contemporaneamente, iniziare il flusso della soluzione iniettabile fino a quando non appare un punto chiaro transitorio nel sito della punta dell'ago, indicando il successo del trasferimento della soluzione nell'embrione. Fissare il coperchio sul microscopio confocale utilizzando il supporto del vetrino.

Prestare attenzione in quanto lo slittamento del coperchio è fragile. Ispezionare gli embrioni utilizzando la funzione di epifluorescenza sul microscopio confocale con un obiettivo 40X e assicurarsi che il fluoro 4 nell'embrione sia visibile prima di procedere. Per l'imaging dal vivo, durante le fasi sinciziali, impostare le dimensioni dell'immagine di 512 x 512 pixel, la media delle linee di tre e una frequenza fotogrammi di 0,1 fotogrammi al secondo.

Dopo l'iniezione del colorante BODIPY 493 503, è stato localizzato nel sito in cui è stata inserita la punta dell'ago e quindi diffuso adiacente al sito di iniezione. Dopo 24 minuti, il colorante si è diffuso oltre il punto medio dell'embrione. La motilità degli organelli è stata monitorata iniettando nell'embrione BODIPY 493 503 e LysoTracker Red.

L'analisi velocimetrica dell'immagine delle particelle ha rivelato che il contenuto embrionale convergeva sulla regione centrale dell'embrione, dove il citoplasma scorre all'interno dell'embrione. L'etichettatura dell'ER, utilizzando ER-Tracker Green, fornisce una risoluzione vivida dell'involucro nucleare, consentendo la visualizzazione delle principali fasi del ciclo cellulare. L'embrione è stato iniettato con MitoView 633 allo stadio di blastoderma e ripreso quattro ore dopo.

L'immagine mostra una cellula neuroectodermica di un embrione in estensione della banda germinale. Un embrione cellularizzante è stato iniettato con una miscela di BODIPY 493 503 e Tubulina SiR, che mostra che le goccioline lipidiche si muovono bidirezionalmente lungo i microtubuli. L'embrione deve essere parzialmente essiccato in modo che il liquido possa essere iniettato.

Troppo poco essiccazione causerà la fuoriuscita dell'embrione quando iniettato, troppo essiccazione ucciderà l'embrione. I video di organelli in movimento possono essere caratterizzati attraverso diverse tecniche di analisi delle immagini. Il tracciamento delle particelle rivela il comportamento dei singoli organelli, la velocimetria di imaging delle particelle rivela il flusso di massa.