Analisi video al microscopio ad alta velocità per la diagnosi di prima linea della discinesia ciliare primaria
19 gennaio 2022
L'analisi videomicroscopica ad alta velocità è uno strumento relativamente facile da eseguire, veloce, economico e, in mani esperte, uno strumento considerevolmente affidabile per la diagnostica di prima linea della discinesia ciliare primaria, che dovrebbe essere disponibile in ogni centro coinvolto nella diagnostica e nel trattamento di gravi malattie polmonari.
L'analisi video al microscopio ad alta velocità è uno strumento affidabile per la diagnostica di prima linea della discinesia ciliare primaria. Questa tecnica è relativamente facile da eseguire, veloce, economica e in mani esperte altrimenti uno strumento molto affidabile. Ed è applicabile a pazienti di tutte le età.
La videomicroscopia rivela anche la funzione ciliare secondaria. Come, ad esempio, a causa di infezioni batteriche o virali. Ma è stato utilizzato principalmente per diagnosticare la discinesia ciliare primaria.
Gli scienziati usano questo metodo anche per visualizzare i processi intracellulari o le funzioni biologiche nelle cellule viventi. Ad assistermi in questa procedura ci sarà la signora Tina Peromaa, il nostro tecnico di laboratorio.
Prima di raccogliere le cellule epiteliali respiratorie, chiedere al paziente di soffiarsi accuratamente il naso. Quando il paziente è pronto, tenere la testa del paziente fissata con una mano e utilizzare un pennello interdentale di 0,6 millimetri nell'altra mano per spazzolare il turbinato inferiore della narice per raccogliere sufficienti strisce di cellule epiteliali. Rilasciare le strisce cellulari raccolte in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente il DMEM nutrito con cellule.
Dopo aver chiuso il coperchio del tubo microcentrifuga, tenere il tubo contro la fonte di luce e scuotere il tubo per scoprire strisce e conglomerati cellulari raccolti. Successivamente, posizionare i tubi microcentrifuga con i coperchi correttamente chiusi in una scatola di polistirolo. Prima di chiudere saldamente la scatola, assicurarsi che i tubi siano fissati all'interno della scatola.
Quindi aggiungere un impacco freddo alla scatola evitando di congelare il campione. Dopo aver rimosso i tubi della microcentrifera contenenti i campioni dalla scatola di polistirolo, posizionare un tubo sotto un cappuccio dell'unità di riscaldamento del microscopio per riscaldare fino a 37 gradi Celsius per l'analisi al microscopio video ad alta velocità o HSVMA. Quindi, avviare la fotocamera e il software dell'unità video sul computer.
Utilizzare una pipetta per prelevare un piccolo campione e posizionare due gocce del campione in una cuvetta. Coprire la cuvetta con un coperchio prima di metterla sotto il microscopio. Utilizzare una lente ad immersione in olio con un ingrandimento di 100x e mettere una goccia di olio ad immersione sulla superficie dell'ottica.
Mentre ti avvicini al fondo del piatto con la lente del microscopio, cerca i cluster cellulari senza globuli rossi e con basso contenuto di muco. Dopo aver trovato una regione rappresentativa di interesse, o ROI, concentrati su un gruppo di ciglia battenti con i più grandi movimenti di ciglia e registra una sequenza video. Registra le cellule con le ciglia che battono lateralmente e dall'alto.
L'analisi rappresentativa mostra i normali movimenti delle ciglia visti lateralmente e dall'alto. Il campione di discinesia ciliare primaria, o paziente con PCD, con una mutazione nel gene DNAH11 ha dimostrato il classico modello rigido di battito ciliare minimamente in movimento. Se visto di lato e sopra.
In un altro paziente con PCD con la stessa mutazione, è stato osservato un diverso modello ipercinetico ma inefficiente delle ciglia che battono. Un modello patologico di battito ciliare e la frequenza del battito ciliare sono stati osservati anche in un paziente con infezioni ricorrenti delle vie aeree superiori. Se la procedura di spazzolatura viene eseguita rigorosamente, l'analisi HSVMA non può essere eseguita poiché le cellule epiteliali ciliate sono state coperte da un rivestimento di globuli rossi.
Il passo più importante nella procedura è quello di ottenere cellule respiratorie sufficienti dalle spazzolature e di mantenere questo materiale ben conservato per l'analisi video. Il materiale rimanente può essere utilizzato per eseguire la microscopia elettronica o la microscopia immunoflourescense per rilevare possibili difetti strutturali nelle ciglia o per rivelare difetti e la sintesi di proteine ciliari.
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Panoramica
L'analisi mediante microscopia video ad alta velocità è uno strumento affidabile ed economico per la diagnosi della discinesia ciliare primaria. È facile da eseguire e applicabile in tutti i gruppi di età, rendendola essenziale per i centri che trattano malattie polmonari gravi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Medicina respiratoria
- Tecniche diagnostiche
Sfondo
- La displasia ciliare primaria è una condizione che altera la funzione cigliare.
- La microscopia video ad alta velocità può rivelare sia la funzione ciliare primaria che secondaria.
- Questa tecnica è particolarmente utile per diagnosticare patologie respiratorie legate alla disfunzione cigliare.
- È fondamentale che i clinici abbiano accesso a strumenti diagnostici affidabili.
Scopo dello studio
- Valutare l'efficacia della microscopia video ad alta velocità nella diagnosi della displasia ciliare primaria.
- Valutare l'applicabilità di questa tecnica in diverse fasce d'età dei pazienti.
- Evidenziare l'importanza di questo strumento diagnostico in ambito clinico.
Metodi Utilizzati
- Analisi mediante microscopia video ad alta velocità.
- Valutazione del movimento e della funzione cigliare.
- Confronto dei risultati tra diverse popolazioni di pazienti.
- Valutazione della funzione ciliare secondaria in relazione alle infezioni.
Risultati principali
- La microscopia video ad alta velocità è efficace per la diagnosi della discinesia primaria dei cigli.
- La tecnica è affidabile quando eseguita da personale esperto.
- Fornisce informazioni sulla funzione ciliare secondaria.
- Applicabile a pazienti di tutte le età, aumentandone l'utilità nella pratica clinica.
Conclusioni
- La microscopia video ad alta velocità dovrebbe essere uno strumento diagnostico standard nella medicina respiratoria.
- La sua facilità d'uso e affidabilità la rendono adatta alla diagnostica di prima linea.
- Una diffusa disponibilità può migliorare gli esiti per i pazienti affetti da gravi malattie polmonari.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'analisi mediante microscopia video ad alta velocità (HSVMA) fornisce un metodo rapido ed economico per la diagnosi in prima linea della displasia ciliare primaria (PCD), un disturbo genetico raro che colpisce la clearance mucociliare. Permettendo la visualizzazione diretta dei modelli di battito cigliare in cellule epiteliali respiratorie vive, l'HSVMA favorisce un rilevamento precoce e riduce la dipendenza da tecniche più onerose in termini di risorse, come la microscopia elettronica a trasmissione. Questa capacità migliora il flusso diagnostico nei centri di pneumologia e di malattie rare, facilitando interventi tempestivi e riducendo le complicanze polmonari a lungo termine.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente la valutazione funzionale della motilità ciliare in cellule derivate da pazienti, supportando la validazione degli obiettivi nella ricerca sulle ciliopatie.
- Valore operativo: Offre un parametro riproducibile per valutare interventi genetici o farmacologici sulla funzione ciliare.
- Valore predittivo: Distingue tra difetti strutturali e funzionali, migliorando la fiducia nelle ipotesi meccanicistiche.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera dati quantitativi sulla frequenza e sulla forma d'onda del battito cigliare per la standardizzazione dei saggi.
- Valore operativo: Favorisce lo sviluppo di protocolli standardizzati per l'immagine in tempo reale di cellule vive in modelli di malattie respiratorie.
- Scalabilità: Permette l'analisi ad alto contenuto di dati della dinamica cigliare su campioni di diversi pazienti o varianti genetiche.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro ai fenotipi clinici correlando gli output dell'HSVMA con la gravità della malattia.
- De-risking meccanicistico: Identifica il recupero funzionale in modelli preclinici mediante il ripristino del normale battito cigliare.
- Allineamento del biomarcatore: Fornisce letture funzionali che integrano biomarcatori strutturali o molecolari nella PCD.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
HSVMA si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio alla valutazione preclinica, offrendo un saggio funzionale per lo sviluppo di terapie ciliari.
- Biologia della scoperta: Facilita la verifica di ipotesi su geni coinvolti nell'assemblaggio e nella motilità delle ciglia, come DNAH11.
- Screening: Fornisce letture quantitative in tempo reale adatte allo screening di composti in modelli di ciliopatie.
- Analisi: Permette il confronto statistico dei parametri del battito ciliare tra diverse condizioni, supportando decisioni basate sui dati.
- Ricerca traslazionale: Collega i fenotipi cellulari agli esiti clinici, facilitando la transizione da preclinico a clinico.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione della funzione ciliare in diversi modelli di malattie respiratorie.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica fornendo una visualizzazione diretta della dinamica cigliare in contesti cellulari nativi.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità attraverso protocolli definiti per il campionamento, la conservazione e l'acquisizione delle immagini.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nella validazione del bersaglio confermando la rilevanza funzionale dei risultati genetici.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei bersagli delle ciliopatie sulla base di evidenze di recupero funzionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella raccolta delle cellule, nell'uso del microscopio e nell'analisi video per un'interpretazione accurata.
- È dipendente da sistemi microscopici a video ad alta velocità dotati di ottiche a immersione in olio e controllo ambientale.
- Necessita di procedure standardizzate per la manipolazione dei campioni al fine di prevenire contaminazioni o degradazione.
- L'adattamento a diversi sistemi modello può richiedere l'ottimizzazione delle condizioni di coltura e dei parametri di imaging.
- È limitato dalla necessità di campioni epiteliali vitali e privi di contaminazioni; la presenza di globuli rossi o muco può ostacolare l'analisi.
Domande frequenti sul biopharma
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Collection and Transport of Respiratory Epithelial Cells
2:20
High-Speed Video Microscopy Analysis (HSVMA)
3:43
Results: Analysis of Ciliary Motion in Healthy Individual and Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) Patients
4:49
Conclusion
