Induzione dell'infiammazione intestinale mediante trasferimento adottivo di cellule T CBir1 TCR transgeniche CD4 ⁺ a topi immunodeficienti

La malattia infiammatoria intestinale, o IBD, impone un notevole onere sanitario e finanziario agli individui e alla società. Questo modello di colite è utile per studiare i meccanismi dell'IBD e valutare i trattamenti per l'IBD. Questo modello di colite di trasferimento adottivo immunodominante Cbir flagellina specifica per cellule T fornisce informazioni su come l'antigene dei batteri intestinali induce le risposte delle cellule T per indurre la colite.

Dopo l'eutanasia del topo, fare un'incisione addominale sinistra di circa un centimetro e tirare via la pelle dal tessuto muscolare addominale. Quindi, fare un'incisione di circa tre centimetri nel tessuto muscolare addominale. Quindi, rimuovere la milza con forbici sterili e pinze.

Mettere la milza in un piatto di coltura contenente cinque millilitri di tampone di lavaggio pre-raffreddato. Macinare la milza con la superficie ruvida di due vetrini sterili. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da 50 millilitri facendolo passare attraverso un filtro cellulare da 100 micrometri.

Risciacquare i vetrini di vetro e il piatto di coltura con cinque millilitri di tampone di lavaggio pre-raffreddato e trasferire il tampone di lavaggio nel tubo. Centrifugare la sospensione cellulare, scartare il surnatante e risospese le cellule con cinque millilitri di tampone di lisi del cloruro di ammonio Tris prebellico per milza. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.

Aggiungere 10 millilitri di tampone di lavaggio pre-raffreddato al tubo. Quindi, centrifugare la sospensione cellulare, scartare il surnatante e risospese le cellule con 10 millilitri di tampone di isolamento pre-raffreddato. Per contare le celle, mescolare accuratamente 10 microlitri ciascuno di sospensione cellulare e blu Trypan e caricare 10 microlitri su un vetrino.

Quindi, inserire la diapositiva nel contatore di celle automatizzato per ottenere il numero di cella valido. Centrifugare la restante sospensione cellulare ed eliminare tutto il surnatante. Vortex le particelle magnetiche CD4 anti-topo, aggiungere direttamente 50 microlitri delle particelle per 10 milioni di cellule e mescolare accuratamente con i pellet cellulari.

Incubare la miscela per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire la sospensione di particelle cellulari in un tubo di raccolta sterile. Aggiungere 3,5 millilitri di tampone di isolamento pre-raffreddato nel tubo.

Posizionare il tubo sul magnete di separazione cellulare per otto minuti a temperatura ambiente. Quindi, aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta di trasferimento da tre millilitri. Rimuovere il tubo dal magnete di separazione cellulare.

Quindi, risospesciare le celle con 3,5 millilitri di tampone di isolamento pre-raffreddato e posizionare il tubo sul magnete per quattro minuti a temperatura ambiente. Aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta da tre millilitri. Infine, risospesere le celle in un millilitro di tampone FACS pre-raffreddato.

Per trasferire le cellule nei topi riceventi, risospese le cellule T4 CD4-positive transgeniche Cbir1 TCR a 5 milioni di cellule per millilitro in 1x PBS. Riscaldare i topi sotto una lampada di calore e trattenere i topi usando un dispositivo di ritenuta per topi. Iniettare per via endovenosa 200 microlitri della sospensione cellulare nella vena della coda dei topi.

Dopo l'eutanasia del topo, fare un'incisione ventrale della pelle della linea mediana ventrale di circa un centimetro. Allontanare la pelle dal tessuto muscolare addominale. Quindi, fare un'incisione di tre centimetri nel tessuto muscolare addominale.

Quindi, identificare il coecum e rimuovere l'intero colon con forbici e pinze sterili. Bagnare il colon con PBS pre-raffreddato in un piatto di coltura. Incidere il colon longitudinalmente e risciacquarlo con PBS pre-raffreddato.

Tagliare 1/3 del colon longitudinalmente. Posizionare la striscia del colon in un tovagliolo di carta con il lato lumenale rivolto verso l'alto. Eseguire swiss-rolling usando uno stuzzicadenti.

Mettere il colon svizzero in una cassetta e mettere la cassetta in formalina tamponata al 10% per 24 ore. Disidratare e incorporare la paraffina nel colon con un processore automatizzato. Quindi, tagliare sezioni di tessuto a cinque micrometri su un microtomo.

Montare il tessuto su vetrini ed eseguire la colorazione di ematossilina ed eosina. I topi knockout di Rag hanno iniziato a perdere peso circa tre settimane dopo il trasferimento cellulare e il loro peso ha raggiunto circa l'80-85% del loro peso originale sei settimane dopo il trasferimento cellulare. I topi riceventi hanno mostrato una breve lunghezza del colon sei settimane dopo il trasferimento cellulare.

I topi riceventi hanno dimostrato una maggiore infiltrazione cellulare nella lamina propria intestinale quattro settimane dopo il trasferimento cellulare. Hanno mostrato perdita di cellule caliciformi e iperplasia delle cellule epiteliali intestinali cinque settimane dopo il trasferimento cellulare, nonché erosione della mucosa e infiltrazione di cellule infiammatorie nella sottomucosa del colon sei settimane dopo il trasferimento cellulare. I punteggi istopatologici sono aumentati sostanzialmente da quattro a sei settimane.

Allo stesso tempo, non c'è stata infiammazione nei topi Knockout Rag che ricevevano PBS da solo. Utilizzando questa procedura, i livelli di citochine del colon potrebbero essere determinati da ELISA e qPCR.