Name: Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Scopri il rilascio di miRNA esogeno al rene mediante nanoparticelle di polietilenimina in modelli murini di malattie renali. Questo metodo non virale consente la terapia miRNA senza risposta interferone.

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Questo lavoro è stato parzialmente supportato da JSPS KAKENHI (Grant No. 21K08233). Ringraziamo Edanz (https://jp.edanz.com/ac) per aver curato le bozze di questo manoscritto.

Tutti i protocolli sperimentali sugli animali sono stati approvati dal comitato etico animale della Jichi Medical University ed eseguiti in conformità con le linee guida sull'uso e la cura degli animali sperimentali della Guida della Jichi Medical University per gli animali da laboratorio. Qui, abbiamo dimostrato la consegna miRNA mimica al rene con conseguente sovraespressione utilizzando topi UUO. Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico della Jichi Medical University [Approvazione n. 19-12 per la fibrosi renale, 17-024 per l'infezione renale acuta (AKI) e 19-11 per la nefropatia diabetica].
1. Preparazione del complesso PEI-NPs-miRNA-mimic
NOTA: Qui, la preparazione di PEI-NPs-miRNA-mimic13,14,15 e PEI-NPs-control-miRNA (come controllo negativo) sono descritti per un topo.
<ol><li>Preparare i seguenti elementi:<ol><li>Preparare 10 μL di PEI-NP lineari.</li>
		<li>Preparare 50 μL di miRNA sintetizzati artificialmente disciolti in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 μM (5 nmol di miRNA disciolti in 50 μL di acqua priva di nucleasi).</li>
		<li>Preparare 50 μL di miRNA di controllo (non bersaglio) sintetizzati artificialmente disciolti in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di 100 μM (5 nmol miRNA disciolti in 50 μL di acqua priva di nucleasi).</li>
		<li>Preparare soluzioni di glucosio al 5% e al 10%. Garantire la disponibilità di provette per microcentrifuga da 1,5 ml e di un miscelatore a vortice.</li>
	</ol></li>
	<li>Sciogliere 10 μL di PEI-NPs in 90 μL di soluzione di glucosio al 5% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.</li>
	<li>Mescolare 50 μL di miRNA sintetizzati artificialmente (5 nmol) disciolti in acqua priva di nucleasi (concentrazione di 100 μM) con 50 μM di soluzione di glucosio al 10% in provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso. Questo processo produce miRNA disciolti in soluzione di glucosio al 5%.</li>
	<li>Mescolare 100 μL di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 5% e 100 μL di miRNA mimic (5 nmol) in soluzione di glucosio al 5%. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.</li>
	<li>Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-miRNA-mimic. Questa soluzione contiene PEI-NPs e miRNA mimic (5 nmol) in un rapporto di azoto (N) nel polimero e fosfato (P) negli acidi nucleici (rapporto N/P) = 6 (Figura 1). NOTA: Il complesso PEI-NPs-control-miRNA può essere preparato utilizzando lo stesso processo descritto nei passaggi 1.1-1.5 per tutti i modelli di topi con malattia renale descritti in questo manoscritto (UUO, nefropatia diabetica e AKI). Un volume di iniezione di PEI-NP-miRNAs-mimic è uguale a 5 nmol di miRNA-mimic coniugati con PEI-NPs in rapporto N/P = 6. La durata e la frequenza dell'iniezione di ciascun PEI-NP-miRNA-mimic dipendono dal modello di malattia in cui viene applicato.</li>
</ol>2. Conferma della consegna significativa di miRNA mimic al rene in topi UUO mediante PEI-NP tramite iniezione di vene caudali mediante microscopia fluorescente
NOTA: Qui, viene elaborato il metodo di consegna del miRNA artificialmente purificato al rene, indicando l'istituzione di metodi terapeutici per varie malattie renali. In breve, ai topi UUO è stato somministrato un miRNA marcato con acido carbossilico cianina3 (Cy3) aggiunto a 100 μL di PEI-NP attraverso la vena caudale. La consegna ai reni è stata confermata con microscopia a fluorescenza. Viene descritto l'acido carbossilico (Cy3) marcato con acido carbossilico (Cy3) PEI-NPs-miRNA (oligonucleotidi) per un topo. Questo metodo può fornire significativamente miRNA mimic al rene in diversi modelli murini, come topi UUO, topi diabetici e topi AKI prodotti da IRI. Qui, abbiamo usato un modello di mouse UUO per la dimostrazione video. Il metodo di induzione di UUO è stato descritto in precedenza altrove13. Seguire questi protocolli entro sei giorni dall'intervento chirurgico UUO.
<ol><li>Preparare i seguenti elementi:<ol><li>Preparare 2 μL di PEI-NPs e 100 μL di oligonucleotidi a doppio filamento marcati con Cy3 [miRNA miRNA marcati con Cy3 (1 nmol; 10 μM)].</li>
		<li>Preparare soluzioni di glucosio al 5% e al 10%. Garantire la disponibilità di provette per microcentrifuga da 1,5 ml e di un miscelatore a vortice.</li>
		<li>Utilizzare un tubo da centrifuga in plastica da 50 ml con un piccolo foro nel tappo per isolare le vene caudali dei topi UUO.</li>
		<li>Per la microscopia a fluorescenza, preparare un composto con temperatura di taglio ottimale (OCT), un criostato, azoto liquido, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), siringhe da 1,0 ml con un ago da 27 G e vetro rivestito di silano. NOTA: La lectina Lotus tetragonolobus marcata con fluoresceina (un marcatore del tubulo prossimale) e il 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) possono essere preparati per la colorazione opzionale dei tubuli prossimali e dei nuclei cellulari.</li>
	</ol></li>
	<li>Sciogliere 2 μL di PEI-NPs in 98 μL di soluzione di glucosio al 10% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di miRNA marcato con Cy3 a 100 μL di PEI-NP in soluzione di glucosio al 10% (preparata nella fase 2.2). Quindi, vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.</li>
	<li>Incubare la miscela per 15 minuti a RT per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-Cy3-marcato-miRNA-mimic.</li>
	<li>Posizionare il topo UUO a testa in giù in un tubo da centrifuga da 50 ml senza anestesia, quindi posizionare la coda attraverso il foro preparato nel cappuccio.</li>
	<li>Riempire una siringa da 1,0 mL con un ago da 27 G con 200 μL di complesso PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimico.</li>
	<li>Iniettare PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimic (200 μL) attraverso la vena caudale del mouse utilizzando la siringa da 1,0 mL con ago da 27 G. NOTA: Pulire la vena caudale con cotone idrofilo saturo di etanolo (70% -80%) per dilatare la vena caudale e disinfettare l'area di iniezione.</li>
	<li>Un'ora dopo 200 μL di iniezione del complesso PEI-NPs-Cy3-miRNA-mimimico, anestetizzare il topo con isoflurano (4% -5%) utilizzando un dispositivo anestetico appropriato per piccoli animali. Confermare la profondità dell'anestesia con l'assenza del riflesso del pizzico della punta. Mantenere l'anestesia con isoflurano (3%) durante l'intervento chirurgico.</li>
	<li>Successivamente, praticare un'incisione nella pelle, nei muscoli e nelle costole con forbici chirurgiche e pinze per esporre il cuore. Dopo aver praticato un'incisione nell'atrio destro, iniettare PBS nel ventricolo sinistro per estrarre il sangue in tutto il corpo fino a quando il colore del rene diventa giallo pallido (indicando che l'intero corpo del topo è perfuso con PBS). NOTA: La perfusione cardiaca viene eseguita per rimuovere efficacemente il sangue in tutto il corpo.</li>
	<li>Fermare l'isoflurano e rimuovere i reni dai topi e lavarli con PBS. Successivamente, rimuovere le capsule renali dai reni e lavare i reni due volte con PBS.</li>
	<li>Incorporare i campioni di tessuto renale nel composto OCT e congelare in azoto liquido.</li>
	<li>Utilizzare un criostato per preparare sezioni (5 μm di spessore). Montare le sezioni su vetrini rivestiti di silano e fissarle con paraformaldeide al 4%. NOTA: I tessuti renali possono facoltativamente essere colorati con lectina Lotus tetragonolobus marcata con fluoresceina (2 mg / ml) a RT per 2 ore per i tubuli prossimali, seguita da DAPI (30 nM in PBS) a RT per 15 minuti per i nuclei cellulari.</li>
	<li>Lavare delicatamente i vetrini due volte con PBS.</li>
	<li>Visualizza la colorazione a fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza con ingrandimento 100x e 400x e software di imaging appropriato.</li>
</ol>3. Conferma delle alterazioni dei miRNA bersaglio dopo somministrazione di miRNA mimic al rene mediante PEI-NP tramite iniezione di vena caudale
<ol><li>Eseguire la reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (qRT-PCR) per confermare le alternanze dei miRNA bersaglio. NOTA: Fare riferimento all'articolo pubblicato in precedenza per i dettagli di qRT-PCR18,19,20. Il sistema qRT-PCR utilizzato per generare i risultati rappresentativi forniti di seguito è stato modificato dal produttore. qRT-PCR deve essere condotta in conformità con il protocollo del produttore più recente.</li>
</ol>

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<li>Bushati, N., Cohen, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">microRNA functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 175-205 (2007).</li>
<li>Simpson, K., Wonnacott, A., Fraser, D. J., Bowen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNAs+in+diabetic+nephropathy%3A+From+biomarkers+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Diabetes+Reports%22%5BJournal%5D)">microRNAs in diabetic nephropathy: From biomarkers to therapy.</a> Current Diabetes Reports. 16 (3), 35(2016).</li>
<li>Yheskel, M., Patel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+microRNAs+in+polycystic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">Therapeutic microRNAs in polycystic kidney disease.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 26 (4), 282-289 (2017).</li>
<li>Lv, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+potential+of+microRNAs+for+the+treatment+of+renal+fibrosis+and+CKD%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Therapeutic potential of microRNAs for the treatment of renal fibrosis and CKD.</a> Physiological Genomics. 50 (1), 20-34 (2018).</li>
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<li>Dykxhoorn, D. M., Palliser, D., Lieberman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+silent+treatment%3A+siRNAs+as+small+molecule+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">The silent treatment: siRNAs as small molecule drugs.</a> Gene Therapy. 13 (6), 541-552 (2006).</li>
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<li>Deng, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Klotho+gene+delivery+ameliorates+renal+hypertrophy+and+fibrosis+in+streptozotocin-induced+diabetic+rats+by+suppressing+the+Rho-associated+coiled-coil+kinase+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Klotho gene delivery ameliorates renal hypertrophy and fibrosis in streptozotocin-induced diabetic rats by suppressing the Rho-associated coiled-coil kinase signaling pathway.</a> Molecular Medicine Reports. 12 (1), 45-54 (2015).</li>
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<li>Aomatsu, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+detection+method+for+microRNAs+in+the+kidney+of+an+ischemic+kidney+injury+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A quantitative detection method for microRNAs in the kidney of an ischemic kidney injury mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), e61378(2020).</li>
<li>Kushibiki, T., Nagata-Nakajima, N., Sugai, M., Shimizu, A., Tabata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+anti-fibrotic+activity+of+plasmid+DNA+expressing+small+interference+RNA+for+TGF-beta+type+II+receptor+for+a+mouse+model+of+obstructive+nephropathy+by+cationized+gelatin+prepared+from+different+amine+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%3A+Official+Journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Enhanced anti-fibrotic activity of plasmid DNA expressing small interference RNA for TGF-beta type II receptor for a mouse model of obstructive nephropathy by cationized gelatin prepared from different amine compounds.</a> Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society. 110 (3), 610-617 (2006).</li>
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<li>Tanaka, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+transfer+of+hepatocyte+growth+factor+to+skeletal+muscle+prevents+changes+in+rat+kidneys+after+5%2F6+nephrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%3A+Official+Journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">In vivo gene transfer of hepatocyte growth factor to skeletal muscle prevents changes in rat kidneys after 5/6 nephrectomy.</a> American Journal of Transplantation: Official Journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 2 (9), 828-836 (2002).</li>
<li>Hamar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+interfering+RNA+targeting+Fas+protects+mice+against+renal+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Small interfering RNA targeting Fas protects mice against renal ischemia-reperfusion injury.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (41), 14883-14888 (2004).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Utilizzando il protocollo presentato in questo manoscritto, le PEI-NP possono fornire miRNA imitazioni al rene per indurre la sovraespressione dei miRNA bersaglio, con conseguenti effetti del trattamento in modelli murini in vivo di diverse malattie renali, tra cui la fibrosi renale, la malattia renale diabetica e l'AKI.
Il metodo per preparare il complesso di PEI-NPs e miRNA mimic è molto semplice. La superficie caricata positivamente delle NP PEI intrappola il miRNA mimo quando sono...

I miRNA, piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzandoli e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali 1,2. Pertanto, la terapia genica che impiega miRNA esogeni sintetizzati artificialmente o inibitori è una potenziale nuova opzione per inibire lo sviluppo di molte malattie renali 3,4,5.
Nonostante la promessa di miRNA imitatori o inibitori per la terapia genica, la consegna agli organi bersaglio rimane un grosso ostacolo per gli esperimenti in vivo per sviluppare il loro potenziale clinico. Poiché i miRNA sintetizzati artificialmente o gli inibitori sono soggetti a degradazione immediata da parte della RNasi sierica, la loro emivita è ridotta dopo somministrazione sistemica in vivo6. Inoltre, l'efficienza dei miRNA imitatori o inibitori di attraversare la membrana plasmatica e trasfettare il citoplasma è generalmente molto più bassa senza vettori appropriati 7,8. Queste linee di evidenza suggeriscono che è necessario lo sviluppo di miRNA imitatori o inibitori del sistema di rilascio per il rene, per consentire il loro uso in contesti clinici e renderli una nuova opzione di trattamento per i pazienti con varie malattie renali.
I vettori virali sono stati utilizzati come vettori per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene 9,10. Sebbene siano stati sviluppati per la biosicurezza e l'efficacia della trasfezione, i vettori virali possono ancora causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica11,12. Per superare queste preoccupazioni, abbiamo sviluppato un sistema di rilascio di miRNA che imita il rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), un vettore non virale, in diversi modelli murini di malattia renale13,14,15.
Le PEI-NP sono NP lineari a base di polimeri che possono effettivamente rilasciare oligonucleotidi, comprese le imitazioni dei miRNA, al rene e sono considerate preferibili per la preparazione di vettori non virali a causa della loro sicurezza e biocompatibilità a lungo termine13,16,17.
Questo studio dimostra gli effetti dei miRNA esogeni sistematici che imitano la consegna con PEI-NP tramite iniezione di vene caudali in topi modello di fibrosi renale prodotti da ostruzione unilaterale dell'uretere (UUO). Inoltre, dimostriamo gli effetti della somministrazione sistematica di miRNA esogeno con PEI-NPs tramite iniezione di vena caudale in topi modello di malattia renale diabetica (topi db / db: C57BLKS / J Iar -+ Lepr db / + Leprdb) e topi modello di danno renale acuto prodotto da danno da ischemia-riperfusione renale (IRI).

<table><tbody><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo per la colorazione al nucleo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D-1306</td><td></td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td>79216</td><td>Wash buffer 2</td></tr><tr><td>Buffer RWT</td><td>Qiagen</td><td>1067933</td><td>Wash Buffer 1</td></tr><tr><td>Control-miRNA-mimic (miRNA sintetizzato artificialmente)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Non assegnato</td><td>5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3' (senso) 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3&prime; (antisenso)</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi a doppio filamento marcati con Cy3</td><td>Takara Bio Inc.</td><td></td><td></td>MIR7900</tr><tr><td>Lotus tetragonolobus lectina marcata con fluoresceina</td><td>Vector Laboratories Inc</td><td>FL-1321</td><td></td></tr><tr><td>In vivo-jetPEI</td><td>Polyplus</td><td>101000021</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Piastra di reazione ottica a 96 pozzetti per qRT-PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific 4316813</td><td></td><td>Piastra di reazione a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>MicroAmp Pellicola adesiva ottica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4311971</td><td>Pellicola adesiva per piastra di reazione a 96 pozzetti</td></tr><tr><td>miRNA-146a-5p mimic (miRNA sintetizzato artificialmente)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Non assegnato</td><td>5'-UGAGAACUGAAUUCCAUGGGU UT-3&prime; (senso) 5'-CCCAUGGAAUUCAGUUCUCAUU -3&prime; (antisenso)</td></tr><tr><td>Primer miRNA-146a-5p</td><td>Qiagen</td><td>MS00001638</td><td>Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021)</td></tr><tr><td>miRNA-181b-5p mimic (miRNA sintetizzato artificialmente)</td><td>Design del gene</td><td>Non assegnato</td><td>5'-AACAUUCAUUGCAUGCGGUGG GUU-3'</td></tr><tr><td>Primer miRNA-181b-5p</td><td>Qiagen</td><td>MS00006083</td><td>Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021)</td></tr><tr><td>miRNA-5100-mimic (miRNA sintetizzato artificialmente)</td><td>Design del gene</td><td>Non assegnato</td><td>5'-UCGAAUCCCAGCGGUGCCUCU -3&prime;</td></tr><tr><td>miRNA-5100-primer</td><td>Qiagen</td><td>MS00042952</td><td>Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021)</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Colonna di spin ancorata alla membrana in una provetta di raccolta da 2,0 mL</td></tr><tr><td>kit miScript II RT</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td>Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021)</td></tr><tr><td>miScript SYBR Green PCR kit</td><td>Qiagen</td><td>218073</td><td>Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021)</td></tr><tr><td>Trituratore QIA</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td>Colonne di centrifugazione in biopolimero in una provetta</td></tr> <tr><td>di raccolta da 2,0 mLReagente per lisi QIAzol</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td>Reagente per lisi a base di fenolo/guanidina</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Flex Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Strumento per PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>QuantStudio 12K Flex Software versione 1.2.1.</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4472380</td><td>Software per strumenti PCR in tempo reale</td></tr><tr><td>Acqua priva di RNasi</td><td>Qiagen</td><td>129112</td><td></td></tr><tr><td>Primer RNU6-2</td><td>Qiagen</td><td>MS00033740</td><td>Non disponibile perché Qiagen ha cambiato i kit qRT-PCR (dal sistema miScript miRNA PCR al sistema miRCURY LNA miRNA PCR da maggio 2021)</td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT (Optimal Cutting Temperature Compound)</td><td>Sakura Finetek Japan Co., Ltd.</td><td>Non assegnato</td><td></td></tr></tbody></table>

rilascio di mirna esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali

Delivery of Exogenous Artificially Synthesized miRNA Mimic to the Kidney Using Polyethylenimine Nanoparticles in Several Kidney Disease Mouse Models

I microRNA (miRNA), piccoli RNA non codificanti (21-25 basi) che non sono tradotti in proteine, inibiscono molti RNA messaggeri bersaglio (mRNA) destabilizzando e inibendo la loro traduzione in varie malattie renali. Pertanto, l'alternanza dell'espressione di miRNA da parte di miRNA esogeni sintetizzati artificialmente è un'opzione di trattamento potenzialmente utile per inibire lo sviluppo di molte malattie renali. Tuttavia, poiché la RNAasi sierica degrada immediatamente i miRNA esogeni sistematicamente somministrati in vivo, la consegna di miRNA al rene rimane una sfida. Pertanto, sono necessari vettori in grado di proteggere i miRNA esogeni dalla degradazione da parte della RNAasi e consegnarli significativamente al rene. Molti studi hanno utilizzato vettori virali per fornire miRNA esogeni o inibitori al rene. Tuttavia, i vettori virali possono causare una risposta all'interferone e/o instabilità genetica. Pertanto, lo sviluppo di vettori virali è anche un ostacolo per l'uso clinico di miRNA esogeni o inibitori. Per superare queste preoccupazioni riguardanti i vettori virali, abbiamo sviluppato un metodo vettoriale non virale per fornire miRNA imitatori al rene utilizzando l'iniezione di nanoparticelle di polietilenimina (PEI-NP), che ha portato a una significativa sovraespressione dei miRNA bersaglio in diversi modelli murini di malattia renale.

I miRNA target per la fibrosi renale, la nefropatia diabetica e l'AKI descritti di seguito sono stati selezionati sulla base della ricerca di microarray, qRT-PCR e / o database per applicazioni di terapia genica. Per ulteriori dettagli si rimanda alle precedenti pubblicazioni13,14,15.
Rilascio ed effetti di miRNA-146a-5p-mimic utilizzando PEI-NPs in topi con fibrosi renale<sup...

Qui, forniamo miRNA esogeni sintetizzati artificialmente al rene tramite iniezione di vena della coda di un vettore non virale e nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali. Ciò ha portato a una significativa sovraespressione del miRNA bersaglio nel rene, con conseguente progressione inibita della malattia renale in diversi modelli murini.

Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali

microRNAs&#160;(miRNAs), small noncoding RNAs (21-25 bases) that are not translated into proteins, inhibit lots of target messenger RNAs (mRNAs) by ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella terapia del microRNA al rene, che rimane una sfida. Il vantaggio principale di questa tecnica è che ha permesso la terapia dei microRNA imitando il rene senza causare una risposta all'interferone o instabilità genetica. Iniziare sciogliendo 10 microlitri di PEI-NPs in 90 microlitri di soluzione di glucosio al 5% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Quindi vortice delicatamente il tubo e girare verso il basso. Mescolare 50 microlitri di miRNA sintetizzati artificialmente disciolti in 100 micromolari di acqua priva di nucleasi con 50 micromolari di soluzione di glucosio al 10% in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.Questo processo produce miRNA disciolti in una soluzione di glucosio al 5%. Quindi mescolare 100 microlitri di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 5% e 100 microlitri di miRNA mimic in soluzione di glucosio al 5%. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente per preparare un complesso stabile di miRNA PEI-NPs. Sciogliere due microlitri di PEI-NP in 98 microlitri di soluzione di glucosio al 10% in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Vortice il tubo delicatamente e girare verso il basso.Quindi aggiungere 100 microlitri di miRNA marcati con Cy3 a 100 microlitri di PEI-NPs in soluzione di glucosio al 10% e vortice delicatamente il tubo. Incubare la miscela per 15 minuti a temperatura ambiente per preparare un complesso stabile di PEI-NPs-Cy3-marcato-miRNA-mimic. Posizionare il topo UUO a testa in giù in un tubo da centrifuga da 50 millilitri senza anestesia e quindi posizionare la coda attraverso un foro preparato nel cappuccio.Riempire una siringa da un millilitro con un ago calibro 30 con 200 microlitri di complesso miRNA-mimico marcato con PEI-NPs-Cy3 e iniettare il complesso attraverso la vena caudale del topo. Successivamente, praticare un'incisione nella pelle, nei muscoli e nelle costole con forbici chirurgiche e pinze per esporre il cuore. Dopo aver praticato un'incisione nell'atrio destro, iniettare PBS nel ventricolo sinistro fino a quando il colore del rene diventa giallo pallido.Ciò indica che l'intero corpo del mouse è perfuso con PBS. Dopo aver raccolto i reni, rimuovere le capsule renali e lavarle due volte con PBS. Incorporare i campioni di tessuto renale nel composto OCT e congelarli in azoto liquido.Utilizzare un criostato per preparare le sezioni e montare le sezioni su vetrini rivestiti di silano. Fissarli con il 4% di paraformaldeide e lavare delicatamente i vetrini due volte con PBS. Infine, visualizzare la colorazione a fluorescenza mediante microscopia a fluorescenza con ingrandimento 100x e 400x e software di imaging appropriato.L'immagine rappresentativa mostra la struttura del complesso PEI-NPs-miRNA-mimimi. La consegna e gli effetti di miRNA-146a-5p-mimic utilizzando PEI-NPs nella fibrosi renale sono rappresentati in queste immagini. L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP potrebbe fornire la mimica miRNA allo spazio tubulointerstiziale.Nei topi con fibrosi renale prodotti da UUO, questo includeva cellule tubulari renali che non hanno una forma regolare nel rene e nel glomerulo. L'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-146a-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-146a-5p nel rene. L'analisi istologica con colorazione rossa Sirio è mostrata qui.L'analisi al microscopio fluorescente ha mostrato che l'iniezione di PEI-NP potrebbe fornire miRNA mimic al glomerulo e allo spazio tubulointerstiziale nei reni di topi modello di rene diabetico in vivo. Inoltre, l'analisi qRT-PCR ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic ha indotto una significativa sovraespressione di miRNA-181b-5p nel rene. L'analisi istologica con colorazione periodica acido-Schiff ha mostrato che l'iniezione di PEI-NPs-miRNA-181b-5p-mimic una volta alla settimana da 10 a 20 settimane di età ha inibito la progressione della malattia renale diabetica nei topi.La consegna e gli effetti di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic in topi modello di danno renale acuto prodotti da danno da ischemia da riperfusione sono mostrati qui. In queste immagini sono illustrati i dati dell'analisi al microscopio fluorescente qRT-PCR per valutare gli effetti di sovraespressione di miRNA-5100 dopo iniezione di PEI-NPs-miRNA-5100-mimic e l'analisi istologica del rene colorato con ematossilina-eosina. Le PEI-NP iniettate attraverso la vena caudale due giorni prima della procedura di danno da riperfusione da ischemia, o IRI, prevengono la progressione del danno renale acuto indotta dall'IRI.Quando si esegue questa tecnica, preparare sezioni spesse cinque micrometri che includano più tessuto renale possibile. Puoi anche preparare sezioni spesse sette micrometri.

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Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali (Video) | JoVE Journal

Rilascio di miRNA esogeno sintetizzato artificialmente al rene utilizzando nanoparticelle di polietilenimina in diversi modelli murini di malattie renali

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