Name: Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Impara a registrare transitori di calcio ad alta risoluzione temporale nelle terminazioni nervose motorie del topo mediante microscopia confocale. Questo metodo consente di studiare la trasmissione sinaptica con precisione spaziale e temporale.

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Gli studi sulla fluorescenza di questo lavoro sono stati condotti con il sostegno finanziario della Russian Science Foundation Grant (progetto n. 19-15-00329). Il metodo è stato sviluppato sotto finanziamento dell'incarico governativo per FRC Kazan Scientific Center di RAS АААА-А18-118022790083-9. La ricerca è stata sviluppata con l'uso delle attrezzature del Centro di ricerca federale "Kazan Scientific Center of RAS". Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Victor I. Ilyin per la lettura critica di questo manoscritto.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo per caricare il colorante sensibile al Ca2+ nelle terminazioni nervose del topo attraverso il moncone nervoso e per registrare un transitorio di calcio veloce utilizzando un microscopio confocale è presentato in questo articolo. Come risultato dell'implementazione di questo metodo di carico, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza per consentire la registrazione dell'ingresso di calcio nelle terminazioni nervose in risposta alla st...

Il problema di misurare le onde veloci di calcio nelle cellule eccitabili è uno degli aspetti più importanti e impegnativi dello studio della trasmissione del segnale nel sistema nervoso centrale e periferico. Gli ioni calcio svolgono un ruolo importante nell'innescare il rilascio di neurotrasmettitori, la plasticità sinaptica e la modulazione dell'attività di varie proteine intracellulari 1,2,3,4,5. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative6. Per misurare i cambiamenti nei livelli di calcio, i coloranti fluorescenti sensibili al calcio sono comunemente usati e i cambiamenti nel loro livello di fluorescenza sono analizzati 7,8,9.
Il caricamento di coloranti di calcio nelle cellule può essere ottenuto in diversi modi. Principalmente, i coloranti cellula-permeant sono usati10,11. Tuttavia, in tal caso, non è solo difficile controllare la concentrazione di un colorante all'interno della cellula, ma è anche difficile selezionare le cellule bersaglio per il caricamento. Questo metodo non è applicabile per lo studio delle terminazioni nervose periferiche poiché il colorante entra nelle cellule postsinaptiche. Invece, i coloranti impermeant cellulari sono più adatti per tali preparazioni. In questo caso, i coloranti vengono consegnati alle cellule mediante microiniezione o attraverso una pipetta patch12,13,14. C'è anche un metodo di caricamento attraverso un moncone nervoso. Quest'ultimo metodo è più adatto per le preparazioni della giunzione neuromuscolare 15,16,17,18,19,20. Permette di eseguire la colorazione solo per le cellule di interesse. Sebbene questo metodo non fornisca una valutazione accurata della concentrazione del colorante nella cellula bersaglio, la concentrazione può essere stimata approssimativamente confrontando il livello di fluorescenza delle cellule a riposo in soluzioni con una concentrazione nota di calcio21. In questo studio, viene presentata una modifica di questo metodo applicato alle sinapsi dei mammiferi.
L'ingresso di calcio durante la fase depolarizzante del potenziale d'azione è un processo veloce, specialmente nella giunzione neuromuscolare; Pertanto, per la sua registrazione, è necessaria un'attrezzatura appropriata1. Un recente studio che utilizza un colorante fluorescente sensibile alla tensione ha dimostrato che la durata del potenziale d'azione nella sinapsi periferica di un topo è di circa 300 μs22. Il calcio transitorio, valutato utilizzando coloranti calcio-sensibili nelle sinapsi periferiche della rana, ha una durata maggiore: il tempo di salita è di circa 2-6 ms e il tempo di decadimento è di circa 30-90 ms, a seconda del colorante di calcio utilizzato23,24. Per misurare processi veloci con l'aiuto di coloranti fluorescenti, vengono generalmente utilizzate telecamere CCD o CMOS, con matrici CCD veloci e sensibili. Tuttavia, queste telecamere hanno lo svantaggio della bassa risoluzione, limitata dalla dimensione degli elementi sensibili della matrice25,26,27,28. Le telecamere più veloci con sensibilità sufficiente per registrare sia i potenziali d'azione che i transitori di calcio in risposta alla stimolazione a bassa frequenza delle cellule hanno una frequenza di scansione di 2.000 Hz e una matrice con una dimensione di 80 x 8029. Per ottenere segnali con una risoluzione spaziale più elevata, viene utilizzata la microscopia confocale, soprattutto se è necessario valutare alcune variazioni volumetriche nel segnale30,31,32. Ma va tenuto presente che la microscopia confocale ha un'alta velocità di scansione in modalità di scansione lineare, ma ci sono ancora limitazioni significative sulla velocità delle registrazioni di processi veloci quando si costruisce un'immagine spaziale33. Esistono microscopi confocali basati su dischi Nipkow rotanti (microscopia a scansione a fessura) e scanner multipoint-array, che hanno una maggiore velocità di scansione. Allo stesso tempo, sono inferiori ai microscopi confocali classici nel filtraggio delle immagini confocali (diafonia forica per microscopi con un disco di Nipkow)32,34,35. L'imaging confocale con scansione a risonanza può anche fornire un'elevata risoluzione spazio-temporale richiesta per misurazioni temporali elevate36. Tuttavia, tenere conto del fatto che la registrazione di risposte fluorescenti deboli ad alta velocità di scansione quando si utilizzano scanner a risonanza richiede rivelatori altamente sensibili come i rilevatori ibridi36.
Questo articolo presenta un metodo per aumentare la risoluzione temporale dei segnali registrati con la microscopia confocale a scansione laser (LSCM) mantenendo la risoluzione spaziale37. Il metodo attuale è un ulteriore sviluppo dei metodi descritti in precedenza e trasferiti alla piattaforma LSCM38,39,40. Questo approccio non richiede modifiche nell'hardware del microscopio e si basa sull'applicazione di un algoritmo per la registrazione di segnali fluorescenti periodicamente evocati con uno spostamento temporale rispetto al momento della stimolazione.

<table><tbody><tr><td>Vetro capillare</td><td>Clark Strumenti elettromedicali, Regno Unito</td><td>GC150-10</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microscopio confocale e multifotone Leica TCS SP5 MP</td><td>Leica Microsystems , Heidelberg, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette fiammante/marrone P 97</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di flusso</td><td>KD Medical GmbH Hospital Products, Germania</td><td>KD REG</td><td>Set di infusione monouso con regolatore di flusso</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, USA</td><td>H0887</td><td>100mL</td></tr><tr><td>Sistema di illuminazione Leica CLS 150X</td><td>Leica Microsystems, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td></td><td>http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>Software Las AF</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Las X</td><td>Leica Microsystems, Heidelberg, Germania</td><td></td><td>https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/</td></tr> <tr><td>Supporto magnetico con tubo di aspirazione</td><td>BIOSCIENCE TOOLS, USA</td><td>MTH-S</td><td></td></tr><tr><td>Microspin FV 2400</td><td>Biosan, Lettonia</td><td>BS-010201-AAA</td><td></td></tr><tr><td>Minutien Pins</td><td>Strumenti per la scienza fine, Canada</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Multi-spin MSC 3000</td><td>Biosan, Lettonia</td><td>BS-010205-AAN</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 sale pentapotassico</td><td>Sonde molecolari, USA</td><td>O6806</td><td>500 &mu; g</td></tr><tr><td>Pipetta</td><td>Biohit, Russia</td><td>720210</td><td>0,5-10 &; L</td></tr><tr><td>Puntale per pipetta</td><td>Biohit, Russia</td><td>781349</td><td>10 & micro; L</td></tr><tr><td>Plastilina</td><td>produttore</td><td></td><td></td>locale</tr><tr><td>Aghi ipodermici monouso</td><td>Bbraun</td><td>100 Sterican</td><td>0,4&volte; Programma</td></tr><tr><td>per fogli di calcolo</td> da 40 mm <td>Microsoft, USA</td><td>Microsoft Office Excel</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio, Leica M80</td><td>Leica Microsystems , Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo di aspirazione</td><td>Kazakov A. ELETTRODO DI ASPIRAZIONE SEMPLICE PER LA STIMOLAZIONE ELETTRICA DI OGGETTI BIOLOGICI / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // Rivista internazionale di ricerca.&nbsp;- 2015. - No. 9 (40) Parte 3. - P. 13-16.</td><td></td><td>http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/</td></tr> <tr><td>Sylgard 184 elastomero</td><td>Dow Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>produttore</td><td></td> locale <td>0,5 mL</td></tr><tr><td>Siringa</td><td>produttore</td><td></td> locale <td>60 mL</td></tr></tbody></table>

registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

La stima del livello di calcio presinaptico è un compito chiave nello studio della trasmissione sinaptica poiché l'ingresso del calcio nella cellula presinaptica innesca una cascata di eventi che portano al rilascio di neurotrasmettitori. Inoltre, i cambiamenti nei livelli di calcio presinaptico mediano l'attività di molte proteine intracellulari e svolgono un ruolo importante nella plasticità sinaptica. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative. La giunzione neuromuscolare è un modello adatto per studiare la plasticità sinaptica, in quanto ha un solo tipo di neurotrasmettitore. Questo articolo descrive il metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il fascio nervoso tagliato nelle terminazioni nervose motorie dei topi. Questo metodo consente la stima di tutti i parametri relativi alle variazioni intracellulari del calcio, come il livello basale di calcio e il calcio transitorio. Poiché l'afflusso di calcio dall'esterno cellulare nelle terminazioni nervose e il suo legame / slegamento al colorante sensibile al calcio avvengono nell'intervallo di pochi millisecondi, è necessario un sistema di imaging veloce per registrare questi eventi. In effetti, le telecamere ad alta velocità sono comunemente utilizzate per la registrazione di cambiamenti rapidi del calcio, ma hanno bassi parametri di risoluzione dell'immagine. Il protocollo qui presentato per la registrazione dei transitori di calcio consente una risoluzione spazio-temporale estremamente buona fornita dalla microscopia confocale.

Dopo aver caricato la preparazione con colorante secondo la tecnica presentata, la maggior parte delle sinapsi situate vicino al moncone nervoso aveva un livello sufficiente di fluorescenza (vedi Figura 2). Dopo aver caricato la preparazione con il colorante eapplicando il metodo descritto di registrazione e di elaborazione delle immagini, sono stati ottenuti transitori di calcio con la risoluzione spaziale e temporale desiderata (vedi Figura 4). Il calcio trans...

Il protocollo descrive il metodo di caricamento di un colorante di calcio fluorescente attraverso il nervo tagliato nei terminali nervosi motori del topo. Inoltre, viene presentato un metodo unico per registrare i transitori di calcio veloci nelle terminazioni nervose periferiche utilizzando la microscopia confocale.

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

La stima di un livello di calcio presinaptico è un compito chiave nello studio della trasmissione sinaptica. Studiare la segnalazione del calcio è anche importante per trovare modi per trattare le malattie neurodegenerative. Il principale vantaggio della tecnica di caricamento presentata è che la colorazione è stata eseguita solo per le celle di interesse.Il nostro metodo per registrare l'intransienza del calcio fornisce un'ottima risoluzione spazio-temporale. Il metodo di registrazione presentato può essere utile ai neurofisiologi che hanno bisogno di registrare processi periodici veloci utilizzando un microscopio confocale. Il passo più difficile nella tecnica di caricamento è tenere il nervo all'interno della pipetta.Il diametro della pipetta deve essere perfettamente adatto, quindi fatene diversi. Conoscere tutti i passaggi del protocollo sono complicati e dimostrare ciascuno di essi aiuterà molto. Iniziare fissando il tessuto muscolare dell'elevatore auris longus in modo leggermente allungato nella piastra di Petri rivestita di elastomero con i perni in acciaio inossidabile fine e aggiungere la soluzione di Ringer al piatto fino a quando il muscolo è completamente coperto.Quin

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Dettagli di metodi ad alta risoluzione...

Focale Ca 2 + Rilevamento transitoria nel muscolo liscio

Fonte: Heredia, D. J., et. Al. Imaging ex vivo della segnalazione del calcio cellulo-specifica alla sinapsi tripartita del diaframma del topo. J. Vis. Exp. (2018) Questo video mostra l'imaging a fluorescenza della dinamica del calcio alle giunzioni neuromuscolari (NMJ) in un topo transgenico che esprime indicatori di calcio geneticamente codificati. Un NJM è identificato da recettori dell'acetilcolina marcati in fluorescenza nel diaframma con il nervo frenico. Uno splitter di immagini viene...

Imaging a fluorescenza della dinamica del calcio nelle giunzioni neuromuscolari nel diaframma di un topo transgenico

Fonte: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ ca2+ Imaging del sistema nervoso enterico. J. Vis. Exp.Exp. (2015)Questo video dimostra il calcio imaging per visualizzare e analizzare l'attività dei neuroni enterici e della glia nelle preparazioni del plesso mienterico del colon di topo.

Imaging del calcio delle attività dei neuroni enterici e della glia in un plesso mienterico del colon di topo

Fonte: Bancroft, E. A., et al. Quantificare spontaneamente Ca2+ flussi e i loro effetti a valle nei neuroni primari del mesencefalo del topo. J. Vis. Exp. (2020) Questo video dimostra la visualizzazione in tempo reale dell'afflusso di calcio nei neuroni mesencefalici ventrali derivati da embrioni di topo. Utilizzando un vettore virale per esprimere un indicatore di calcio, i neuroni vengono ripresi al microscopio confocale per tracciare i cambiamenti nell'intensità della fluorescenza durante...

Visualizzazione dell'afflusso di calcio nei neuroni ventrali del mesencefalo derivati da embrioni di topo

Fonte: Kulkarni, M. et al. Imaging Ca2+ Dinamica nei terminali assonici dei fotorecettori dei coni della retina del topo. J. Vis. Exp. (2015)Questo video dimostra l'uso della microscopia a due fotoni per monitorare la dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni di una retina di topo transgenico. Descrive i passaggi per la preparazione delle fette di retina, l'imaging di biosensori di calcio basati su FRET e l'analisi delle variazioni di fluorescenza per quantificare i livelli di calcio in...

Microscopia a due fotoni per il monitoraggio della dinamica del calcio nei fotorecettori dei coni retinici di topo

Fonte: Zhilyakov, N. V. et. al., Registrazione dei transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare del topo con alta risoluzione temporale utilizzando la microscopia confocale. J. Vis. Exp. (2021)Questo video mostra la tecnica di imaging per la registrazione di transitori veloci di calcio alle terminazioni nervose utilizzando la microscopia confocale. Stimolando il nervo e catturando i cambiamenti di fluorescenza dai coloranti leganti il calcio, visualizza l'afflusso dinamico di calcio e la...

Imaging di transitori veloci di calcio nelle terminazioni nervose di topo mediante microscopia confocale

Attualmente, la maggior parte degli indicatori di calcio disponibili vengono utilizzati per quantificare i transitori citoplasmatici del calcio come misure indirette del calcio rilasciato dal reticolo sarcoplasmatico in cellule muscolari lisce in coltura. Questo protocollo descrive l'uso di uno specifico indicatore basato su FRET che consente la misurazione diretta dei segnali di calcio all'interno del lume del reticolo sarcoplasmatico.

Misura di fluttuazioni calcio all&#39;interno del reticolo sarcoplasmatico di coltura cellule muscolari lisce Uso FRET-based Imaging confocale

Qui descriviamo un metodo per caricare un colorante sensibile al calcio attraverso il ceppo nervoso della rana nelle estremità nervose. Presentiamo inoltre un protocollo per la registrazione e l'analisi dei rapidi transitori di calcio nei terminali nervosi periferici.

Caricamento di un colorante di calcio in terminazioni di nervi della rana attraverso il ceppo del nervo: registrazione transitoria del calcio nella giunzione neuromuscolare della rana

Qui presentiamo un protocollo di segnalazione in popolazioni di tipi delle cellule individuali alla giunzione neuromuscolare murino di calcio di immagine.

Ex Vivo Formazione immagine di segnalazione alla sinapsi tripartita del diaframma del Mouse cellula-specifico calcio

Questo protocollo descrive un metodo per l'analisi morfometrica delle giunzioni neuromuscolari mediante microscopia combinata confocale e STED che viene utilizzata per quantificare i cambiamenti patologici in modelli murini di SMA e CMS correlati a ColQ.

Caratterizzazione delle giunzioni neuromuscolari nei topi mediante microscopia combinata confocale e super-risoluzione

I metodi attuali descrivono un approccio non raziometrico per l'imaging subcompartimentale del calcio ad alta risoluzione in vivo in Caenorhabditis elegans utilizzando indicatori di calcio geneticamente codificati prontamente disponibili.

Imaging subcellulare della manipolazione neuronale del calcio in vivo

Impara a registrare transitori di calcio ad alta risoluzione temporale nelle terminazioni nervose motorie del topo mediante microscopia confocale. Questo metodo consente di studiare la trasmissione sinaptica con precisione spaziale e temporale.

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale (Video) | JoVE Journal

Registrazione di transitori di calcio nella giunzione neuromuscolare di topo ad alta risoluzione temporale mediante microscopia confocale

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