qPCR pronta all'uso per la rilevazione del DNA da Trypanosoma cruzi o altri organismi patogeni

Il presente lavoro descrive le fasi per la produzione di qPCR pronta all'uso per il rilevamento del DNA di T. cruzi che può essere precaricata sul recipiente di reazione e conservata in frigorifero per diversi mesi.

Il protocollo di gelificazione produce reazioni qPCR pronte all'uso che riducono il tempo e i passaggi necessari per avviare una corsa. Questo protocollo consente di produrre e controllare contemporaneamente reazioni qPCR per qualità e grandi quantità, riducendo le possibilità di errore dell'operatore durante i calcoli delle ricette o l'aliquotazione nei pozzi. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi qPCR che è già completamente ottimizzato nel formato congelato convenzionale.

La dimostrazione visiva di questo metodo è importante perché due delle principali fasi di controllo della qualità sono visive. Per preparare la soluzione di melezitosio, pesare quattro grammi di melezitosio in un tubo di plastica da 15 millilitri, aggiungere sei millilitri di acqua priva di nucleasi e vortice alla massima velocità fino a quando la polvere non viene solubilizzata. Portare il volume finale a 10 millilitri con acqua priva di nucleasi, quindi etichettare e conservare la soluzione da due a otto gradi Celsius per un massimo di sei mesi.

Per preparare la soluzione di trealosio, pesare quattro grammi di trealosio in un tubo di plastica da 15 millilitri, aggiungere sei millilitri di acqua priva di nucleasi e vortice alla massima velocità fino a quando la polvere non è solubilizzata. Quindi portare il volume a 10 millilitri con acqua priva di nucleasi e filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micron. Etichettare e conservare la soluzione da due a otto gradi Celsius per un massimo di sei mesi.

Per preparare la soluzione di glicogeno, pesare due grammi di glicogeno in un tubo da 15 millilitri, aggiungere sei millilitri di acqua priva di nucleasi e vortice fino a quando la polvere non viene solubilizzata. Mantenere la soluzione da due a otto gradi Celsius per otto-12 ore perché la solubilizzazione del glicogeno produce molte bolle. Il giorno seguente, rimuovendo la soluzione dall'incubazione, portare il volume a 10 millilitri con acqua priva di nucleasi e conservare la soluzione etichettata da due a otto gradi Celsius per un massimo di sei mesi.

Per preparare la soluzione di lisina, pesare 7,5 milligrammi di lisina in un tubo da 15 millilitri, aggiungere sei millilitri di acqua priva di nucleasi e vortice fino a quando la polvere è solubilizzata. Portare il volume a 10 millilitri con acqua priva di nucleasi. Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micron e conservare a due a otto gradi Celsius per un massimo di sei mesi.

Per preparare la miscela di gelificazione, mescolare i volumi appropriati di soluzioni stock in un tubo di plastica da 50 millilitri. Mescolare i reagenti invertendo il tubo 10 volte e conservare la soluzione marcata da due a otto gradi Celsius per un massimo di tre mesi. Per preparare la miscela master qPCR per la gelificazione, scongelare i reagenti in un contenitore refrigerato.

Quindi mescolare i volumi appropriati dei reagenti in un tubo da 1,5 millilitri per preparare abbastanza master mix per una striscia di otto tubi o una piastra da 96 pozzetti. Successivamente pipettare 18,5 microlitri del master di gelificazione mescolare su ciascun pozzetto di reazione e posizionare i tubi o la piastra nel supporto termoconduttivo all'interno del forno sottovuoto. Se si utilizzano 96 piastre di pozzetto, posizionare un sacchetto di argilla bentonitica nel forno per ogni due piastre da 96 pozzetti per l'assorbimento d'acqua.

Quando il ciclo è completato, controllare i tubi o le piastre per una corretta gelificazione dei reagenti assicurandosi che il volume sia visibilmente ridotto a circa cinque microlitri e che i liquidi non si muovano picchiettando i tubi o le piastre con le dita. Sigillare e conservare i tubi o le piastre da due a otto gradi Celsius da otto a 12 ore prima dell'uso. Per utilizzare la qPCR gelificata, rimuovere la striscia tubiera o la piastra dal frigorifero e aprirla in una workstation per la manipolazione del campione.

Aggiungere 15 microlitri di acqua priva di nucleasi e cinque microlitri di campione di DNA a ciascun recipiente di reazione. Sigillare i tubi o le piastre, eseguire l'esperimento desiderato ed eseguire analisi regolari dei dati. Nel presente protocollo, la temperatura all'interno della camera è mantenuta costante a 30 gradi Celsius, mentre la pressione varia tra 910 e 930 millibar e vicino al vuoto.

Dopo il ciclo di vuoto, la miscela master all'interno del tubo diminuisce di volume, diventa gelificata sul fondo e non schizza sulle pareti quando i tubi vengono picchiettati. Se la gelificazione è incompleta, il liquido schizza sulle pareti del tubo quando i tubi vengono toccati. Il rilevamento del Trypanosoma cruzi-DNA utilizzando sequenze oligonucleotidiche pubblicate è mostrato qui.

Il rilevamento dello stesso campione quando la gelificazione non è stata eseguita correttamente, ha comportato una perdita di sensibilità. Il passaggio più critico è il calcolo del volume dei reagenti prima della gelificazione. L'operatore deve ricordarsi di non aggiungere acqua, poiché verrà rimossa durante il processo.

Se le fasi del protocollo vengono seguite attentamente, gli operatori con competenze di laboratorio e di biologia molecolare di base non avranno difficoltà a eseguire il processo di gelificazione.