Microscopia intravitale longitudinale utilizzando una finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile
20 gennaio 2022
Questo protocollo descrive una nuova finestra di imaging mammario con un coperchio sostituibile (R.MIW). La microscopia intravitale dopo l'impianto del R.MIW consente l'imaging longitudinale e di più giorni della ghiandola mammaria sana e malata con una risoluzione cellulare durante le diverse fasi dello sviluppo.
La ghiandola mammaria è altamente dinamica e subisce più cicli di rimodellamento per tutta la vita. Il nostro protocollo consente di catturare le dinamiche cellulari che guidano i riarrangiamenti tissutali nella ghiandola mammaria sana e malata. La nostra finestra di imaging mammario con un coperchio sostituibile consente di eseguire l'imaging intravitale longitudinale della ghiandola mammaria per lunghi periodi di tempo, fino a diverse settimane.
Il coperchio sostituibile della finestra di imaging mammario garantisce condizioni di imaging ottimali in ogni momento e consente la manipolazione dei tessuti o la somministrazione di farmaci tra le sessioni di imaging. Il nostro metodo non solo fornisce approfondimenti sulla biologia della ghiandola mammaria sana, ma ci consente anche di studiare l'inizio e la progressione del tumore mammario a livello di singola cellula. Iniziare posizionando il coperchio della finestra di imaging mammario su una superficie sterile e applicando colla adesiva cianoacrilica attorno all'intero perimetro del coperchio del bordo.
Posizionare con attenzione un coperchio di vetro rotondo di 10 millimetri sulla parte superiore del coperchio. Utilizzare un bastoncino di legno sterile per posizionare lo slip del coperchio di vetro e applicare una certa forza per spingerlo verso il basso per garantire una tenuta ermetica tra lo slip del coperchio di vetro e il telaio del coperchio. Assicurarsi che il vetro non copra i fori nelle braccia del coperchio.
Disinfettare le palpebre e la finestra di imaging mammario immergendole nell'80% di etanolo per almeno 30 minuti in una capsula di Petri chiusa. Utilizzare una punta di cotone imbevuta di acetone per rimuovere la colla adesiva cianoacrilata in eccesso sul coperchio di vetro. Per preparare il topo per l'intervento chirurgico, radere l'area intorno alla quarta ghiandola mammaria usando una lama di rasoio.
Usa il quarto capezzolo come punto di riferimento e rimuovi i peli sciolti usando del nastro adesivo. Eseguire un test di prelievo della zampa per verificare se l'animale è adeguatamente anestetizzato. Sollevare delicatamente la pelle usando una pinza Graefe fine e utilizzare piccole forbici a molla per praticare un'incisione diagonale da 10 a 15 millimetri nella pelle sulla parte superiore del quarto cuscinetto di grasso mammario Utilizzare il quarto capezzolo come punto di orientamento e assicurarsi di non tagliare o danneggiare il peritoneo o la ghiandola mammaria.
Separare la pelle dal cuscinetto di grasso mammario e dagli strati di tessuto sottostanti utilizzando una dissezione smussata fino a cinque-otto millimetri intorno alla linea di incisione per creare una tasca per adattarsi al telaio della finestra di imaging mammario. Definire la regione di interesse, o ROI, in base alle caratteristiche macroscopiche del tessuto mammario, compresa la posizione del linfonodo o di una lesione tumorale. Cerca di mantenere il ROI centrale per quanto riguarda l'incisione.
Prelevare la finestra di imaging mammario utilizzando una pinza sterile e verificare se l'incisione è abbastanza grande da inserire la finestra. Se necessario, ingrandire leggermente l'incisione fino a quando la finestra di imaging mammario si inserisce. Rimuovere la finestra e utilizzare una sutura di seta 5-0 per posizionare una sutura di corda di borsa da uno a due millimetri di distanza dal bordo dell'incisione a partire dall'estremità caudale e dall'esterno all'interno della pelle.
Spostarsi di circa cinque millimetri lungo l'incisione e passare il filo di sutura attraverso la pelle dall'interno verso l'esterno. Ripetere questa procedura lungo il bordo dell'incisione, creando così una sutura circolare composta da cinque a sei anelli. L'uscita finale del filo di sutura deve essere posizionata a circa due o cinque millimetri di distanza dal primo ingresso.
Inserire la finestra di imaging mammario all'interno dell'incisione e utilizzare la pinza Graefe per posizionare con cura la pelle nella scanalatura della finestra. Assicurati di lasciare i loop della sutura all'esterno. Tirare i loop della sutura della corda della borsa e tirare delicatamente entrambe le estremità della sutura per stringerla nella scanalatura della finestra di imaging mammario.
Legare con nodi chirurgici e tagliare via il filo in eccesso. Utilizzare uno stuzzicadenti per applicare la vaselina sul bordo interno della finestra, evitando il tessuto sottostante. Spingere delicatamente il telaio della finestra verso il basso con una pinza sterile e posizionare il coperchio nel telaio della finestra.
Ciò eviterà un volume d'aria tra il tessuto della ghiandola mammaria e il coperchio della finestra di imaging mammario. Posizionare le punte della pinza sottile attraverso i fori nei bracci del coperchio e stringere il coperchio ruotandolo in senso orario. Se rimane dell'aria dopo aver stretto il coperchio, introdurre un ago da insulina sterile attraverso la pelle nella cavità tra il tessuto mammario e il coperchio e estrarre lentamente lo stantuffo, creando così un vuoto tra il tessuto della ghiandola mammaria e il coperchio della finestra di imaging mammario.
Ora il linfonodo può essere facilmente osservato dopo questa procedura. Ispezionare le condizioni del telaio della finestra di imaging mammario e del coperchio, compresa la stabilità delle suture o qualsiasi potenziale danno al coperchio. Posizionare il mouse sull'intarsio in modo tale che la finestra di imaging mammario cada nel foro dell'intarsio della scatola di imaging.
Applicare nastro semitrasparente e di carta sul retro del mouse per stabilizzare il mouse e ridurre il movimento dei tessuti dovuto alla respirazione. Per sessioni di imaging superiori a tre ore, posizionare un ago flessibile per via sottocutanea nel collo del mouse e fissarlo con nastro di carta. Attaccare una siringa da 10 millimetri con una miscela di nutrienti a un tubo di silicone flessibile e spingere la miscela di nutrienti fino a raggiungere l'estremità del tubo.
Collegare il tubo di silicone all'ago flessibile e iniettare 50 microlitri della soluzione infusa ogni 30 minuti. Posizionare il coperchio sopra la scatola di imaging per chiuderla. Quindi, fissare la scatola di imaging nella fase del microscopio.
Verificare che il mouse sia stabile all'interno della casella di imaging. Definire l'area di interesse utilizzando la modalità di epifluorescenza del microscopio e applicare le impostazioni del microscopio. Utilizzare la funzione Spiral nella modalità navigatore del software di imaging per generare una scansione di piastrelle di panoramica di grandi dimensioni e creare una mappa di riferimento del tessuto.
Definite la regione di interesse all'interno della panoramica Spirale, quindi definite i piani Z superiore e inferiore per determinare lo stack Z. Premere Start per ottenere le pile Z tridimensionali o quadridimensionali dettagliate del tessuto. Posizionare le punte della pinza sottile attraverso i fori della finestra di imaging mammario nei bracci del coperchio e allentare il coperchio ruotando in senso antiorario.
In alternativa, il tessuto può essere manipolato o riposizionato utilizzando pinze smussate sterili per ottimizzare le condizioni di imaging per la specifica regione di interesse. Applicare vaselina sul bordo interno della finestra di imaging mammario, evitando il tessuto sottostante. Spingere delicatamente il telaio della finestra verso il basso con una pinza sterile e posizionare il coperchio nel telaio della finestra.
Infine, posizionare le punte della pinza sottile attraverso i fori delle braccia del coperchio e alleggerire il coperchio ruotandolo in senso orario. I topi GFP a membrana di pomodoro puberale Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-membrana sono stati iniettati con una bassa dose di tamoxifene, portando alla ricombinazione cre-mediata dell'allele GFP a membrana di pomodoro a membrana Rosa26. I topi sono stati fotografati nei giorni uno, tre e cinque per seguire i cambiamenti dinamici nella ghiandola mammaria in via di sviluppo.
Le immagini rappresentative mostrano il rendering 3D di un dotto mammario allungato e ramificato per più giorni ripreso attraverso una finestra di imaging mammario. Le singole immagini del piano Z della punta ramificata e del ramo allungato sono mostrate qui. Le singole cellule nello stroma sono evidenziate da asterischi bianchi.
Le immagini rappresentative mostrano il linfonodo inguinale del topo ripreso attraverso una finestra di imaging mammario. La seconda generazione armonica è raffigurata in verde. Qui vengono mostrate immagini renderizzate in 3D di una struttura duttale mammaria di un topo CFP di membrana E-caderina femmina adulta per più giorni consecutivi.
Il modello di collagene I è stato utilizzato per ripercorrere lo stesso ROI e il segnale CFP della membrana E-caderina è stato utilizzato per contrassegnare le cellule duttali. I topi verde-rossi Kikume sono stati fotografati al giorno zero prima e dopo l'esposizione alla luce viola. Le sessioni di imaging sono state ripetute nei giorni due, sei e 10 dopo la conversione.
La stessa area della ghiandola mammaria è stata fotografata attraverso una finestra di imaging mammario per 10 giorni. Le regioni più piccole sono state foto-convertite il giorno zero e hanno mostrato un tasso di diluizione simile del segnale rosso Kikume nel tempo, indicando un tasso di turnover uguale in tutto l'epitelio. Le immagini zoom delle regioni indicate mostrano eterogeneità proliferativa a livello cellulare sei e 10 giorni dopo la foto-conversione.
La quantificazione del rapporto rosso-verde di diverse cellule 10 giorni dopo la foto-conversione ha rivelato tassi di diluizione altamente variabili di alcune cellule all'interno dello stesso microambiente duttale. Un passo cruciale di questa procedura è l'apertura del coperchio tra le sessioni di imaging. Questa caratteristica unica della finestra migliora le condizioni di imaging e consente l'imaging longitudinale del tessuto.
La finestra di imaging mammario con un coperchio sostituibile faciliterà nuove domande riguardanti in vivo, test antidroga ad azione rapida e screening nel campo dell'inizio e della progressione del tumore nella ghiandola mammaria del topo.
Panoramica
Questo studio presenta una nuova finestra di imaging mammaria con coperchio sostituibile (R.MIW) progettata per la microscopia intravitale. Il protocollo consente l'imaging longitudinale sia delle ghiandole mammarie sane che di quelle malate, fornendo informazioni sulle dinamiche cellulari e sul rimodellamento del tessuto durante diverse fasi di sviluppo.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Biologia della ghiandola mammaria
- Metodi di imaging intravitale
- Studio della progressione tumorale
Sfondo
- La ghiandola mammaria subisce un rimodellamento significativo durante l'arco della vita.
- La dinamica cellulare contribuisce al riassetto dei tessuti.
- La comprensione delle patologie, come i tumori della mammella, è limitata.
Metodi Utilizzati
- Immagini longitudinali mediante microscopia intravitale
- Modello murino per lo studio della ghiandola mammaria
- Tecnologia della finestra di imaging mammaria
Risultati principali
- Dimostrato il monitoraggio longitudinale della dinamica del tessuto mammario.
- Forniti approfondimenti sullo sviluppo mammario sano e sulla progressione tumorale a livello di singola cellula.
- Metodo validato per l'impianto chirurgico e l'acquisizione di immagini.
Conclusioni
- Questa finestra innovativa di imaging consente studi dettagliati della ghiandola mammaria.
- Ha implicazioni per la comprensione dei tumori mammari e della loro biologia.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La finestra di imaging mammario con coperchio sostituibile consente microscopia intravitale longitudinale per settimane, soddisfacendo la necessità fondamentale di finestre di osservazione prolungate negli studi sulla biologia della ghiandola mammaria e sul progresso tumorale. Questa capacità supporta la riduzione del rischio meccanicistica catturando la dinamica cellulare durante lo sviluppo, l'omeostasi e le malattie a risoluzione monocellulare. Migliora la fiducia predittiva nei modelli preclinici permettendo sessioni ripetute di imaging con accesso al tessuto per manipolazioni, marcature o somministrazione di farmaci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la visualizzazione in vivo del ramificarsi dei dotti mammari e delle interazioni stromali.
- Valore operativo: Supporta la validazione funzionale di bersagli attraverso il monitoraggio longitudinale delle risposte cellulari a perturbazioni genetiche o farmacologiche.
- Valore predittivo: Facilita la selezione di portafogli fornendo letture quantitative sul turnover epiteliale e sull'eterogeneità proliferativa nel tempo.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati per test farmacologici mantenendo l'accesso ottico e l'integrità del tessuto durante più sessioni di imaging.
- Valore operativo: Garantisce la standardizzazione dei saggi grazie a un design del coperchio sostituibile che previene il degrado del segnale e mantiene condizioni di imaging costanti.
- Scalabilità: Permette il riutilizzo della piattaforma per lo screening longitudinale di composti in modelli di iniziazione e progressione tumorale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la scoperta alla validazione preclinica consentendo l'immagine dallo sviluppo puberale attraverso modelli tumorali adulti.
- Allineamento del Biomarcatore: Supporta studi traslazionali sui biomarcatori mediante tecniche di fotoconversione per tracciare il turnover epiteliale e le interazioni stromali.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Informa le decisioni di prosegui/non-prosegui rivelando tassi variabili di diluizione delle cellule marcate all'interno dei microambienti duttali, indicanti tassi eterogenei di proliferazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio fino all'identificazione del composto leader e ai lavori preclinici, consentendo acquisizioni ripetute di immagini ad alta risoluzione della dinamica del tessuto mammario per periodi prolungati.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante la visualizzazione dei riarrangiamenti cellulari durante il rimodellamento della ghiandola mammaria.
- Screening: Migliora la prontezza e la riproducibilità dei saggi grazie all'accesso ottico stabile e alle capacità di manipolazione del tessuto tra le sessioni.
- Analisi: Genera Z-stack quantitativi 3D/4D e letture di fotoconversione che consentono il confronto della dinamica cellulare in diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo il monitoraggio longitudinale dell'insorgenza e della progressione tumorale a risoluzione singola cellula.
- Riutilizzo aziendale: Posiziona la finestra di imaging come piattaforma riutilizzabile per studi longitudinali in diversi modelli di malattia e interventi terapeutici.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce una previsione affidabile nella validazione degli obiettivi riducendo l'ambiguità meccanicistica nella dinamica della ghiandola mammaria.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità grazie alla manutenzione del coperchio sostituibile e alla sigillatura sottovuoto per prevenire artefatti di imaging.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale consentendo studi longitudinali senza interventi chirurgici ripetuti.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione aggiustata per il rischio attraverso la valutazione quantitativa del ricambio epiteliale e dell'eterogeneità proliferativa.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia del topo, microscopia intravitale e tecniche di imaging a fluorescenza.
- È vincolato all'utilizzo di strumentazione specializzata, tra cui microscopi confocali o a multiphotone dotati di controllo ambientale.
- Necessita di standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per quanto riguarda le tecniche di sutura, la chiusura delle palpebre e le procedure di manipolazione dei tessuti.
- Richiede adattamenti in base a diverse ceppi di topi, modelli tumorali e strategie di marcatura.
- È limitato dalla necessità di utilizzare tecniche asettiche e di manipolare con attenzione il campione per mantenere l'integrità della finestra durante periodi prolungati di imaging.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:03
Preparation of the R.MIW
2:13
R.MIW Implantation
5:19
Repeated Intravital Microscopy Through the R.MIW
7:03
Opening and Closing the Lid of the R.MIW in Between Imaging Sessions
7:52
Results: Multi-Day IVM of Mammary Gland Remodeling
10:11
Conclusion
