Name: 교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창을 사용하는 종방향 생체 내 현미경 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 학습하세요 교체 가능한 뚜껑이 있는 유방 이미징 창을 이용한 종방향 생체 내 현미경 검사법으로, 마우스 유선 조직의 세포 역학과 종양 진행 과정을 단일 세포 수준에서 관찰할 수 있습니다.

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이 연구는 연구 재단 플랑드르 (M.C.에 기초 연구 11L7222N을 수여하는 박사 학위), Boehringer Ingelheim Foundation (C.L.G.J.S.에 박사 펠로우십), EMBO 박사 후 펠로우십 (ALTF 1035-2020을 C.L.G.J.S.에 부여), Josef Steiner Award (J.V.R)의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Watson, C. J., Khaled, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+development+in+the+embryo+and+adult%3A+new+insights+into+the+journey+of+morphogenesis+and+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment.</a> Development. 147 (22), Cambridge, England. (2020).</li>
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<li>Dawson, C. A., Mueller, S. N., Lindeman, G. J., Rios, A. C., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+of+dynamic+single-cell+behavior+in+mouse+mammary+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy of dynamic single-cell behavior in mouse mammary tissue.</a> Nature Protocols. 16 (4), 1907-1935 (2021).</li>
<li>Scheele, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identity+and+dynamics+of+mammary+stem+cells+during+branching+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identity and dynamics of mammary stem cells during branching morphogenesis.</a> Nature. 542 (7641), 313-317 (2017).</li>
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<li>Masedunskas, A., Chen, Y., Stussman, R., Weigert, R., Mather, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+milk+lipid+droplet+transport%2C+growth%2C+and+secretion+revealed+by+intravital+imaging%3A+lipid+droplet+release+is+intermittently+stimulated+by+oxytocin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Kinetics of milk lipid droplet transport, growth, and secretion revealed by intravital imaging: lipid droplet release is intermittently stimulated by oxytocin.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (7), 935-946 (2017).</li>
<li>Mather, I. H., Masedunskas, A., Chen, Y., Weigert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symposium+review%3A+Intravital+imaging+of+the+lactating+mammary+gland+in+live+mice+reveals+novel+aspects+of+milk-lipid+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Symposium review: Intravital imaging of the lactating mammary gland in live mice reveals novel aspects of milk-lipid secretion.</a> Journal of Dairy Science. 102 (3), 2760-2782 (2019).</li>
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<li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+Vital+Signs+for+Long-Term+Survival+of+Mice+under+Anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Monitoring of Vital Signs for Long-Term Survival of Mice under Anesthesia.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563(2011).</li>
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<li>Harper, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+early+dissemination+and+metastasis+in+Her2%2B+mammary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2+ mammary cancer.</a> Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).</li>
<li>Sobolik, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+murine+mammary+imaging+windows+to+examine+wound+healing+effects+on+leukocyte+trafficking+in+mammary+tumors+with+intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22IntraVital%22%5BJournal%5D)">Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging.</a> IntraVital. 5 (1), 1125562(2016).</li>
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<li>Zomer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+cancer+stem+cell+plasticity+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of cancer stem cell plasticity in mammary tumors.</a> Stem Cells. 31 (3), 602-606 (2013).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+high-resolution+imaging+through+a+flexible+intravital+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window.</a> Science Advances. 7 (25), (2021).</li>
<li>Niinomi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+research+and+development+in+titanium+alloys+for+biomedical+applications+and+healthcare+goods%5BTitle%5D)+AND+%22Science+and+Technology+of+Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Recent research and development in titanium alloys for biomedical applications and healthcare goods.</a> Science and Technology of Advanced Materials. 4 (5), 445-454 (2003).</li>
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R.MIW는 원산지 및 최소한의 교란 환경에서 건강하고 병든 유선의 종방향 이미징을 허용하고 다양한 발달 단계에서 유선의 반복적 인 시각화를 허용합니다. R.MIW 설계를 사용하면 실험 중 언제든지 창을 열 수 있습니다. 관심 조직에 대한 장기간의 시각적 접근은, 예를 들어, 커버슬립 상의 세포 파편의 축적에 의해 방해될 수 있다. 이러한 경우, R.MIW는 이미징 세션 전후에 열리면 전체 가시적 인 조직 영역과 뚜껑을 청소할 수 있습니다. 탈착식 뚜껑은 또한 조직의 조작뿐만 아니라 특정 억제제 및 치료법, 라벨링 염료 또는 관심있는 특정 세포 유형과 같은 물질의 국소 적용을 허용합니다.
이 방법은 하나의 이미징 세션으로 제한되는 앞서 설명한 유방 스킨플랩 절차 4,7,8,13의 한계를 극복하고 분지화 형태형성(그림 5), 항상성 조직 회전율(그림 6) 또는 세포 수준에서의 종양 성장(그림 3B)과 같은 과정을 시각화할 수 있습니다. ). 그러나 동시에, R.MIW는 이미징 세션 사이에 조직의 로컬 조작을 허용하며, 이는 이전에 공개된 MIW 3,18 및 다른 모든 이미징 윈도우20,22에 비해 R.MIW의 큰 자산을 포함한다. R.MIW를 열 때 감염원을 예방하기 위해 항상 무균 상태를 유지하는 것이 중요합니다. 무균 환경에서 R.MIW를 열 수 있는 기능은 모든 이미징 세션 전에 이미징 조건을 최적화할 수 있게 해주며, 이는 관심 조직에 대한 장기적인 시각적 접근을 크게 향상시킵니다. 특히, 지방세포가 풍부한 스트로마에 매립 된 유선에서 이것은 큰 가치가 있습니다. 더욱이, 교체가능한 뚜껑은 IVM 실험을 종료할 필요 없이 치료제, 상이한 세포 유형, 라벨링 염료, 이미지-유도 미세 해부 또는 임의의 다른 국소 조직의 국소 조작의 국소 투여를 고유하게 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 종양 개시를 연구하기 위해, 특정 암 세포 집단은 R.MIW 링을 통해 ROI에 접근 가능한 한, 결정된 IVM 시점 및 정확한 유선(mammary gland) 위치에서 덕트 트리 또는 스트로마에 직접 주사될 수 있다. 종양 진행을 연구하기 위해, 특정 암 세포 집단 (특정 위치에서, 특정 미세 환경에서, 또는 특정 거동을 가진)은 IVM 세션 동안 광-마킹될 수 있고, 이어서 R.MIW의 개봉 후에 형광 해부 현미경을 사용하여 미세 해부될 수 있었다. 단리된 세포는 (단일세포) mRNA 시퀀싱과 같은 하류 분석을 위해 추가로 처리될 수 있었다. 이러한 접근법을 사용함으로써, 생체내 세포 거동을 분자 발현 프로파일에 결합시킬 수 있다. R.MIW에 의해 활성화된 국소 약물 투여의 이점은 치료 전후에 조직을 영상화할 수 있게 한다. 이미징 박스로부터 마우스를 제거하고 R.MIW 뚜껑을 연 후 국소 약물 투여를 후속적으로 수행하는 데 필요한 간격은 몇 분 안에 수행될 수 있으며, 이는 빠른 작용 약물의 즉각적인 위상 포획을 허용한다.
우리는 R.MIW를 통한 유선의 IVM이 많은 상이한 형광 리포터 마우스 모델과 양립가능하다는 것을 보여준다. 지방이 풍부한 환경은 이미지에 어려움을 겪고 있으므로 밝은 형광단을 사용하는 것이 좋습니다. 그러나, 여기에 나타낸 바와 같이, mCFP와 같은 덜 밝은 형광단은 최적의 이미징 조건에서 R.MIW를 통해 시각화될 수 있다. 필연적으로, 지방 패드는 더 깊은 덕트 구조의 이미징을 배제하고 이미징을보다 피상적 인 덕트로 제한합니다. 각 IVM 실험 시작 시 저해상도 개요 이미지는 고해상도 이미징에 충분히 피상적인 관심 있는 덕트 구조를 식별하는 데 도움이 됩니다. R.MIW를 연 후 국소 조직 조작, 결합 조직 제거 또는 지방 조직의 재배치는 지방 조직에 의해 오버레이되는 특정 ROI에 대해 IVM을 최적화 할 수 있습니다. 이는 이전의 모든 창 설계에 비해 중요한 장점으로, 이러한 조작을 수행 할 수 없으며 창 자체를 완전히 제거해야합니다. 특히, 사타구니 림프절의 시각화를 위해, 광 산란을 줄이고 고해상도 이미징을 가능하게하는 위에 놓인 지방 조직을 부드럽게 제거하는 것이 좋습니다. 조직을 조작 할 때 IVM 실험 중에 연구되는 과정에 영향을 줄 수 있으므로 항상 무균 상태를 유지하고 출혈이나 조직의 심각한 손상을 예방하십시오.
R.MIW는 관절이나 뼈 판과 같은 경질 조직을 대체하기 위해 임상 실습에서 일반적으로 사용되는 물질인 티타늄으로 만들어졌습니다. 티타늄은 가볍고 불활성 인 문자21을 포함하여 강철 창문에 비해 몇 가지 장점이 있습니다. 최근에, 가요성 실리콘 윈도우(20)를 포함하는 신규한 이미징 윈도우 타입들을 생성하기 위해 몇몇 다른 재료들이 사용되었다. R.MIW와는 달리, 유연한 창은 이식을 위해 봉합사를 필요로하지 않으며 거의 모든 해부학 적 위치, 특히 부드럽고 깨지기 쉬운 조직의 경우에 적합합니다. 실리콘 창은 가볍고 변형 가능한 특성으로 인해 동물의 운동성에 최소한의 영향을 미치며 빠른 조직 확장 및 성장을 연구하는 실험에 더 적합 할 수 있습니다20. 티타늄 버전에 비해 또 다른 장점은 실리콘 윈도우가 자기 공명 이미징20,27을 포함한 다른 이미징 양식과 호환된다는 것입니다. 그러나 목표는 0.17mm 유리 커버 슬립에 최적화되어 있음을 명심하는 것이 중요합니다. 또한, 유방 조직은 호흡 운동에 취약하며, 특히 거꾸로 된 현미경을 사용할 때 유연한 창을 사용하여 제한하기가 어렵습니다. 호흡 아티팩트는 R.MIW 설계와 이미징 박스의 인레이에 R.MIW의 고정에 의해 최소화됩니다. 결과적으로 제안된 R.MIW 설정을 사용하여 획득한 이미지는 호흡 아티팩트로 인해 왜곡되지 않습니다. 그러나, 조직 국소화에서 경미한 드리프트가 발생할 수 있으며, 이는 일반적으로 점진적이며, 사후 획득 모션 보정 소프트웨어(28)를 사용하여 보정될 수 있다. IVM 기술2,20의 툴박스가 증가함에 따라, 각 실험에 대한 특정 요건은 결국 관심 조직의 생체내 시각화의 가장 좋은 방법을 결정할 것이다. 다른 창 디자인은 서로 다른 장점과 단점을 가지고 있으며 연구 질문, 사용 가능한 현미경 설정, 필요한 공간 및 시간 분해능 및 연구 된 프로세스의 총 시간 범위에 따라 최적의 접근 방식을 결정해야합니다.
요약하면, R.MIW는 수일에서 수주에 걸쳐 유선 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 용이하게합니다.

유방 상피는 포유류에 존재하는 독특한 분비 기관으로, 자손에게 영양을 공급하기 위해 우유를 생산하고 분비합니다. 평생 동안, 유선은 조직의 구조적 및 기능적 변화를 동반하는 여러 차례의 발달과 성장을 겪습니다1. 발달 단계에 따라 조직 리모델링에 기여하는 세포 유형은 덕트 트리 내의 위치뿐만 아니라 다릅니다.
다중 광자 내 생명 현미경 (IVM)은 네이티브 및 최소 교란 설정 2,3,4에서 생체 내에서 유방 세포 역학의 연구를 허용합니다. 유선에 대한 시각적 접근을 얻기 위해, 사춘 기 4,5,6,7, 성인기 2,8, 수유9,10,11,12 및 종양 역학 13,14를 포함하여 유선 발달의 여러 단계에서 몇 가지 일시적인 생체 외 또는 피부 플랩 이미징 기술이 발표되었습니다. ,15. 이러한 기술은 유방 세포 역학의 공간적 및 시간적으로 해결 된 높은 이미징을 초래하지만, 대부분의 유선의 리모델링 과정은 며칠에서 몇 주가 걸리는 반면, 시간 프레임은 시간으로 제한됩니다. 따라서, 연장된 시간 프레임 동안 관심 조직에 대한 광학적 접근을 허용하는 방법이 요구된다. 수년에 걸쳐, 티타늄 유방 영상 창 (MIW)2,3,19를 포함하여 유방 종양 이미징 15,16,17,18을 위해 몇 가지 영구 이미징 창이 개발되었습니다. 유방 종양 성장을 연구하는 데 매우 유용하지만, 건강한 유선 구조의 시각화는 며칠로 제한되었습니다. 최근에는 유연한 실리콘 이미징 창이 개발되어20 주 동안 사춘기 유선을 시각화 할 수 있습니다. 그러나 유선은 지방세포가 풍부한 지방 패드에 매립되어 광범위한 광산란을 일으키고 결과적으로 유방 덕트 구조의 가시성을 제한합니다. 따라서 유선에서 장기간에 걸친 조직 역학을 시각화하기 위해서는 항상 우수한 이미징 조건이 필요합니다. 고전적인 MIW나 유연한 실리콘 창은 수술 및 이식 후 창이 닫힌 시스템을 형성하기 때문에 이미징 전에 조직 조작 또는 물리적 조직 위치 최적화를 허용하지 않습니다. 결과적으로, 근본적인 유방 조직에 대한 최적의 광학 접근은 더 긴 기간에 걸쳐 배제 될 가능성이 큽니다. 대조적으로, 피부 플랩 기술은 이미징 세션 동안 조직의 최적화 및 재배치를 허용하고, 피부 플랩은2회 여러 번 반복될 수 있다. 그러나 피부 플랩을 통한 반복적 인 이미징 세션은 피부의 회복을 허용하기 위해 수술 사이에 충분한 시간 (최소 7 일)이 할당 될 때만 가능하므로 더 긴 시간 척도에서 프로세스를 연구하는 데 주로 적합합니다. 또한, 침습적 인 성격과 상처 폐쇄시 감염 및 흉터의 위험이 크기 때문에이 절차를 여러 번 수행하지 않는 것이 좋습니다.
이러한 한계를 극복하기 위해, 즉 고주파에서 장기간 동안 최적의 이미징 조건을 보장함과 동시에 조직 조작을 허용하기 위해, 교체 가능한 뚜껑(R.MIW)을 갖는 MIW의 개선된 티타늄 버전은 2주까지 여러 날에서2 주에 걸쳐 건강하고 병든 유선을 시각화하도록 설계되었다(도 1A, B). R.MIW는 IVM 실험의 전체 기간 동안 직접 조직 조작을 가능하게하는 최적의 조직 접근을 제공하도록 맞춤 설계되었으므로 장기간에 걸쳐 적절한 시간과 장소에서 유선의 시각화를 허용합니다. R.MIW가 닫히면 기존 MIW에 필적하는 밀폐 시스템을 형성합니다(그림 1C). 무균 조건 하에서 개방될 때, R.MIW는 국소 조직 조작을 허용하여 광학 접근을 개선하고, 또한 경로 억제제 또는 작용제와 같은 물질의 국소 투여, 암 세포 또는 면역 세포 집단과 같은 관심있는 다른 세포 유형의 주입 또는 조직 표지 염료의 첨가를 가능하게 한다. 뚜껑은 이미징 세션 사이에 언제든지 열 수 있으며 기본 조직에 손상을 입히지 않습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig01.jpg"> 그림 1: 교체 가능한 뚜껑이 있는 유방 이미징 창 디자인. (A) 링에 접착된 10mm 커버글래스가 있는 유방 이미징 창의 교체 가능한 뚜껑의 상단도 및 측면도. (b) 지갑 끈 봉합사를 사용하여 마우스의 피부 내에 창을 고정시키기 위해 외부 링과 그 사이에 홈이있는 내부 링으로 구성된 유방 이미징 창의 상면도 및 측면도. 외부 링에는 뚜껑의 네 개의 돌기 (팔)에 맞는 작은 홈이 있습니다. (C) 뚜껑의 개폐 메커니즘을 보여주는 만화 및 그림. 기울어진 돌출부는 뚜껑이 창틀 내부에 고정되어 있는지 확인합니다. 이 그림은 Messal et al. 2에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 프로토콜은 R.MIW의 설계 및 이식 절차뿐만 아니라 세포 해상도에서 동일한 유방 덕트 및 시각화를 다시 방문하기위한 종단 IVM 전략을 설명합니다. R.MIW는 다양한 형광 리포터 마우스 모델에서 유선의 다양한 발달 단계에서 세포 분열 및 형태 학적 변화를 따라갈 수 있습니다. 종합하면, R.MIW는 유선의 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 용이하게합니다.

<table><tbody><tr><td>0.9% NaCl</td><td>BD</td><td>306573</td><td>기타 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>10mm 원형 커버 유리</td><td>Fisher scientific</td><td>10696365</td><td>기타 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>5-0 꼰 실크 봉합</td>사 <td>Ethicon</td><td>W580</td><td></td></tr><tr><td>80% 에탄올</td><td>수제</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>마취 유도 상자</td><td>Kentscientific</td><td>VetFlo-MSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>부프레노르핀(Vetergesic&reg;)</td><td>Ecuphar</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>코튼 팁 (멸균)</td> <td>Fisher scientific</td><td>13113743</td><td>다른 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>시아 노 아크릴레이트 접착제</td><td>록타이트</td><td>NA</td><td>다른 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>눈 연고</td><td>Duratears</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>유연한 나비 바늘</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450120</td><td>다른 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>Graefe 집게 (무딘)</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>히팅 패드</td><td>켄트사이언티픽</td><td>RightTemp Jr.</td><td>다른 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>이미징 상자</td><td>맞춤형</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>주입 영양 혼합물</td><td>Braun</td><td>Nutriflex special 70/240</td><td></td></tr><tr><td>인슐린 주사기</td><td>BD</td><td>324911</td><td>기타 브랜드 사용 가능</td></tr><tr><td>자동 스테이지가 있는 도립 다광자</td><td>현미경 Leica Microsystems</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane 기화기</td><td>Kentscientific</td><td>VetFlo-1231K</td><td></td></tr><tr><td>바늘 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>12510-14</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7793</td><td>반투명 테이프</td></tr><tr><td>종이 테이프</td><td>tesa Tesa</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>석유 젤리</td><td>바셀린</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher scientific</td><td>11904325</td><td>사용 가능한 다른 브랜드</td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>솔루션 엘라스토머</td><td>NA</td><td>모든 가정 용품</td></tr><tr><td>봄 가위 (작은)</td> <td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td></td></tr><tr><td>멸균 PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>주사기 (10 ml)</td> <td>BD</td><td>305482</td><td>다른 브랜드 사용</td></tr><tr><td>가능 얇은 집게</td><td>Fine Science Tools</td><td>11413-11</td><td></td></tr><tr><td>유방 이미징 창</td> <td>용 티타늄 뚜껑맞춤형</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>티타늄 유방 이미징 창</td><td>맞춤형</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>나무 막대기 이쑤시개</td><td>피셔 과학</td><td>NC1678836</td><td>사용 가능한 다른 브랜드</td></tr></tbody></table>

교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창을 사용하는 종방향 생체 내 현미경 검사

Longitudinal Intravital Microscopy Using a Mammary Imaging Window with Replaceable Lid

유선의 분지 구조는 매우 역동적이며 출생 후 성장과 리모델링의 여러 단계를 거칩니다. 피부 플랩 수술 또는 이미징 창문의 이식과 함께 생체 내 현미경 검사는 다양한 발달 단계에서 건강한 유선의 역학을 연구하는 데 사용되었습니다. 대부분의 유방 영상 기술은 수시간에서 며칠의 기간으로 제한되는 반면, 유선 리모델링 과정의 대부분은 며칠에서 몇 주까지의 시간 프레임으로 발생합니다. 유선의 리모델링을 연구하기 위해서는 연장된 기간 동안 관심 조직에 광학적으로 접근할 수 있는 방법이 필요하다. 여기에서, 교체 가능한 뚜껑(R.MIW)을 갖는 티타늄 유방 이미징 윈도우의 개선된 버전이 최대 몇 주 동안 세포 해상도로 유선의 고해상도 이미징을 가능하게 하는 것에 대해 설명한다. 중요하게도, R.MIW는 생체내 영상화 실험의 전체 기간에 걸쳐 조직 접근을 제공하며, 따라서 국소 조직 조작, 표지, 약물 투여 또는 이미지 유도 미세 해부에 사용될 수 있다. 종합하면, R.MIW는 유선 발달, 항상성 및 질병 동안 세포 역학의 고해상도 특성화를 가능하게합니다.

유선의 상이한 발달 단계 동안 유방 상피 세포의 증식 역학을 연구하기 위해 기술된 프로토콜이 수행되었다. R.MIW의 설계는 그림 1에 묘사되어 있으며, R.MIW를 이식하는 절차는 그림 2에 요약되어 있습니다. R.MIW는 유선과 피부 사이에 외과 적으로 이식됩니다. 봉합사는 창 링 내에 고정하고 마우스가 봉합사를 당기는 것을 방지하는 데 사용됩니다 (그림 2). R.MIW를 보유하고있는 봉합사는 비 흡수성 실크로 만들어져 저자 극성 특성과 부드러운 질감을 가지고 있으며 다루기 쉽습니다. R.MIW 링은 이식 후 염증이나 괴사를 촉진하지 않는 가장 생체 적합성이 높은 물질 중 하나 인 티타늄으로 만들어집니다21. 무균 상태를 따르고 봉합사가 잘 실행되면 R.MIW 유선이식은 수술 후 합병증의 위험이 낮습니다. 더욱이, 복부 이미징 창 이식(22)과는 달리, R.MIW 이식은 유선이 중요한 기관이 아니며 윤리적 프로토콜에 명시된 한계까지 매일 이미징을 허용하기 때문에 마우스 생존을 위한 제한 인자가 아니다. 창 이식 기간을 제한하는 유일한 요인은 피부의 항상성 회전율이며, 결국 4-6 주 후에 봉합사가 빠져 나옵니다. 따라서 봉합사의 안정성을 정기적으로 검사하는 것이 중요합니다. 원하는 경우, 봉합사는 창 안정성을 보장하기 위해 무균 조건 (단계 3.5 - 3.8에서 설명한 바와 같이) 하에서 새로운 지갑 끈 봉합사로 제거되고 대체 될 수 있습니다.
여러 날 이미징 접근 방식을 사용할 때 가장 큰 과제는 연속된 날에 ROI를 회수하는 것입니다. 이를 위해 ROI를 선택하기 전에 빠른 개요 스캔을 포함 할 수 있습니다 (그림 3B). 여러 조직 랜드마크를 사용하여 콜라겐 네트워크 신호(초고조파 생성에 의해 시각화됨), 조직 구조뿐만 아니라 염료 또는 형광 단백질로 차등적으로 또는 확률적으로 표지된 세포의 국소 패턴을 포함하는 조직의 동일한 영역을 리트레이킹할 수 있다(도 3B). 이 대표적인 예에서, R.MIW는 MMTV-PyMT의 4번째 유선에 이식되었다 ; R26-CreERT2헤트; R26-Confettihet 여성 마우스는 만질 수있는 종양 형성의 시작시에. 이어서, 확률적 재조합은 1.5 mg 타목시펜의 주사에 의해 유도되었고, 그 결과 일부 세포에서 Confetti 작제물의 재조합이 초래되었다(도 3C). 재조합된 종양 세포를 20일의 기간 동안 추적하였다(도 3B, C). 연속된 날에 걸친 유선의 동일한 영역의 영상화가 배제되는 경우, 무균 환경(단계 5.1에서 설명된 바와 같이)에서 창을 열어 가시성 및 이미지 획득을 개선하기 위해 조직을 추가로 정리하고 재배치할 수 있다(도 3A).
이 방법을 사용하여, 사춘기 동안 유선이 발달하는 것을 단일 세포 수준에서 추적하였다. R.MIW를 통한 IVM 반복은 R26-CreERT2het를 사용하여 수행되었고; R26-mTmGhet 암컷 마우스는 4-6주령 사이에 모든 세포가 막 tdTomato로 표지된다(도 4A)23. 마우스에 저용량의 타목시펜 (0.2 mg / 25 g 체중)을 주사하여 mTmG 구축물을 산발적으로 재조합하여 유선을 포함한 모든 조직의 일부 세포에서 적색에서 녹색으로 변화시켰다 (그림 4B). 동일한 ROI를 여러 날에 걸쳐 재검토하여 세포 분해능에서 덕트 신장과 덕트 분지화(그림 4C)를 포함한 유선의 형태학적 변화를 시각화했습니다. 중요하게도, 확률적 세포 표지와 다일 IVM의 이러한 조합은 또한 연장 및 분지 덕트를 둘러싸고 있는 스트로마에서의 단일 세포의 역학(도 4D)뿐만 아니라 사타구니 림프절 내의 세포 역학(도 4E)과 같은 덕트 환경의 동적 변화를 시각화할 수 있게 한다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig04.jpg"> 도 4: 사춘기 분지 형태형성의 다일 IVM. (A) 사춘기 R26-CreERT2; 4-6 주 사이의 생후 R26-mTmG 마우스에 R26-mTmG 대립유전자의 Cre 매개 재조합을 유도하는 저용량의 타목시펜을 주사하고, 유선의 발달에 대한 동적 변화를 따르기 위해 제1일, 3일 및 5일에 영상화하였다. (b) 비재결합 조건에서 막 tdTomato (mT)의 유비쿼터스 발현을 초래하는 R26-mTmG 마우스 구축물의 개략적인 표현. Cre-매개된 재조합시, mT는 막 eGFP (mG) 발현을 위해 전환된다. (c) R26-CreERT2에서 R.MIW를 통해 이미지화된 여러 날에 걸친 길쭉하고 분지된 유방 덕트의 3D 렌더링 ; R26-mTmG 암컷 마우스는 6주령에 있다. (D) 분기 팁(상단 패널)과 길쭉한 브랜치(하단 패널)의 단일 Z-평면 이미지. mT는 적색으로 표시되고, mG는 시안색으로, 스케일 바는 100μm(A 및 B)를 나타낸다. 스트로마의 단일 세포는 흰색 별표로 강조 표시됩니다. 신호 강도는 스트로마에서 단일 세포를 강조하기 위해 수동으로 증가하여 유방 상피 세포의 약간 과다 노출 된 출현으로 이어졌습니다. (e) R26-CreERT2의 사타구니 림프절의 대표적인 이미지 ; R.MIW를 통해 이미지화된 R26-mTmG 암 마우스는 개요 타일 스캔(왼쪽 패널), 단일 Z-평면의 확대/축소 이미지(오른쪽 패널) 및 3D 렌더링(하단)을 보여줍니다. 두 번째 고조파 생성 (콜라겐 I)은 녹색으로, mT는 빨간색으로, mG는 시안색으로 표시됩니다. 배율 막대는 500μm(개요 타일스캔) 및 100μm(확대/축소 이미지)를 나타냅니다. 도 패널 C 및 D는 Messal et al. 2로부터 변형된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
마찬가지로, 성인 유선에서 제안 된 R.MIW 접근법은 타협하지 않은 가시성으로 여러 날에 걸쳐 동일한 덕트 구조를 시각화 할 수 있습니다. Cdh1-mCFP(Ecadherin-mCFP) 마우스 모델과 같은 덜 밝은 형광 리포터 모델(24)을 사용하더라도 세포 분해능에서 덕트 안정성 및 미묘한 형태학적 변화의 시각화를 가능하게 한다(도 5). 3일차와 5일째 사이의 가시성은 조직 재배치 후 크게 개선되었습니다(그림 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig05.jpg"> 도 5: 성인 유선의 다일 영상. 3D 렌더링된 이미지들은 수일 연속으로 성인 여성 Cdh1-mCFP (시안, 에카데린 양성 발광 세포 발현을 표시함) 마우스의 유관 구조의 이미지이다. 콜라겐 I 패턴(초고조파 생성, 마젠타)을 사용하여 동일한 ROI를 되돌렸고, Cdh1-mCFP 신호를 사용하여 덕트(루미날) 세포를 표시하였다. 3일째 이후의 가시성은 R.MIW 뚜껑을 열고 조직을 재배치함으로써 개선되었다. 배율 막대는 100μm를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
단일 세포 수준에서 호르몬 주기 동안 유방 상피 세포의 증식성 이질성을 평가하기 위해, KikGR 단백질의 유비쿼터스 발현을 갖는 광전환성 키쿠메 그린-레드(KikGR) 리포터 마우스 모델 25,26이 사용되었다. KikGR은 보라색 빛에 노출되면 녹색에서 적색으로 전환되는 밝은 형광단이며 적색 / 녹색 비율은 세포2의 증식 활성에 대한 프록시로 사용할 수 있습니다 (그림 6A, B). R.MIW 접근법을 사용하여, 우리는 며칠 동안 성인 유선의 덕트 트리 내에서 동일한 세포를 추적했고, 덕트 트리 전체에 걸쳐 이전에 예상치 못한 증식성 이질성을 발견했다 (도 6C). 높은 증식성 및 낮은 증식성 세포는 상이한 변환된 영역에 걸쳐 동등하게 분포되었다(도 6C, D). 놀랍게도, 국소 수준에서 이웃 세포는 적색 / 녹색 비율에 큰 차이를 보였다 (그림 6C, D). 광변환 후 10 일 후에 다른 세포의 적색 / 녹색 비율 (증식 활성의 대리자로서)을 정량화하면 동일한 덕트 미세 환경 내에서 일부 세포의 매우 가변적 인 희석률이 나타났습니다 (그림 6E). 함께,이 데이터는 성인 유선에서 주목할만한 국소 증식 이질성을 보여 주며 동시에 전 세계적으로 균일 한 회전율을 보여줍니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63326/63326fig06.jpg"> 도 6: KikGR 마우스 모델을 사용하여 성인 유선에서의 증식성 이질성의 종방향 IVM . (A) KikGR 마우스는 보라색 빛에 노출되기 전과 후의 0일째에 영상화되었다. 이미징 세션은 변환 후 2일, 6일, 10일에 반복되었다. (B) 증식 후 KikGR 유방 상피 세포의 광변환에 따른 가설적 결과의 개략적 묘사 (왼쪽 패널) 및 증식 없음 (오른쪽 패널) 시간의 함수. (C) 유선의 동일한 영역은 10 일 동안 R.MIW를 통해 이미지화되었다. 더 작은 영역은 0일째에 광변환되었고, 시간에 따른 키쿠메 적색 신호의 유사한 희석률을 보이며, 이는 상피 전체에 걸쳐 동일한 회전율을 나타낸다. (d) 패널 C에서 지시된 영역의 줌 이미지(단일 Z-평면)는 광변환 후 6일 및 10일 후에 세포 수준에서 증식성 이질성을 나타낸다. 스케일 바는 100μm(패널 C) 및 10μm(패널 D)를 나타냅니다. (E) 세 개의 광변환 영역에서 무작위로 선택된 세포 (n = 48 세포)의 적색 / 녹색 비율의 정량화. 높은 적색 / 녹색 비율은 낮은 희석 속도와 낮은 증식 활성을 나타내는 반면, 낮은 적색 / 녹색 비율은 높은 희석 속도와 증식을 나타냅니다. 도 패널 C-E는 Messal et al. 2로부터 수정되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63326/63326fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 교체 가능한 뚜껑 (R.MIW)이있는 새로운 유방 이미징 창을 설명합니다. R.MIW의 이식 후 생체 내 현미경 검사는 다른 발달 단계에서 세포 해상도로 건강하고 병든 유선의 종방향 및 다일 이미징을 허용합니다.

The branched structure of the mammary gland is highly dynamic and undergoes several phases of growth and remodeling after birth. Intravital microscopy in ...

유선은 매우 역동적이며 평생 동안 여러 차례의 리모델링을 거칩니다. 우리의 프로토콜은 건강하고 병든 유선에서 조직 재배열을 유도하는 세포 역학을 포착 할 수있게합니다. 교체 가능한 뚜껑이 있는 당사의 유방 이미징 창은 최대 몇 주까지 장기간에 걸쳐 유선의 종방향 생체 내 이미징을 수행할 수 있습니다.유방 이미징 창의 교체 가능한 뚜껑은 항상 최적의 이미징 조건을 보장하고 이미징 세션 사이에 조직 조작 또는 약물 투여를 허용합니다. 우리의 방법은 건강한 유선 생물학에 대한 통찰력을 제공 할뿐만 아니라 단일 세포 수준에서 유방 종양 개시 및 진행을 연구 할 수있게합니다. 유방 이미징 창의 뚜껑을 멸균 표면에 놓고 전체 림 뚜껑 둘레에 시아 노 아크릴레이트 접착제를 적용하여 시작하십시오.뚜껑 위에 조심스럽게 10mm 둥근 유리 커버 슬립을 놓습니다. 멸균 된 나무 스틱을 사용하여 유리 커버 슬립을 배치하고 아래로 밀어 내려 유리 커버 슬립과 뚜껑의 프레임 사이에 밀폐 된 씰을 보장합니다. 유리가 뚜껑의 팔에있는 구멍을 덮지 않도록하십시오.뚜껑과 유방 이미징 창을 닫힌 페트리 접시에 적어도 30 분 동안 80 % 에탄올에 담그고 소독하십시오. 아세톤에 담근 면봉을 사용하여 유리 커버 슬립에 과량의 시아노아크릴레이트 접착제를 제거합니다. 수술을 위해 마우스를 준비하려면 면도날을 사용하여 네 번째 유선의 주변 영역을 면도하십시오.네 번째 젖꼭지를 랜드 마크로 사용하고 끈적 끈적한 테이프를 사용하여 느슨한 머리카락을 제거하십시오. 발 금단 검사를 수행하여 동물이 적절하게 마취되었는지 확인하십시오. 미세한 Graefe 포셉을 사용하여 피부를 부드럽게 들어 올리고 작은 스프링 가위를 사용하여 네 번째 유방 지방 패드 위에 피부에 10 ~ 15 밀리미터 대각선 절개를 만들고 네 번째 젖꼭지를 방향점으로 사용하고 복막 또는 유선을 자르거나 손상시키지 않도록하십시오.유방 지방 패드와 하부 조직층으로부터 피부를 분리하여 절개 라인 주위에 최대 다섯 ~ 여덟 밀리미터의 무딘 해부를 사용하여 유방 이미징 창틀에 맞는 포켓을 만듭니다. 림프절 또는 종양 병변의 위치를 포함하는 유방 조직의 거시적 특징에 기초하여 관심 영역 또는 ROI를 정의한다. 절개와 관련하여 ROI를 중심에 두십시오.멸균 포셉을 사용하여 유방 이미징 창을 들고 절개가 창을 삽입하기에 충분히 큰지 테스트하십시오. 필요한 경우 유방 이미징 창이 들어갈 때까지 절개를 약간 확대하십시오. 창문을 제거하고 5-0 실크 봉합사를 사용하여 꼬리 끝에서 시작하여 피부 외부에서 안쪽으로 절개 가장자리에서 한 두 밀리미터 떨어진 곳에 지갑 끈 봉합사를 놓습니다.절개를 따라 약 다섯 밀리미터 위로 움직이고 봉합사 실을 내부에서 외부로 피부를 통과시킵니다. 절개의 가장자리를 따라이 절차를 반복하여 다섯 개에서 여섯 개의 루프로 구성된 원형 봉합사를 만듭니다. 봉합사 실의 최종 출구는 첫 번째 입구에서 약 두 ~ 다섯 밀리미터 떨어진 곳에 위치해야합니다.유방 이미징 창을 절개 안쪽에 맞추고 Graefe 포셉을 사용하여 조심스럽게 피부를 창문의 홈에 놓습니다. 봉합사의 루프를 바깥에 두십시오. 지갑 끈 봉합사의 루프를 당기고 봉합사의 양쪽 끝을 부드럽게 당겨 유방 이미징 창의 홈에서 조이십시오.외과 용 매듭으로 묶고 과도한 실을 잘라냅니다. 이쑤시개를 사용하여 석유 젤리를 창문의 안쪽 테두리에 바르면 기본 조직을 피할 수 있습니다. 멸균 포셉으로 창 프레임을 아래쪽으로 부드럽게 밀고 뚜껑을 창틀에 놓습니다.이렇게하면 유선과 유방 이미징 창 뚜껑 사이에 공기가 많이 들어 있지 않습니다. 얇은 포셉의 끝을 뚜껑의 팔에있는 구멍을 통해 놓고 시계 방향으로 비틀어 뚜껑을 조이십시오. 뚜껑을 조인 후에도 약간의 공기가 남아 있으면 피부를 통해 멸균 인슐린 바늘을 유방 조직과 뚜껑 사이의 구멍으로 도입하고 플런저를 천천히 꺼내어 유선과 유방 이미징 창 뚜껑 사이에 진공을 만듭니다.이제이 절차 후에 림프절을 쉽게 관찰 할 수 있습니다. 봉합사의 안정성 또는 뚜껑의 잠재적 손상을 포함하여 유방 이미징 창 프레임과 뚜껑의 상태를 검사하십시오. 유방 이미징 창이 이미징 박스 인레이의 구멍에 떨어지는 방식으로 마우스를 인레이에 놓습니다.반투명 및 종이 테이프를 마우스 뒷면에 발라서 마우스를 안정시키고 호흡으로 인한 조직 움직임을 줄입니다. 세 시간 이상의 이미징 세션의 경우, 유연한 바늘을 마우스 목에 피하 상태로 놓고 종이 테이프로 고정하십시오. 영양 믹스가 있는 10밀리미터 주사기를 유연한 실리콘 튜브에 부착하고 튜브 끝에 도달할 때까지 영양소 믹스를 밀어 넣습니다.실리콘 튜브를 유연한 바늘에 연결하고 30 분마다 주입 된 용액 50 마이크로 리터를 주입하십시오. 이미징 박스 위에 뚜껑을 올려 닫습니다. 그런 다음 이미징 박스를 현미경 단계에 고정하십시오.마우스가 이미징 박스 내부에서 안정되어 있는지 확인합니다. 현미경의 epifluorescence 모드를 사용하여 관심 영역을 정의하고 현미경 설정을 적용합니다. 이미징 소프트웨어 네비게이터 모드에서 나선형 기능을 사용하여 큰 개요 타일 스캔을 생성하고 조직의 참조 맵을 만듭니다.나선형 개요 내에서 관심 영역을 정의한 다음 위쪽 및 아래쪽 Z 평면을 정의하여 Z 스택을 결정합니다. 시작을 눌러 조직의 자세한 입체 또는 사차원 Z 스택을 가져옵니다. 얇은 포셉의 끝을 뚜껑의 팔에있는 유방 이미징 창 구멍을 통해 놓고 시계 반대 방향으로 비틀어 뚜껑을 느슨하게하십시오.대안적으로, 조직은 특정 관심 영역에 대한 이미징 조건을 최적화하기 위해 멸균 둔탁 포셉을 사용하여 조작되거나 재배치될 수 있다. 유방 이미징 창의 내부 테두리에 석유 젤리를 바르고 기본 조직을 피하십시오. 멸균 포셉으로 창 프레임을 아래쪽으로 부드럽게 밀고 뚜껑을 창틀에 놓습니다.마지막으로, 얇은 포셉의 끝을 뚜껑의 팔 구멍을 통해 놓고 시계 방향으로 비틀어 뚜껑을 밝게하십시오. 사춘기 Rosa26 Cre/ERT2 Rosa26-막 토마토-막 GFP 마우스에 저용량의 타목시펜을 주사하여, Rosa26-막 토마토-막 GFP 대립유전자의 Cre-매개된 재조합을 유도하였다. 마우스를 발달하는 유선의 역동적인 변화를 따르기 위해 첫째, 셋, 다섯 날에 영상화하였다.대표적인 이미지는 유방 이미징 창을 통해 이미지화 된 여러 날에 걸쳐 길쭉하고 분기되는 유방 덕트의 3D 렌더링을 보여줍니다. 분기 팁과 길쭉한 분기의 단일 Z면 이미지가 여기에 표시됩니다. 스트로마의 단일 세포는 흰색 별표로 강조 표시됩니다.대표적인 이미지는 유방 영상 창을 통해 영상화된 마우스의 사타구니 림프절을 보여준다. 두 번째 고조파 세대는 녹색으로 묘사됩니다. 수일에 걸친 성인 여성 E-cadherin 막 CFP 마우스의 유방관 구조의 3D 렌더링된 이미지가 여기에 도시되어 있다.콜라겐 I 패턴은 동일한 ROI를 되짚어내기 위해 사용되었고, E-cadherin 막 CFP 신호는 덕트 세포를 표시하기 위해 사용되었다. 키쿠메 녹색-적색 마우스는 보라색 빛에 노출되기 전과 후에 제로일에 영상화되었다. 이미징 세션은 변환 후 둘째, 여섯 및 10 일에 반복되었습니다.유선의 동일한 영역을 10 일 동안 유방 이미징 창을 통해 이미징했습니다. 더 작은 영역은 0일째에 광변환되었고, 시간에 따른 키쿠메 적색 신호의 유사한 희석률을 나타냈으며, 이는 상피 전체에 걸쳐 동일한 회전율을 나타낸다. 표시된 영역의 확대/축소 이미지는 광변환 후 6일 및 10일 후에 세포 수준에서 증식성 이질성을 보여준다.광변환 10일 후 상이한 세포의 적색 대 녹색 비율의 정량화는 동일한 덕트 미세환경 내의 일부 세포의 고도로 가변적인 희석 속도를 나타냈다. 이 절차의 중요한 단계는 이미징 세션 사이에 뚜껑을 여는 것입니다. 창의이 독특한 특징은 이미징 조건을 개선하고 조직의 종방향 이미징을 허용합니다.교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창은 마우스 유선에서의 종양 개시 및 진행 분야에서 생체 내, 빠른 작용 약물 검사 및 스크리닝에 관한 새로운 질문을 용이하게합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

내유 이미징 창을 통해 Dendra2 - 라벨 종양 세포의 Intravital photoswitching 및 추적은 우리가 이미지 일 timescale 이상 선택 종양의 microenvironments에서 종양 세포의 전이성 동작을 수있는 기술입니다.

내유 이미징 창문 Dendra2 Photoswitching

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

이 프로토콜 셀 전용 형광 마커를 표현 하는 유전자 변형 생쥐의 intravital 영상을 설명 합니다. Intravital 이미징 생체 삽입형 윈도 통해 프로세스의 미세한 시각화는 가능한를 사용 하 여 고해상도 관측에 대 한 비-침략 적 방법을 제공 한다. 이 방법은 경도 과정 공부에 특히 유용 합니다.

Intravital 현미경 종양 관련 맥 관 구조를 사용 하 여 고급 등 유전자 변형 형광 생쥐 피부 집계 창 실

우리는 거꾸로 회전 디스크 공초점 현미경 검사법에 의해 뮤린 소장의 내장 영상을 사용하여 GFP 표지된 γδ IELs를 구상하는 방법을 기술합니다. 이 기술은 최대 4 시간 동안 점막 내의 살아있는 세포의 추적을 가능하게하고 장 내 면역 상피 상호 작용의 다양한 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

뮤린 소장에서 상피 내 림프구의 활력 영상

췌장의 생체 내 고해상도 이미징은 췌장 내 생체 내 이미징 창으로 촉진되었다.

췌장 인트라바이탈 이미징 창이 있는 뮤린 모델에서 췌장의 생체 내 세포 수준 시각화안정화

관심 조직/기관 및 피부에 직접 접착할 수 있는 광학적으로 투명한 실리콘 창을 사용하여 장기간 생체 내 이미징을 위한 접근법이 제시됩니다. 이 창문은 현재 현장에서 사용되는 다른 창문보다 저렴하고 다재다능하며 외과 적 삽입은 동물에게 제한된 염증과 고통을 유발합니다.

투명한 실리콘 윈도우를 통한 종방향 생체 내 이미징

여기에 설명된 생체내 영상화 방법은 대사 보조인자 NAD(P)H로부터의 콜라겐 초고조파 생성 및 내인성 형광을 이용하여 표지되지 않은 종양 미세환경을 종양, 기질 및 혈관 구획으로 비침습적으로 분절하여 4D 생체내 영상의 심층 분석을 한다.

유방 종양 미세환경의 생체 내 이미징을 위한 라벨 없는 세분화 접근법

본 프로토콜은 레이저 스캐닝 컨포칼 및 다광자 현미경에 의한 수유 마우스 유선의 생체 내 이미징을 위한 손쉬운 기술을 설명합니다.

Intravital Subcellular Microscopy of the Mammary Gland(유선의 생체 내 세포내 현미경)

이 프로토콜은 도립 컨포칼 현미경을 사용하여 생체 내 이미징을 단순화하는 새로운 도구를 제공합니다.

도립 컨포칼 현미경에서 상피 조직 역학의 장기 모니터링을 위한 간소화된 생체 내 이미징 접근 방식

루시페라제 표현 내유 종양 세포는 생쥐의 subcutaneously 이식 및 비 invasively 종단 연구에 종양이 성장과 발전을 모니터 광학 이미징을 사용하여 시각입니다.

IVIS 스펙트럼을 사용하여 내유 종양의 생체내 이미징에서 발광 생물

학습하세요 교체 가능한 뚜껑이 있는 유방 이미징 창을 이용한 종방향 생체 내 현미경 검사법으로, 마우스 유선 조직의 세포 역학과 종양 진행 과정을 단일 세포 수준에서 관찰할 수 있습니다.

교체 가능한 뚜껑이있는 유방 이미징 창을 사용하는 종방향 생체 내 현미경 검사

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