Utilizzo della microscopia a 2 fotoni per quantificare gli effetti dell'ostruzione ureterale unilaterale cronica sui processi glomerulari

Nei dati presentati in questo studio mostrano gli effetti drammatici dell'ostruzione ureterale unilaterale sulla funzionalità renale, sull'infiammazione e sulla fibrosi. Ci aiuta a comprendere i meccanismi fisiopatologici dell'ostruzione ureterale unilaterale. Il vantaggio principale di questa tecnica è la capacità di studiare le interazioni cellula-cellula, gli eventi subcellulari e associare la struttura e la funzione in modo dinamico all'interno di un rene funzionante.

La dimostrazione della procedura ureterale sarà eseguita dalla dott.ssa Silvia Campos-Bilderback che è un chirurgo nel nostro laboratorio. Per iniziare, anestetizzare il ratto, quindi fare un'incisione lungo la linea mediana e individuare il rene sinistro per separarlo dagli organi peritoneali circostanti. Dopo aver localizzato il peduncolo renale, comprendente l'arteria renale, la vena renale e l'uretere, separare l'uretere senza danneggiare la delicata struttura.

Utilizzare una pinza per avvolgere e legare una sutura 3-0 attorno all'uretere, quindi legare un nodo di pochi millimetri su entrambi i lati del primo nodo per assicurare l'ostruzione completa. Una volta che l'uretere è legato, chiudere con attenzione gli strati muscolari successivi, quindi chiudere completamente l'addome. Chiudere la pelle esterna con graffette chirurgiche.

Per la preparazione chirurgica, posizionare il ratto anestetizzato con una linea di accesso venoso permanente sul lato con il fianco sinistro rasato rivolto verso l'alto piatto e dritto sul tavolo. Assicurarsi che le zampe anteriori del topo si tocchino l'un l'altra così come le zampe posteriori. Una volta posizionato il ratto, palpare il fianco sinistro appena sotto le costole per sentire il rene e determinare la posizione naturale nell'addome, quindi tracciare una linea usando un pennarello permanente lungo l'area rasata, tagliando in due il centro del rene in un orientamento naso-coda.

Utilizzare un paio di pinze dentate per afferrare e sollevare la pelle verso l'alto e pizzicare la linea marcatrice permanente con un paio di emostatici per schiacciare la vascolarizzazione sottostante e prevenire il sanguinamento. Ripetere la procedura per il sottile strato muscolare esterno per ridurre al minimo il sanguinamento. Per fare l'incisione finale del sottile strato muscolare addominale interno, palpare il rene per stimare le dimensioni e la posizione e sollevare lo strato muscolare interno con un paio di pinze, quindi schiacciare una linea che taglia in due la pelle sopra il rene con gli emostatici che è circa 1/3 della dimensione stimata del rene.

Mantenendo la presa sullo strato muscolare con la pinza, fare l'incisione finale. Successivamente, utilizzare una pinza in ogni mano per afferrare e trattenere il grasso del rene al polo inferiore del rene con una tecnica hand-over-hand che lavora verso il basso. Avere una presa salda sul grasso con una mano, tirare il grasso e spremere molto delicatamente il rene attraverso l'incisione.

Se il rene non passa attraverso, allargare facilmente l'incisione. Per identificare i globuli bianchi o globuli bianchi depositati nelle anse capillari, somministrare la colorazione nucleare Hoechst 33342 a 8 microgrammi per chilogrammo di peso del ratto attraverso una linea di accesso venoso permanente. Al microscopio, posizionare il rene esposto contro il bordo del piatto con una leggera rotazione in modo che il lato addominale del rene entri in contatto con il vetrino di copertura e il lato dorsale sia rivolto lontano dal bordo.

Per ridurre ulteriormente il movimento, imballare due garze sterili 2 per 2 inumidite con soluzione salina contro il lato dorsale del rene rinforzando il contatto del lato addominale del rene al bordo. Quando il campione è posizionato, guardare attraverso l'oculare del microscopio sotto l'illuminazione a epifluorescenza utilizzando un cubo FITC a doppio passaggio di rodamina. Se viene rilevato un movimento nella posizione del campione, apportare piccole regolazioni regolando la garza assicurandosi che non spinga sotto il rene.

Arrotolare leggermente il topo in modo che il torace sia più lontano dal piatto. Scansiona la superficie del rene utilizzando l'illuminazione a epifluorescenza e contrassegna le posizioni dei glomeruli utilizzando il software associato al controller di scena motorizzato. Per ogni canale di colore sotto illuminazione a 2 fotoni, prendi un volume 3D poco profondo della parte superiore di ciascun glomerulo marcato per fungere da immagine di sfondo.

Nell'opzione di visualizzazione del software di imaging, utilizzare una pseudo tavolozza di colori per visualizzare le deboli intensità della fluorescenza di fondo degli anelli capillari glomerulari. Utilizzando un vaso sanguigno superficiale come punto focale, infondere lentamente l'albumina sierica fluorescente Texas Red RAP o TRRSA osservando l'aumento e la caduta della fluorescenza dovuta alla distribuzione sistemica fino a quando un'intensità nella vascolarizzazione peritubulare e nelle anse capillari è appena al di sotto della saturazione. Dopo 10 minuti, acquisire volumi 3D per tutti i glomeruli marcati e ripresi a intervalli di 1 micrometro.

Trova un vaso appropriato, un anello capillare o un vaso peritubolare, quindi ruota l'immagine utilizzando la funzione Ruota poiché la funzione Line Scan nel software di acquisizione delle immagini richiede che il vaso sia perpendicolare. Una volta che il recipiente è ruotato e sdraiato in piano, selezionare la funzione XT nel menu Acquisizione e impostarlo per scansionare 4.000 linee. Posizionare la linea attraverso il recipiente da esaminare con il piano focale al diametro massimo del segmento.

Quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse sull'immagine composita a colori e selezionare la scheda Scatta istantanea per generare un'immagine di riferimento dell'area in cui è stata eseguita la scansione lineare. Fare immediatamente clic sul pulsante Start per acquisire la scansione della linea della nave. Successivamente, importare le scansioni lineari nel software di elaborazione delle immagini per determinare la portata RBC.

Nel menu a discesa Misura, aprite la finestra di dialogo Mostra statistiche regione e selezionate lo strumento Disegno a linea singola per disegnare una linea che corrisponda alla pendenza delle ombre RBC. Dopo aver notato la larghezza e l'altezza della linea, utilizzare un'equazione per calcolare la velocità, quindi ottenere una media di cinque calcoli per segnalare la velocità per ogni scansione della linea. Centrare un glomerulo nel campo dell'imaging e prendere un set di dati 3D a partire dalla superficie glomerulare e terminare a 30-35 micrometri.

Utilizzare una dimensione di passo di 1 micrometro nella direzione Z. Identificare i globuli bianchi confrontando il canale blu di Hoechst con il canale dell'albumina rossa del Texas cercando l'esclusione del colorante rosso nel ciclo capillare e una corrispondente colorazione nucleare. Se i globuli bianchi appaiono statici su tre sezioni ottiche, definire le celle come aderite, quindi riportare i valori come occorrenza per 10 sezioni ottiche dalla parte superiore del glomerulo prelevate a intervalli di 1 micrometro.

Il numero di glomerulari per campo nei ratti Wistar Fromter o MWF di Monaco è aumentato nel gruppo UUO di 5 settimane rispetto ai ratti non trattati. I ratti Sprague-Dawley, o ratti SD, sono passati dall'assenza di glomeruli superficiali a 2,02 per campo dopo cinque settimane di ostruzione ureterale unilaterale. Sono state osservate immagini tridimensionali ricostruite per visualizzare la superficie renale.

L'ostruzione uretale unilaterale di 5 settimane nei ratti SD non ha portato ad aree simili ai normali epiteli tubulari come visto nel MWF, non trattata, e parzialmente nei ratti MWF UUO di 5 settimane. Nello studio della dinamica vascolare renale, il flusso sanguigno renale è stato significativamente ridotto nei gruppi MWF UUO a 5 settimane e SD rispetto ai ratti non trattati. La velocità dei globuli rossi all'interno dei loop capillari glomerulari è stata significativamente ridotta nel MWF UUO a 5 settimane e nei ratti SD rispetto ai ratti MWF non trattati.

Inoltre, i ratti MWF non trattati avevano meno globuli bianchi per 10 sezioni ottiche dall'alto, mentre il numero aumentava nei ratti MWF UUO a 5 settimane e UUO SD a 5 settimane. Con l'ostruzione uretale unilaterale, è stato osservato un aumento della permeabilità all'albumina. Un accumulo di albumina all'interno dello spazio di Bowman era intenso dopo l'ostruzione uretale unilaterale.

L'endocitosi del segmento S1 presenta grandi quantità di albumina osservate con condizioni fisiologiche in ratti MWF non trattati. Lo stesso assorbimento non è stato osservato nei ratti MWF o SD dopo 5 settimane di ostruzione uretale unilaterale. Molti metodi diversi come l'imaging ripetuto per studiare un processo nel tempo, la fissazione di un'area specifica per l'imaging e il successivo utilizzo del tessuto fisso per eseguire la microscopia a risoluzione più elevata possono essere eseguiti in combinazione con questa tecnica.

La tecnica è considerata tecnologia dirompente. È consentito agli investigatori di rispondere a molte nuove domande. In tal modo, sono state fornite nuove intuizioni e sono stati ottenuti dati che cambiano il paradigma.