Name: Estrazione e purificazione della proteina FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Scopri l'estrazione e la purificazione della proteina FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo. Questo metodo preserva la forma fisiologica e l'attività catalitica, supportando lo sviluppo di anticorpi di alta qualità.

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Gli autori sono molto grati per l'assistenza tecnica di Ayse Öztürk ed Eva Albertini. I topi utilizzati per la generazione di tessuto epatico sono stati mantenuti sotto la supervisione di Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Istituto per la ricerca sull'invecchiamento biomedico presso l'Università di Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Austria).

<ol><li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+FAH+domain-containing+protein+1+%28FAHD1%29+as+oxaloacetate+decarboxylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).</li>
<li>Pircher, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+human+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+Protein+1+%28FAHD1%29+as+a+novel+mitochondrial+acylpyruvase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of human Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing Protein 1 (FAHD1) as a novel mitochondrial acylpyruvase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (42), 36500-36508 (2011).</li>
<li>Kang, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence+surveillance+of+pre-malignant+hepatocytes+limits+liver+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Senescence surveillance of pre-malignant hepatocytes limits liver cancer development.</a> Nature. 479 (7374), 547-551 (2011).</li>
<li>Hong, H., Seo, H., Park, W., Kim, K. K. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence%2C+structure+and+function-based+classification+of+the+broadly+conserved+FAH+superfamily+reveals+two+distinct+fumarylpyruvate+hydrolase+subfamilies%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Sequence, structure and function-based classification of the broadly conserved FAH superfamily reveals two distinct fumarylpyruvate hydrolase subfamilies.</a> Environmental Microbiology. 22 (1), 270-285 (2020).</li>
<li>Timm, D. E., Mueller, H. A., Bhanumoorthy, P., Harp, J. M., Bunick, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+mechanism+of+a+carbon-carbon+bond+hydrolase%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and mechanism of a carbon-carbon bond hydrolase.</a> Structure. 7 (9), London, England. 1023-1033 (1999).</li>
<li>Bateman, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+inferences+from+the+crystal+structure+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+with+a+bound+phosphorus-based+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanistic inferences from the crystal structure of Fumarylacetoacetate Hydrolase with a bound phosphorus-based inhibitor.</a> Journal of Biological Chemistry. 276 (18), 15284-15291 (2001).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+the+bi-functionality+of+human+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Structural basis for the bi-functionality of human oxaloacetate decarboxylase FAHD1.</a> Biochemical Journal. 475 (22), 3561-3576 (2018).</li>
<li>Etemad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+-+a+new+regulator+of+mitochondrial+function+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Oxaloacetate decarboxylase FAHD1 - a new regulator of mitochondrial function and senescence.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 177, 22-29 (2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cellular+senescence+by+eukaryotic+members+of+the+FAH+superfamily+-+A+role+in+calcium+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Ageing+and+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of cellular senescence by eukaryotic members of the FAH superfamily - A role in calcium homeostasis.</a> Mechanisms of Ageing and Development. 190, 111284(2020).</li>
<li>Petit, M., Koziel, R., Etemad, S., Pircher, H., Jansen-Dürr, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+oxaloacetate+decarboxylase+FAHD1+inhibits+mitochondrial+electron+transport+and+induces+cellular+senescence+in+human+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Depletion of oxaloacetate decarboxylase FAHD1 inhibits mitochondrial electron transport and induces cellular senescence in human endothelial cells.</a> Experimental Gerontology. 92, 7-12 (2017).</li>
<li>Wiley, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+induces+senescence+with+a+distinct+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction induces senescence with a distinct secretory phenotype.</a> Cell Metabolism. 23 (2), 303-314 (2016).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+crystallization%2C+and+enzyme+assays+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain-containing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, crystallization, and enzyme assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-containing proteins.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59729(2019).</li>
<li>Weiss, A. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Domain+Containing+Protein+1+%28FAHD1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molcules%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain Containing Protein 1 (FAHD1).</a> Molcules. 26 (16), 5009(2021).</li>
<li>Mizutani, H., Kunishima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification%2C+crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+the+fumarylacetoacetase+family+member+TTHA0809+from+Thermus+thermophilus+HB8%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallographica+Section+F+Structural+Biology+and+Crystallization+Communications%22%5BJournal%5D)">Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the fumarylacetoacetase family member TTHA0809 from Thermus thermophilus HB8.</a> Acta Crystallographica Section F Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (9), 792-794 (2007).</li>
<li>Lee, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+outline+of+methods+for+protein+isolation+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A simple outline of methods for protein isolation and purification.</a> Endocrinology and Metabolism. 32 (1), Seoul, Korea. 18-22 (2017).</li>
<li>Amer, H. E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+proteins%3A+Between+meaning+and+different+methods%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Technologies+and+Applications%22%5BJournal%5D)">Purification of proteins: Between meaning and different methods).</a> Proteomics Technologies and Applications. , (2019).</li>
<li>Niu, L., Yuan, H., Gong, F., Wu, X., Wang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+extraction+methods+shape+much+of+the+extracted+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Protein extraction methods shape much of the extracted proteomes.</a> Frontiers in Plant Science. 9, 802(2018).</li>
<li>Gordon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+vanadate+as+protein-phosphotyrosine+phosphatase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.</a> Methods in Enzymology. 201, 477-482 (1991).</li>
<li>Gallagher, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDS-polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28SDS-PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Essential+Laboratory+Techniques%22%5BJournal%5D)">SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).</a> Current Protocols in Essential Laboratory Techniques. , (2012).</li>
<li>Ahmed, U., Saunders, G. Effect of pH on Protein Size Exclusion Chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf">https://www.agilent.com/cs/library/applications/5990-8138EN.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sørensen, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silver+staining+of+proteins+on+electroblotting+membranes+and+intensification+of+silver+staining+of+proteins+separated+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Silver staining of proteins on electroblotting membranes and intensification of silver staining of proteins separated by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 304 (1), 33-41 (2002).</li>
<li>Fagerberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+human+tissue-specific+expression+by+genome-wide+integration+of+transcriptomics+and+antibody-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of the human tissue-specific expression by genome-wide integration of transcriptomics and antibody-based proteomics.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (2), 397-406 (2014).</li>
<li>Cytiva Life Fundamentals of size exclusion chromatography. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography">https://www.cytivalifesciences.com/en/us/solutions/protein-research/knowledge-center/protein-purification-methods/size-exclusion-chromatography</a> (2022).</li>
<li>Rosano, G. L., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+protein+expression+in+Escherichia+coli%3A+advances+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges.</a> Frontiers in Microbiology. 5, 172(2014).</li>
<li>Rosano, G. L., Morales, E. S., Ceccarelli, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+recombinant+protein+production+in+Escherichia+coli%3A+A+5-year+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%3A+A+Publication+of+the+Protein+Society%22%5BJournal%5D)">New tools for recombinant protein production in Escherichia coli: A 5-year update.</a> Protein Science: A Publication of the Protein Society. 28 (8), 1412-1422 (2019).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Passaggi critici nel protocollo Seguire le linee guida comuni per la manipolazione delle proteine è essenziale, come lavorare sul ghiaccio e in condizioni di pH e sale moderate. L'uso di inibitori della proteasi è benefico per il metodo, mentre l'uso di inibitori del proteasoma è altamente raccomandato. Il congelamento e lo scongelamento del campione possono sempre comportare la precipitazione proteica (almeno parzialmente), pertanto qualsiasi aliquota scongelata del lisato proteico iniziale (fase 2) ...

La proteina 1 contenente dominio FAH eucariotico (FAHD1) agisce come ossalacetato bifunzionale (OAA) decarbossilasi (ODx)1 e idrolasi acilpropurato (ApH)2. È localizzato nei mitocondri2 e appartiene all'ampia superfamiglia FAH degli enzimi 1,2,3,4,5,6. Mentre la sua attività ApH è solo di minore rilevanza, l'attività ODx di FAHD1 è coinvolta nella regolazione del flusso del ciclo TCA 1,7,8,9. L'OAA non è solo richiesto per la reazione centrale della citrato sintasi nel ciclo dell'acido tricarbossilico, ma agisce anche come inibitore competitivo della succinato deidrogenasi come parte del sistema di trasporto degli elettroni e come metabolita cataplerotico. La downregulation dell'espressione genica di FAHD1 nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) ha determinato una significativa riduzione del tasso di proliferazione cellulare10 e una significativa inibizione del potenziale di membrana mitocondriale, associata a un concomitante passaggio alla glicolisi. Il modello di lavoro si riferisce alla senescenza associata alla disfunzione mitocondriale (MiDAS)11-like fenotipo8, in cui i livelli di OAA mitocondriale sono strettamente regolati dall'attività FAHD1 1,8,9.
La proteina ricombinante è più facile da ottenere attraverso l'espressione e la purificazione dai batteri12 piuttosto che dai tessuti. Tuttavia, una proteina espressa nei batteri può essere influenzata dalla possibile mancanza di modifiche post-traduzionali, o può semplicemente essere problematica (ad esempio, a causa della perdita di plasmidi, risposte allo stress batterico, legami disolfuro distorti / non formati, nessuna o scarsa secrezione, aggregazione proteica, scissione proteolitica, ecc.). Per alcune applicazioni, le proteine devono essere ottenute dal lisato cellulare o dal tessuto, al fine di includere tali modifiche e/o di escludere possibili artefatti. La proteina purificata dai tessuti supporta lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e/o inibitori farmacologici potenti e specifici per enzimi selezionati, come per FAHD113.
Questo manoscritto presenta una serie di metodi per l'estrazione e la purificazione di FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi descritti richiedono una cromatografia liquida proteica veloce (FPLC), ma per il resto utilizzano apparecchiature di laboratorio comuni. Metodi alternativi possono essere trovati altrove 14,15,16,17. Dopo l'estrazione totale delle proteine, il protocollo proposto prevede una fase di test, in cui vengono discussi i sottoprotocolli per la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico (Figura 1). Dopo aver definito questi sotto-protocolli, la proteina di interesse viene estratta attraverso una strategia sequenziale utilizzando lo scambio ionico e la cromatografia di esclusione dimensionale con FPLC. Sulla base di queste linee guida, il protocollo finale può essere adattato individualmente per altre proteine di interesse.
<img alt="Flusso di lavoro del processamento tissutale: centrifugazione, precipitazione, cromatografia; Analisi del Western Blot." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63333/63333fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: La strategia generale di questo protocollo. Dall'alto verso il basso: le proteine vengono estratte dai tessuti. L'omogeneizzato tissutale viene preparato, centrifugato e filtrato. Per ogni coppia di campioni surnatante e derivati da pellet, è necessario eseguire test per la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico (FPLC) per sondare le condizioni ottimali. Dopo aver stabilito questi sotto-protocolli, la proteina può essere estratta tramite una procedura sequenziale di precipitazione del solfato di ammonio, cromatografia a scambio ionico e cromatografia di esclusione di dimensioni ripetitive (FPLC) a diverse concentrazioni di pH e sale. Tutti i passaggi devono essere controllati da western blot. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63333/63333fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m unità filtranti</td><td>MERCK</td><td>SLGP033RS</td><td>Millex-HP, 0,22 &micro; m, PES 33 mm, non sterile</td></tr><tr><td>0,45 &micro; m unità filtranti</td><td>MERCK</td><td>SLHP033NS</td><td>Millex-HP, 0,45 & micro; m, PES 33 mm, non sterile</td></tr><tr><td>15 mL Provette Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0451</td><td>provette centrifughe</td></tr><tr><td>50 mL Provette Falcon</td><td>VWR</td><td>734-0448</td><td>provette centrifughe</td></tr><tr><td>96-Well UV Microplate</td><td>Thermo-Fischer</td><td>8404</td><td>UV/VIS trasparente a fondo piatto 96 pozzetti</td></tr><tr><td>Soluzione acrilammide/Bis (40%, rapporto 29:1)</td><td>BIO-RAD</td><td>#1610147</td><td>Soluzione di acrilammide/bis-acrilammide al 40%, 29:1 (3,3% reticolante) per colata di gel di poliacrilammide</td></tr><tr><td>&Auml; Sistema KTA FPLC</td><td>GE Healthcare Life Sciences /</td> <td>Cytiva-utilizzando</td> <td>il sistema FPLC di GE Healthcare; esistono diverse versioni personalizzate; questo lavoro ha utilizzato il "&Auml; Sistema "KTA pure"</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC901024</td><td>filtri centrali per l'arricchimento delle proteine; 10 kDa filtro di massa molecolare; 15 mL</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa</td><td>MERCK</td><td>UFC801024</td><td>filtri centrali per l'arricchimento delle proteine; 10 kDa filtro di massa molecolare; 4 mL</td></tr><tr><td>di solfato di ammonio in polvere</td><td>MERCK</td><td>A4418</td><td>solfato di ammonio per la biologia molecolare, &ge; 99,0%</td></tr> <tr><td>di grado di reagente di persulgrasso di ammonio, 98%</td> <td>di</td> catalizzatore <td>MERCK 215589</td><td>per la polimerizzazione di gel di acrilammide.</td></tr><tr><td>Coomassie Blu brillante R 250</td><td>MERCK</td><td>1125530025</td><td>Coomassie Blu brillante R 250 (C.I. 42660) per elettroforesi Marchio di fabbrica di Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g/l, H2O, 25 gradi; C)</td></tr><tr><td>Tubi per dialisi, membrana in cellulosa</td>, <td>MERCK</td><td>D9277,</td><td>membrane in cellulosa per la sostituzione di tamponi tramite dialisi.</td></tr><tr><td>Provette Eppendof 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>525-1042</td><td>provette per microcentrifuga; autoclavate</td></tr><tr><td>HiLoad 26/600 Superdex 75 pg</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>28989334</td><td>Le colonne preimpaccate HiLoad Superdex 75 pg sono per la cromatografia ad esclusione dimensionale ad alta risoluzione di proteine ricombinanti</td></tr><tr><td>Membrana PVDF Immun-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>#1620177</td><td>Le membrane in PVDF sono membrane di blotting proteico ottimizzate per applicazioni fluorescenti e multiplex.</td></tr><tr><td>Cella di trasferimento elettroforetica Mini Trans-Blot</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703930</td><td>Utilizzare la cella Mini Trans-Blot per la rimozione rapida di gel prefabbricati e fusi a mano Mini-PROTEAN.</td></tr><tr><td>Cella di elettroforesi verticale Tetra Mini-PROTEAN per mini gel prefabbricati</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>sistema di elettroforesi verticale a 4 gel, include gruppo elettrodo, modulo di corsa compagno, serbatoio, coperchio con cavi di alimentazione, diga tampone per mini celle.</td></tr><tr><td>Le colonne Mono Q 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516701</td><td>Mono Q sono colonne per cromatografia a scambio anionico forte per l'analisi delle proteine o per la lucidatura su piccola scala e ad alta risoluzione delle proteine.</td></tr><tr><td>Le colonne Mono S 10/100 GL</td><td>GE Healthcare Life Sciences / Cytiva</td><td>17516901</td><td>Mono S sono colonne cromatografiche a scambio cationico per l'analisi delle proteine o la lucidatura ad alta risoluzione su piccola scala delle proteine.</td></tr><tr><td>PageRuler Scala di proteine prestainate, da 10 a 180 kDa</td><td>Thermo-Fischer</td><td>26616</td><td>Una miscela di 10 proteine colorate di blu, arancione e verde (da 10 a 180 kDa) da utilizzare come standard dimensionale nell'elettroforesi delle proteine (SDS-PAGE) e nel western blotting.</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCA</td><td>Thermo-Fischer</td><td>23225</td><td>Un test proteico bicomponente, ad alta precisione e compatibile con i detergenti, per la determinazione della concentrazione proteica.</td></tr><tr><td>Sonificatore 250; Disgregatore cellulare ad ultrasuoni con convertitore</td><td>Branson-Nuovi</td><td></td> <td>modelli presso https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf</td></tr><tr><td>Suino Anti-coniglio Immunoglobuline/HRP (isolate per affinità)</td><td>Agilent Dako</td><td>P0399</td><td>L'anticorpo utilizzato per la coniugazione della perossidasi di rafano reagisce con le immunoglobuline di coniglio di tutte le classi.</td></tr><tr><td>TEMED, 1,2-Bis(dimetilammino)etano, TMEDA</td><td>MERCK</td><td>T9281</td><td>TEMED (N,N,N&prime;,N&prime;-Tetrametiletilendiammina) è una molecola che consente una rapida polimerizzazione di gel di poliacrilammide.</td></tr><tr><td>Rullo per tubi</td><td>-</td><td>-</td><td>Un rullo rotatore per tubi generale; ad esempio un nuovo modello a https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71</td></tr><tr><td>Rotatore per tubi</td><td>-</td><td>-</td><td>Una ruota rotatrice per tubi generale; ad esempio un nuovo modello a https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123</td></tr><tr><td>ULTRA-TURRAX; T 25 digital</td><td>IKA</td><td>0003725000</td><td>Nuovi modelli in https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/</td></tr></tbody></table>

estrazione e purificazione della proteina fahd1 dal rene suino e dal fegato di topo

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

La proteina 1 contenente dominio fumarilacetato idrolasi (FAHD1) è il primo membro identificato della superfamiglia FAH negli eucarioti, che agisce come ossalacetato decarbossilasi nei mitocondri. Questo articolo presenta una serie di metodi per l'estrazione e la purificazione di FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi coperti sono la cromatografia a scambio ionico con cromatografia liquida proteica veloce (FPLC), la filtrazione preparativa e analitica del gel con FPLC e gli approcci proteomici. Dopo l'estrazione totale delle proteine, sono state esplorate la precipitazione del solfato di ammonio e la cromatografia a scambio ionico e FAHD1 è stato estratto tramite una strategia sequenziale utilizzando lo scambio ionico e la cromatografia ad esclusione dimensionale. Questo approccio rappresentativo può essere adattato ad altre proteine di interesse (espresse a livelli significativi) e modificato per altri tessuti. Le proteine purificate dai tessuti possono supportare lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e/o inibitori farmacologici potenti e specifici.

La proteina FAHD1 è stata estratta dal rene suino e dal fegato di topo utilizzando il protocollo presentato. Per il tessuto di topo, sono necessari più organi per ottenere diversi μg dopo la fase finale di purificazione. Per questo motivo, questo articolo si concentra sull'estrazione di FAHD1 dai reni suini, che è un esperimento molto più esemplare. L'estrazione di FAHD1 dal fegato di topo viene eseguita per presentare le difficoltà e le possibili insidie di questo protocollo. Si raccomanda generalmente di utilizzare org...

Questo protocollo descrive come estrarre la proteina 1 contenente dominio della fumarilacetoacetato idrolasi (FAHD1) dal rene suino e dal fegato di topo. I metodi elencati possono essere adattati ad altre proteine di interesse e modificati per altri tessuti.

Estrazione e purificazione della proteina FAHD1 dal rene suino e dal fegato di topo

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

La purificazione delle proteine ricombinanti dai batteri è un metodo ben consolidato. Tuttavia, possono verificarsi diversi problemi durante l'utilizzo di queste tecniche. Avere metodi per estrarre proteine dai tessuti è sicuramente attraente.Il vantaggio principale di questo metodo è che si può estrarre la proteina nella sua forma fisiologica, compresi tutti gli effetti reciproci che possono influire sul suo ripiegamento e sull'attività catalitica. Questo approccio può essere adattato ad altre proteine di interesse e modificato per altri tessuti. Le proteine purificate dai tessuti possono supportare lo sviluppo di anticorpi di alta qualità e inibitori farmacologici.Per iniziare, preparare il tampone di lisi proteica mescolando 250 millilitri di PBS con 50 millimolari fluoruro di sodio, un fluoruro di fenilmetilsulfonil millimolare, due microgrammi per millilitro aprotinina e un ortovanadato attivato millimolare. Filtrare la soluzione utilizzando un'unità filtrante a siringa da 0,22 micrometri. Preparare i tubi con due millilitri di tampone di lisi per grammo di tessuto e metterli sul ghiaccio.Per preparare il campione di tessuto, sezionare il tessuto di circa 100 milligrammi ciascuno su una lastra di vetro pre-pulita posta sul ghiaccio in una scatola di polistirene espanso. Trasferire i pezzi di tessuto nei tubi preparati per la successiva lisi. Per preparare una soluzione satura di solfato di ammonio, riscaldare 500 millilitri di acqua doppia distillata a 70 gradi Celsius.Mentre si mescola, aggiungere gradualmente solfato di ammonio in polvere fino a quando non si scioglie più solfato di ammonio. Raffreddare questa soluzione satura a temperatura ambiente e conservarla a quattro gradi Celsius durante la notte. Per omogeneizzare i tessuti renali suini, sonicare la sospensione preferibilmente con una sonda ad ultrasuoni mantenendo il campione sul ghiaccio.Nel caso di tessuti epatici di topo, utilizzare un omogeneizzatore elettrico e lavarlo regolarmente in PBS per evitare l'intasamento mantenendo i campioni sul ghiaccio. Prelevare 20 microlitri dai campioni e verificare al microscopio se le cellule del tessuto omogeneizzato sono correttamente distrutte. Altrimenti, ripeti l'omogeneizzazione.Centrifugare i tubi a 10.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il surnatante in un tubo fresco e metterlo sul ghiaccio. Successivamente filtrare il surnatante utilizzando unità filtranti a siringa da 0,45 micrometri e 0,22 micrometri.Aliquotare il surnatante in lotti da 10 millilitri e congelarli a meno 20 gradi Celsius per la conservazione a breve termine o a meno 80 gradi Celsius per una conservazione più lunga. Preparare un campione di 50 microlitri per l'analisi SDS-PAGE o Western blot aggiungendo 10 microlitri di cinque volte il buffer del campione SDS a 40 microlitri del surnatante e quindi bollendo a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Preparare un gel discontinuo al 12,5% di poliacrilammide SDS-PAGE secondo le istruzioni del produttore.Per eseguire l'analisi SDS-PAGE, caricare successivamente i pozzetti del gel con una scala marcatore proteica, cinque nanogrammi di proteina ricombinante FAHD1 umana come controllo positivo, 20 microlitri del campione da analizzare e i restanti pozzetti con 20 microlitri di tampone campione SDS-PAGE preparato. Eseguire i gel SDS-PAGE a 125 volt utilizzando il buffer di funzionamento SDS. Dopo aver completato SDS-PAGE, eseguire un'analisi Western blot, sondare le membrane utilizzando l'anticorpo disponibile sollevato contro FAHD1.Dopo aver preparato aliquote surnanti come descritto in precedenza, procedere dopo lo scongelamento o processo direttamente dopo l'estrazione delle proteine senza congelare il campione. Filtrare il campione utilizzando un'unità filtrante da 0,22 micrometri per escludere possibili precipitati dopo lo scongelamento. Preparare sei tubi da 1,5 millilitri su ghiaccio, quindi trasferire 250 microlitri di campione in ciascun tubo.Preparare una serie di diluizione di solfato di ammonio nei tubi preparati e portare il volume finale a 1.000 microlitro con tampone di lisi proteica. Incubare i campioni a quattro gradi Celsius durante la notte su un rotatore valvolare. Utilizzando una centrifuga da tavolo, centrifugare a 10.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius e trasferire con cura tutti i supernatanti in tubi separati.Asciugare all'aria i pellet risultanti e risospestarne ciascuno in 1.000 microlitro di acqua doppia distillata. Per ogni coppia di pellet risospeso e surnatante del passaggio precedente, mescolare 40 microlitri con 10 microlitri di cinque volte il tampone del campione SDS e far bollire a 95 gradi Celsius con coperchi aperti fino a quando la maggior parte del liquido non si è vaporizzata. Quindi risospesare il pellet in una miscela di 50% di dimetilsolfossido in acqua doppia distillata.Eseguire SDS-PAGE caricando i campioni derivati dal pellet risospeso e dal surnatante in coppia, seguiti da un'analisi Western blot. Tuttavia, eseguire i gel a 80 volt per tre ore. Impostare il sistema FPLC con la colonna di scambio anionico o cationico.Lavare la colonna con cinque volumi di colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione, seguita da cinque volumi di colonna di acqua a doppia distillazione. Applicare il campione sulla colonna mediante iniezione o utilizzando una pompa campione e raccogliere il flusso attraverso. Lavare la colonna con un volume di colonna del buffer a basso contenuto di sale.Impostare un'eluizione a gradiente lineare dal tampone salino basso al 100% al tampone salino alto 100% all'interno di tre volumi di colonna. Raccogliere continuamente frazioni di un millilitro. Al termine del gradiente, continuare a funzionare con un tampone salino elevato fino a quando non vengono rilevati più picchi associati alle proteine nel cromatogramma nell'intervallo di un volume di colonna.Applicare un millilitro di 25% SDS disciolto in idrossido di sodio molare 0,5 e acqua doppia distillata per pulire la colonna. Lavare consecutivamente la colonna con tre volumi a colonna di acqua doppia distillata e tre volumi a colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione. Raccogliere i campioni SDS-PAGE di tutte le frazioni di picco e il flusso attraverso.Snap congelare le frazioni raccolte in azoto liquido e conservarle a meno 80 gradi Celsius. Dopo averli sondati tramite Western blot, scongelare e raggruppare le frazioni contenenti le proteine di interesse e scartare le altre. Per eseguire la fase di purificazione, ridurre il volume della soluzione proteica fino a due millilitri utilizzando unità filtranti ultra centrifugazione.Filtrare sequenzialmente la soluzione con unità filtranti a siringa da 0,45 micrometri e 0,22 micrometri per rimuovere qualsiasi microprecipitazione. Equilibrare la colonna di cromatografia di esclusione dimensionale con un volume di colonna di buffer in esecuzione contenente un ditiotreitolo millimolare. Caricare il campione sulla colonna ed eseguire l'unità di cromatografia fino a quando tutte le proteine sono eluite come descritto in precedenza.Preparare 50 campioni di microlitro per l'analisi SDS-PAGE e Western blot descritta in precedenza. Lavare consecutivamente la colonna con un volume di colonna di acqua doppia distillata e un volume di colonna di etanolo al 20% in acqua a doppia distillazione. Dopo aver eseguito l'analisi Western blot, raggruppare tutte le frazioni contenenti FAHD1.Ridurre il volume della soluzione proteica a due millilitri utilizzando unità filtranti ultra centrifugazione. Lo screening Western blot mostra la presenza di FAHD1 suino nel surnatante con una banda a 25 kilodalton mentre il controllo positivo taggato corre a 34 kilodalton. Il fahd1 suino dal lisato è stato purificato mediante cromatografia a scambio anionico e le proteine leganti sono state rimosse mediante eluizione.Le frazioni contenenti FAHD1 suino sono state identificate mediante analisi Western blot, raggruppate e concentrate. I campioni di proteine sono stati purificati dalla SEC e identificati dall'analisi Western blot. La resa della proteina FAHD1 suina era di circa un milligrammo con un livello di purezza dell'80%.L'analisi Western blot ha rilevato la proteina FAHD1 del topo nel flusso attraverso insieme ad altre proteine. Il flow-through è stato applicato per la cromatografia di esclusione dimensionale. Le frazioni contenenti FAHD1 sono state raggruppate, concentrate e applicate all'analisi SDS-PAGE.Tuttavia, la resa delle proteine non era molto alta. L'attività enzimatica specifica del suino FAHD1 aumenta con il livello di purezza aumentando la quantità relativa di FAHD1 per proteina totale. Concentrazioni più elevate di solfato di ammonio causano l'effetto sorriso, che può essere risolto a una tensione inferiore.Ulteriori proteine sono state trovate nel lisato e nel surnatante alla concentrazione del 15%. Tuttavia, a concentrazioni più elevate, i campioni possono precipitare e non possono essere rilevati. Il protocollo qui presentato richiede che la proteina sia risolvibile.Le condizioni ottimali per la precipitazione e la regolazione del pH o delle dimensioni per la cromatografia devono essere testate e definite. Lo studio della funzione enzimatica, lo studio della struttura proteica e lo sviluppo di anticorpi sono notevolmente supportati quando si hanno proteine estratte dai tessuti piuttosto che estratte dai batteri.

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