Isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo per saggi respirometrici

Questa parola descrive l'analisi della respirazione nell'elaborazione dei mitocondri dal muscolo scheletrico del topo. Questo protocollo riduce notevolmente i tempi di purificazione e consente di elaborare più campioni contemporaneamente. I mitocondri di animali di qualsiasi ottavo sesso di origine unita possono essere mutilati utilizzando questo protocollo che consente lo studio della respirazione in un'ampia varietà di condizioni sperimentali.

Questo metodo è adatto a tutte le aree di ricerca in cui la funzione dei mitocondri è rilevante, tra cui l'invecchiamento, i test antidroga, il cancro o lo sviluppo. Può anche essere adattato ad altri tessuti e organismi. Assicurarsi che tutti i materiali siano freddi posizionando tutto sul ghiaccio durante la procedura per proteggere i mitocondri dai danni.

Posizionare tre becher da 50 millilitri per campione sul ghiaccio e aggiungere 10 millilitri di PBS nel becher uno, 10 millilitri di 10 millimolari EDTA PBS nel becher due e quattro millilitri IB1 nel becher tre. Spruzzare l'arto posteriore destro di un topo eutanasizzato con etanolo al 70% per evitare che la pelliccia si spargi e fissare l'arto al pannello di dissezione del sughero, quindi nastro adesivo all'arto anteriore sinistro. Fai un'incisione con un bisturi monouso sterile attraverso la pelle dal ginocchio ai piedi.

Afferrare la pelle con una pinza dentata all'altezza della caviglia e tagliarla con forbici sottili intorno alla caviglia. Allontana la pelle dalla muscolatura sottostante con una pinzetta a punta fine in una mano mentre la tiri su con una pinza dentata nell'altra mano. Sezionare tutti i muscoli scheletrici dalla caviglia al ginocchio e rimuovere tutto il tessuto connettivo sul muscolo tibiale anteriore usando pinzette e forbici fini.

Trova i quattro tendini distali del muscolo estensore digitorum longus e sezionali vicino alle loro inserzioni nelle dita dei piedi. Individuare il tendine distale anteriore tibiale e tagliarlo vicino al suo inserimento sotto la caviglia. Tirare i tendini tibiali anteriori ed estensori digitorum longus sopra la caviglia per liberare le estremità sciolte.

Afferrare le estremità sciolte dei tendini e facilitare i muscoli lontano dal resto della muscolatura nelle ossa tirandoli su. Tagliare i tendini prossimali di questi muscoli il più vicino possibile alla rotula. Capovolgere il mouse per procedere con l'estrazione del muscolo gastrocnemio e soleo.

Afferrare la tasca formata tra i bicipiti, il femore e il gastrocnemio e separare questi muscoli usando forbici fini per visualizzare il tendine gastrocnemio prossimale. Afferrare e tagliare con cura il tendine di Achille distale con forbici fini. Tagliare il tendine gastrocnemio prossimale liberandolo con il soleo sottostante.

Sezionare attentamente i muscoli rimanenti e ri-bloccare il mouse nella posizione iniziale per sezionare il muscolo quadricipite. Scartare il tessuto adiposo, quindi inserire una pinzetta fine tra il quadricipite e il femore per separare il muscolo dall'osso. Afferrare i tendini muscolari del quadricipite distale e tagliare il tendine il più vicino possibile alla rotula.

Tirare su i quadricipiti e liberarli con forbici sottili all'inserimento prossimale. Ripeti lo stesso per l'arto posteriore sinistro. Risciacquare tutti i muscoli nel becher uno, poi due, seguito dal becher tre.

Infine, tritare tutti i muscoli nel becher tre con forbici affilate sul ghiaccio. Trasferire la sospensione su un tubo C, chiuderla ermeticamente e fissarla a testa in giù sulla manica dell'omogeneizzatore. Dividere l'omogeneizzato in due tubi microcentrifughati pre-refrigerati da 2 millilitri e centrifugare per 10 minuti.

Quindi trasferire il surnatante in nuovi tubi pre-refrigerati e centrifugare per altri 10 minuti. Combina il pellet in 500 microlitri di IB2 Trasferisci il surnatante in un nuovo tubo microcentriflato pre-refrigerato da 2 millilitri ed etichettalo come surnatante numero due, o SN2. Sospendere nuovamente il pellet mitocondriale finale in 200 microlitri di tampone di sospensione.

Mettere rapidamente da parte 10 microlitri per la quantificazione delle proteine e aggiungere immediatamente 10 microlitri di 10% FFA BSA alla sospensione mitocondriale rimanente per prevenire danni. Centrifugare la sospensione mitocondriale concentrata a 10, 500 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Sospendere nuovamente il pellet mitocondriale in 100 microlitri di 1X coupling assay medium con BSA, 1X electron flow assay medium con BSA, o 1X beta oxidation medium with BSA, a seconda del protocollo da eseguire.

Diluire questo campione mitocondriale concentrato a 0,2 microgrammi per microlitro utilizzando il mezzo di saggio corrispondente. Semina 50 microlitri della sospensione per pozzetto in una micro piastra pre-refrigerata da 24 pozzetti su ghiaccio. Nei pozzetti di correzione dello sfondo, aggiungere solo il mezzo di analisi corrispondente.

Conservare la sospensione mitocondriale rimanente a meno 80 gradi Celsius per la determinazione della purezza della frammentazione. Girare la micro piastra nella centrifuga preparativa pre-refrigerata per 20 minuti. Nel frattempo, riscaldare il mezzo di saggio rimanente a 37 gradi Celsius.

Dopo la centrifugazione, lasciare la micro piastra sul banco per cinque minuti per equilibrare. Aggiungere 450 microlitri del mezzo di saggio caldo per pozzo lentamente e con attenzione per evitare il distacco dei mitocondri. Posizionare immediatamente la micro piastra nello strumento di misurazione del consumo di ossigeno senza coperchio e avviare il programma di misurazione.

Assicurarsi che il primo passo sia un'incubazione di 10 minuti per consentire alla micro piastra di riscaldarsi. Una volta terminato l'esperimento, rimuovere la cartuccia e la micro piastra, spegnere lo strumento e avviare l'analisi. I profili proteici generali delle diverse frazioni ottenute attraverso centrifugazioni seriali hanno mostrato popolazioni proteiche distinte nelle frazioni isolate.

La presenza di tutto il contenuto mitocondriale è evidente dai forti segnali per i marcatori della membrana mitocondriale esterna e interna e delle proteine associate ai nucleoidi. La frazione N rappresenta nuclei e materiale indisturbato. La maggior parte dei marcatori del reticolo endoplasmatico, della membrana plasmatica o del citoplasma nelle frazioni SN1 o SN2 evidenziano l'elevata purezza ottenuta durante l'isolamento.

Un aumento del consumo di ossigeno è stato osservato dopo l'aggiunta di ADP nei saggi di accoppiamento e beta ossidazione. Dopo l'aggiunta di cianuro di carbonile-p-trifluorometiossi fenilidrata, il consumo di ossigeno ha raggiunto il suo livello più alto. Un basso rapporto di controllo respiratorio garantisce l'integrità dei mitocondri isolati.

Il saggio del flusso di elettroni ha esaminato l'attività dei complessi della catena di trasporto degli elettroni singolarmente o in combinazione attraverso l'iniezione di substrati e inibitori specifici. I mitocondri isolanti sono estremamente sensibili. Quindi tutti i passaggi dopo la mitigazione dei tessuti devono essere eseguiti diligentemente e con attenzione per preservare la loro vitalità.

I saggi sperimentali possono essere completati con un'analisi sematica deterministica di molecole chiave dei mitocondri o con lo studio dell'assemblaggio di complessi respirometrici utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide nativa blu.