Quantificazione di specie reattive dell'ossigeno utilizzando la sonda di diacetato di 2′,7′-diclorofluoresceina e la citometria a flusso nelle cellule gliali di Müller
13 maggio 2022
Qui, proponiamo un protocollo sistematizzato, accessibile e riproducibile per rilevare le specie reattive dell'ossigeno cellulare (ROS) utilizzando la sonda di diacetato 2′,7′-diclorofluoresceina (DCFH-DA) nelle cellule gliali di Müller (MMC). Questo metodo quantifica i livelli totali di ROS cellulare con un citometro a flusso. Questo protocollo è molto facile da usare, adatto e riproducibile.
Esistono diversi metodi per misurare la produzione di ROS o lo stress ossidativo nelle cellule. Tra queste, la sonda 2'7'diclorofluoresceina diacetato è una delle tecniche più utilizzate per misurare direttamente lo stato redox. Questa sonda è lipofila e non fluorescente. La diffusione di questa sonda attraverso la membrana cellulare consente alle esterasi intracellulari di scindersi ai due legami estere, producendo un prodotto relativamente polare e impermeabile alla membrana cellulare. Queste molecole non fluorescenti si accumulano intracellulari e la successiva ossidazione da parte dei ROS produce il prodotto altamente fluorescente diclorofluoresceina. L'ossidazione della sonda è il prodotto dell'azione di più tipi di ROS. Che può essere rilevato mediante citometria a flusso o microscopia confocale. In questo articolo, abbiamo utilizzato una sonda di diacetato di diclorofluoresceina per misurare e quantificare ROS mediante citometria a flusso. Trasferire le piastre a 6 pozzetti in una cappa a flusso laminare dall'incubatore. Aspirare il surnatante. E lavare le cellule una volta con PBS. Aggiungere 2 ml di DMEM sierico basso per pozzetto. E incubare la piastra a 6 pozzetti per due ore nell'incubatrice. Trattare le cellule con l'antiossidante per sei ore. Trattare le cellule con l'induttore ROS, A o B, per 30 minuti. Aspirare il surnatante. E lavare la cellula tre volte con PBS per rimuovere tutti gli stimoli. Spegni la luce della cappa a flusso laminare e lavora al buio. Aggiungere 1 mL di sonda diclorofluoresceina diacetato in DMEM senza rosso fenolo. Aggiungere 1 mL di DMEM senza rosso fenolo alle celle di controllo dell'autofluorescenza di controllo. Incubare la piastra a 6 pozzetti per 30 minuti nell'incubatrice. Trasferire le piastre sul ghiaccio in laboratorio. Lavare le cellule tre volte con 2 ml di PBS freddo per pozzetto. Aggiungere 0,5 ml di tampone di distacco a freddo a ciascun pozzetto. Raccogliere le cellule tubando delicatamente su e giù usando una pipetta P1000. Raccoglieteli in un tubo da 1,5 ml etichettato. E centrifugarli a 600 x g per cinque minuti a 4 C.Scartare accuratamente il surnatante e dissociare delicatamente il pellet con la spillatura. Aggiungere 1 mL di tampone FACS per lavare le celle su ciascun tubo etichettato. Se necessario, utilizzare vortex nella più bassa intensità per la completa dissociazione del pellet. Centrifugarli a 600 x g per cinque minuti a 4 C.Ripetere questo passaggio due volte di più. Tre lavaggi in totale. Resuspend cell pellets in 200 L di tampone FACS. Dissociare delicatamente completamente il pellet in ogni tubo utilizzando vortex. E trasferire a 5 ml etichettati per provette citometriche a flusso. Tenere i tubi sul ghiaccio fino ad analizzarli sul citometro a flusso. Utilizzando il software di citometria a flusso, creare un nuovo esperimento. Fare clic sul campione e si aprirà un elenco di tubi. Fare doppio clic e rinominarli. Posizionare il tubo di controllo dell'autofluorescenza sul braccio dell'aspiratore, spostando attentamente la base solo a sinistra. Fare clic su Acquisisci dati, quindi su Registra dati e selezionare la condizione di arresto desiderata. Disegna un cancello attorno alle celle di interesse, escludendo cellule morte e detriti. Rimuovere il tubo. Fare clic su Tubo successivo ed eseguire il campione di controllo basale. Fare clic su Acquisisci dati e quindi in Registra dati.Aprire il software. Aggiungere gli esempi utilizzando il pulsante di azione Aggiungi campioni. Fare clic su Aggiungi campione.Selezionare la cartella Data sperimentale e fare clic su Scegli.Fare doppio clic sul primo campione nell'area di lavoro, in questo caso controllo di autofluorescenza. Disegna un cancello poligonale per isolare la cella di interesse, escludendo cellule morte e detriti. Cambia il grafico in un istogramma. Fare doppio clic all'interno della M
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Panoramica
Questo studio presenta un protocollo per la rilevazione dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) cellulari mediante l'uso della sonda 2′,7′-diclorofluoresceina diacetato (DCFH-DA) in cellule gliali di Müller (MGCs). Il metodo è stato progettato per essere accessibile, riproducibile e quantifica le ROS mediante citometria a flusso.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Stress ossidativo
- Neuroscienze
Sfondo
- Le specie reattive dell'ossigeno (ROS) svolgono un ruolo fondamentale in diversi processi cellulari.
- La misurazione delle ROS è essenziale per comprendere lo stress ossidativo nelle cellule.
- La sonda DCFH-DA è un metodo ampiamente utilizzato per rilevare le ROS.
- Il protocollo pone particolare enfasi sulla riproducibilità e sulla facilità d'uso.
Scopo dello studio
- Fornire un protocollo chiaro per la rilevazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule gliali di Müller.
- Permettere la quantificazione dello stress ossidativo nelle cellule neuronali.
- Facilitare la ricerca sul ruolo delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nella funzione gliale e nella neurobiologia.
Metodi Utilizzati
- È stata effettuata la coltura cellulare di cellule gliali di Müller per creare il modello biologico.
- Le cellule sono state trattate con antiossidanti e induttori di ROS per valutare i livelli di ROS.
- La sonda DCFH-DA è stata utilizzata per la rilevazione dei ROS e quantificata mediante citometria a flusso.
- I passaggi critici hanno incluso il lavaggio delle cellule con PBS e il controllo dell'esposizione alla luce durante i saggi.
Risultati principali
- Il protocollo ha misurato efficacemente i livelli cellulari di ROS nelle cellule gliali di Müller.
- La citometria a flusso ha fornito un'analisi quantitativa dell'accumulo di ROS.
- I risultati hanno confermato la fattibilità dell'uso della sonda DCFH-DA nelle condizioni specificate.
Conclusioni
- Questo studio stabilisce un metodo affidabile per valutare lo stress ossidativo nelle cellule gliali.
- Il protocollo semplifica la misurazione delle ROS, aumentando l'accessibilità per i ricercatori.
- I risultati hanno implicazioni per la comprensione dello stress ossidativo in neurobiologia e per l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Contenuto
La misurazione quantitativa delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule gliali di Müller mediante DCFH-DA e citometria a flusso consente una valutazione solida dei meccanismi dello stress ossidativo rilevanti nei modelli di malattie neurodegenerative e retiniche. Questa capacità supporta la validazione precoce degli obiettivi terapeutici e la riduzione del rischio meccanicistico nella modulazione delle vie antiossidanti. Una quantificazione affidabile dei ROS orienta le decisioni di portafoglio riguardo a molecole candidate mirate all'omeostasi redox in sistemi pertinenti alla malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Permette l'analisi dell'attivazione della via degli antiossidanti e della modulazione redox in modelli di cellule gliali.
- Supporta la validazione funzionale di bersagli coinvolti nello stress ossidativo e nei meccanismi di difesa cellulare.
- Fornisce una riduzione del rischio meccanicistica per interventi candidati che influenzano i livelli di ROS.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Semplifica la preparazione di sistemi cellulari validati per lo screening di composti in relazione a parametri di stress ossidativo.
- Fornisce letture quantitative standardizzate di ROS adatte alla riproducibilità del saggio e al confronto tra studi.
- Consente una valutazione affidabile degli effetti di composti antiossidanti o pro-ossidanti in un formato scalabile.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a modelli rilevanti per patologie retiniche che coinvolgono lo stress ossidativo, come la retinopatia diabetica.
- Permette una continuità traslazionale collegando la modulazione delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) in vitro a strategie precliniche di biomarcatori.
- Fornisce indicazioni per la valutazione del rischio nell' avanzamento di candidati antiossidanti basata su esiti cellulari quantitativi.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo flusso di lavoro per la quantificazione delle ROS si colloca nella fase iniziale della scoperta fino all'identificazione del composto attivo, supportando sia la verifica delle ipotesi sia l'integrazione con schermate successive.
- Biologia della Scoperta: Fornisce evidenze quantitative riguardo l'attivazione del percorso redox e la risposta cellulare agli stress ossidativi.
- Screening: Fornisce misurazioni riproducibili di ROS basate sulla citometria a flusso per il triage dei composti.
- Analisi: Permette il confronto statistico dei livelli di ROS tra diverse condizioni sperimentali utilizzando l'intensità media geometrica della fluorescenza.
- Ricerca Translazionale: Collega la modulazione dello stress ossidativo in vitro a endpoint rilevanti per le malattie in modelli retinici.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma standardizzata per il saggio di ROS adattabile a diversi tipi cellulari e agenti modulatori del redox.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella scoperta mirata ai processi redox e riduce l'ambiguità meccanicistica.
- Valore operativo: Fornisce una quantificazione standardizzata, scalabile e riproducibile delle specie reattive dell'ossigeno (ROS) per flussi di lavoro condivisi tra team diversi.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione (go/no-go) per modulatori delle vie antiossidanti e aumenta l'efficienza del capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati mirati ai meccanismi di stress ossidativo, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'uso della citometria a flusso e nell'analisi dei dati.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per citometria a flusso e a software di analisi compatibili.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di gating e di quantificazione della fluorescenza.
- Adattabile ad altri modelli cellulari mediante ottimizzazione del protocollo per il caricamento della sonda e dei controlli.
- Dipende da una gestione accurata dei campioni per ridurre al minimo la variabilità del saggio e gli artefatti indotti dalla luce.
