Somministrazione di farmaci a base di pompa osmotica per la ricerca sulla rimielinizzazione in vivo sul sistema nervoso centrale

La demielinizzazione avviene in più malattie del sistema nervoso centrale. Una tecnica affidabile di somministrazione di farmaci in vivo è necessaria per i test antidroga rimielinizzanti. Questo protocollo descrive un metodo basato su pompa osmotica che consente la somministrazione di farmaci a lungo termine direttamente nel parenchima cerebrale e migliora la biodisponibilità del farmaco, con ampia applicazione nella ricerca sulla rimielinizzazione.

La pompa osmotica è di grande valore per la ricerca della rigenerazione della mielina, in particolare per quei farmaci con una breve emivita, scarsa permeabilità alla barriera emato-encefalica e di vari effetti collaterali periferici. La pompa osmotica può bypassare la barriera emato-encefalica e fornire farmaci direttamente al corpo calloso, il che migliora efficacemente la biodisponibilità dei farmaci, specialmente per alcuni farmaci con una breve emivita. Per iniziare, fissare la testa di un mouse anestetizzato nell'apparato stereotassico con una barra dei denti e barre auricolari.

Coprire il corpo animale ad eccezione del sito chirurgico. Usando un bisturi, fai un'incisione mediosagittale lunga un centimetro della pelle dalla base del collo a tra gli occhi per esporre il cranio. Utilizzando un batuffolo di cotone contenente il 30% di perossido di idrogeno, pulire delicatamente la superficie del cranio per visualizzare le strutture craniche.

Regolare l'altezza della barra dei denti e delle barre auricolari per posizionare il punto lambda e il punto bregma alla stessa altezza. Posizionare delicatamente la punta di un ago da 10 microliti e una siringa calibro 33 nel punto bregma e azzerare le coordinate X, Y e Z. Spostare la siringa nel sito di iniezione.

Praticare lentamente un piccolo foro di bava attraverso il cranio nel sito di iniezione senza penetrare nella dura con un microlitro calibro 26 e un ago per siringa da 0,45 millimetri. Inserire lentamente l'ago della siringa del microlitro nel tessuto cerebrale attraverso il foro fino a raggiungere una certa profondità. Iniettare 1,5 microlitri di 1% di linfosolecitina ad una velocità di 0,5 microlitri al minuto.

Attendere cinque minuti prima di estrarre la siringa e cucire la pelle con suture chirurgiche 5-0. Posizionare il topo che ha subito un intervento chirurgico da solo in una gabbia e monitorare il topo ogni giorno dopo l'operazione. Attaccare tre distanziatori di regolazione della profondità all'ago della cannula per infusione cerebrale con adesivo tissutale per ottenere una profondità di iniezione di 1,5 millimetri che è vicina al calloso.

Riempire la pompa osmotica collegando l'ago della siringa con un pacchetto di pompa a una siringa da un millilitro e aspirare il farmaco. Tenere la pompa in posizione verticale. Inserire la siringa nell'apertura nella parte superiore della pompa e iniettare lentamente il farmaco senza creare una bolla d'aria.

Estrarre lentamente la siringa mentre il liquido fuoriesce dall'apertura. Usando forbici o pinze, rimuovere la flangia bianca dal regolatore di flusso. Inserire il moderatore di flusso nella pompa.

Per determinare se ci sono bolle nella pompa osmotica, pesare la pompa osmotica separatamente, prima e dopo il riempimento. Tagliare il catetere alla lunghezza richiesta in base alle dimensioni dell'animale. Attaccare il catetere alla cannula dell'infusione cerebrale.

Riempire il catetere con farmaci usando la siringa senza introdurre aria. Collegare il catetere al moderatore di flusso in modo che copra circa quattro millimetri del moderatore di flusso esposto. Immergere le pompe riempite in soluzione salina sterile allo 0,9% o PBS a 37 gradi Celsius per almeno quattro-sei ore.

Preferisci estendere durante la notte dopo l'implementazione. Fissare nuovamente i mouse sull'apparato stereotassico. Aprire l'incisione chirurgica precedentemente cucita ed espandere l'incisione fino alle scapole.

Separare la pelle dal tessuto connettivo sottocutaneo alla scapola, usando pinze emostatiche o pinzette per aprire una cavità e posizionare la pompa osmotica nella cavità. Con un batuffolo di cotone, pulire delicatamente ed esporre il foro del perno sulla superficie del cranio creato quando si stabilisce il modello di demielinizzazione. Inserire la cannula per infusione cerebrale attraverso il foro stenopeico perpendicolarmente e fissarla sul cranio con adesivo tissutale.

Togliere la linguetta rimovibile sopra la cannula per infusione cerebrale con un paio di forbici. Cucire l'incisione o attaccarla con adesivo tissutale. Metti l'animale in una gabbia da solo dopo l'intervento chirurgico.

Dopo aver eseguito l'implementazione, la colorazione DAPI ha rivelato che il foro stenopeico nel tessuto cerebrale si trova appena sopra la sostanza bianca, indicando un'implementazione riuscita della cannula per infusione cerebrale della pompa osmotica. L'esperimento di ibridazione in situ è stato eseguito con un marcatore oligodendrocitario maturo LA SONDA MAG è stata utilizzata per etichettare oligodendrociti appena differenziati. I risultati hanno mostrato che il trattamento UM206 ha prodotto più cellule MAG positive nella regione demielinizzata rispetto al gruppo di controllo.

La microscopia elettronica a trasmissione della regione demielinizzata ha mostrato che il numero di assoni mielinizzati era aumentato nel gruppo di trattamento UM206 rispetto al gruppo di controllo, suggerendo che UM206 induceva un livello più elevato di ri-mielinizzazione. Quando si prepara la pompa osmotica, fare attenzione a non introdurre alcuna bolla nel sistema.