Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi
21 gennaio 2022
La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi comporta comunemente l'accesso attraverso le ossa del cranio ed è guidata da punti di riferimento del cranio. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo per colpire il tronco cerebrale caudale e il midollo spinale cervicale superiore attraverso la cisterna magna che si basa sulla visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale.
Questo protocollo fornisce linee guida passo-passo per una via di accesso riproducibile alle regioni di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. Questa tecnica aumenta la precisione quando si erogano piccoli volumi di iniezione a regioni ristrette di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. Questa tecnica è stata e può essere applicata ad altri modelli animali.
Il Dr.Veronique VanderHorst, professore associato di neurologia e ricercatore principale del VanderHorst Laboratory, dimostrerà questa procedura. Assicurarsi che il flusso di ossigeno sia diretto al cono del naso. Spostare il mouse sulla cornice stereotassica e posizionare il naso in un cono nasale flessibile.
Posizionare il mouse nella cornice stereotassica utilizzando solo le barre auricolari. Posizionare il lubrificante sugli occhi. Anteroflex la testa del mouse ad un angolo di 90 gradi guidando manualmente il naso.
Per fissare questa posizione, posizionare una barriera di plastica tra i montanti della barra auricolare dell'adattatore del mouse parallela ai pilastri con la parte piatta del cranio che funge da riferimento. Posizionare la piastra riscaldante sotto il mouse e assicurarsi che il collo e il resto del corpo siano posizionati parallelamente al tavolo sollevando il corpo con una piccola scatola. Posiziona un drappo sotto il corpo.
Iniettare una singola dose di quattro milligrammi per chilogrammo Meloxicam a rilascio lento per via sottocutanea ad un volume di due microlitri per grammo di peso corporeo. Pulire prima il sito di incisione chirurgica con un tampone di preparazione all'alcol al 70%, poi con un tampone di preparazione alla betaina e poi di nuovo con un tampone per la preparazione dell'alcol e lasciarlo asciugare. Disinfettare le mani e indossare guanti sterili, quindi posizionare un drappo nel sito chirurgico.
Assicurarsi che il mouse sia opportunamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi o controllando il riflesso corneale. Ridurre l'isoflurano per mantenere i livelli a 2.0. Fai un'incisione da uno a 1,2 centimetri con una lama chirurgica da 10 dal bordo dell'osso occipitale verso le spalle in un movimento regolare.
Fai con attenzione un'incisione nel rafe della linea mediana del muscolo trapezio, esponendo i muscoli della capite longus accoppiati. Posizionare entrambi i ganci di riavvolgimento tra i muscoli longus capitis accoppiati, uno orientato a sinistra e l'altro a destra. Utilizzare la pinza di laminectomia smussata per separare la pance sinistra e destra del muscolo longus capitis accoppiato, a partire dall'occipite dove la linea mediana è facilmente visibile.
Guida la pinza smussata attraverso l'osso dell'occipite nella linea mediana fino a dove incontra la dura madre cisternale e poi continua attraverso la dura madre fino all'atlante. Riposizionare i riavvolgitori e regolare la tensione riposizionando gli emostati. Utilizzare la pinza per laminectomia smussata per separare ulteriormente i muscoli nella linea mediana per ottenere una buona visione del tronco cerebrale e del cervelletto.
Ripetere la procedura di cui sopra, se necessario, fino a quando il cervelletto e il tronco cerebrale appaiono sotto la dura. Usando una pinza per laminectomia smussata, liberare la dura dei piccoli filamenti di tessuto connettivo spostando la pinza dalla linea mediana in direzione laterale fino a quando non vi è una chiara visione del tronco cerebrale, creando più spazio laterale. Visualizza la superficie dorsale del tronco cerebrale con punti di riferimento dettagliati attraverso la dura aperta.
Utilizzare la pinza angolata per afferrare la dura che si estende dall'osso occipitale all'atlante, quindi utilizzare le forbici a molla per creare una piccola apertura di circa 0,5-1,5 millimetri nella dura. Una volta aperta la dura, drenare il liquido cerebrospinale in eccesso con una punta Q sterile. L'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel quarto ventricolo, è il punto zero standard anteriore-posteriore e mediolaterale.
Posizionare la pipetta o la siringa sul bersaglio utilizzando il braccio stereotassico. Abbassare il braccio della dorsale sulla superficie dorsale che si forma dal punto zero dorsoventrale. Quindi abbassare la pipetta sul tronco cerebrale e iniettare la soluzione.
Lasciare l'ago in posizione da uno a cinque minuti dopo l'iniezione per evitare una traccia dell'ago quando si utilizzano volumi compresi tra tre e 50 nanolitri. Quindi sollevare la pipetta o la siringa usando il braccio stereotassico e ripetere questo per più bersagli. Rimuovere i ganci con attenzione dal campo chirurgico.
I muscoli longus capitis accoppiati ricadranno in una posizione neutra coprendo completamente la cisterna magna. Non chiudere il muscolo trapezio e la dura madre nella linea mediana in quanto sono troppo fragili per contenere le suture. Chiudere la pelle con 3 suture in nylon o polipropilene.
L'approccio cisterna magna consente di colpire il tronco cerebrale caudale e le strutture del cordone cervicale superiore che sono altrimenti difficili da raggiungere tramite approcci stereotassici standard o sono inclini a targeting incoerente. Nei topi, strutture come il nucleo ipoglosso, il gruppo respiratorio ventrale e la formazione reticolare adiacente nel tronco cerebrale caudale sono state regolarmente prese di mira utilizzando l'approccio cisterna magna come illustrato qui per il nucleo ipoglosso e il midollo ventromediale. Al fine di determinare l'accuratezza dell'approccio cisterna magna rispetto all'approccio standard, è stata misurata la distanza tra i siti bersaglio previsti ed effettivi nei piani anteroposteriore, mediolaterale e dorsoventrale per le regioni ventrale e dorsale.
I risultati mostrano errori significativamente più piccoli nei piani anteroposterior, mediolaterale e dorsoventrale rispetto all'approccio standard, evidenziando la maggiore precisione dell'approccio cisterna magna per questi obiettivi. Quando si tenta questo protocollo, è fondamentale assicurarsi che l'anteroflessione della testa e l'elevazione del corpo vengano eseguite come descritto. Successivamente, è importante riconoscere i punti di riferimento chiave prima di manipolare il muscolo o la dura madre.
Se questi punti di riferimento non vengono riconosciuti o se vengono persi, sarà difficile rimanere orientati ed eseguire la procedura come previsto. Questa tecnica ha aiutato ad affrontare questioni concettuali relative all'organizzazione anatomica funzionale all'interno del tronco cerebrale caudale e del cordone cervicale superiore.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura chirurgica stereotassica per accedere al tronco encefalico caudale e al midollo spinale cervicale superiore nei topi attraverso la cisterna magna. Questo approccio alternativo migliora la precisione nel colpire aree cerebrali ristrette, consentendo iniezioni di piccolo volume direttamente sotto guida visiva dei punti di repère anatomici.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Chirurgia stereotassica
- Neuroscienze
- Ricerca su modelli animali
Sfondo
- I metodi standard prevedono l'accesso al cervello attraverso le ossa craniche e i punti di riferimento anatomici.
- L'approccio alla cisterna magna fornisce un percorso più diretto per il targeting.
- Questa tecnica può essere applicata a diversi modelli animali.
- Permette di raggiungere aree come il nucleo ipoglosso e il gruppo respiratorio ventrale.
Scopo dello studio
- Dimostrare una tecnica per un targeting più accurato delle strutture del tronco encefalico.
- Aumentare la precisione delle iniezioni in regioni ristrette.
- Valutare l'efficacia di questo metodo rispetto agli approcci standard.
Metodi Utilizzati
- Il metodo si basa su un approccio stereotassico guidato dal visivo con un orientamento anatomico preciso.
- Il modello biologico utilizzato è il topo, particolarmente adatto per studi neuroanatomici.
- I passaggi includono l'esecuzione di incisioni, la retrazione muscolare e l'uso di retrattori per l'esposizione.
- I passaggi critici prevedono il riconoscimento di punti di riferimento chiave e un posizionamento corretto per l'iniezione.
- Le iniezioni vengono effettuate con volumi variabili tra tre e 50 nanolitri in prossimità di aree bersaglio specifiche.
Risultati principali
- L'approccio alla cisterna magna ha dimostrato errori di targeting significativamente minori nelle strutture cerebrali rispetto ai metodi tradizionali.
- È stato ottenuto un targeting accurato del nucleo ipoglosso e del midollo allungato ventrale.
- La tecnica ha mostrato un successo maggiore nel raggiungere aree precedentemente difficili mediante un'invasività minima.
- I punti di riferimento sono fondamentali per mantenere l'orientamento e garantire un'esecuzione efficace della procedura.
Conclusioni
- Lo studio illustra una nuova tecnica che migliora l'accesso e il targeting del bulbo allungato.
- La precisione di questo metodo apre la strada a studi più raffinati di neuromodulazione.
- I risultati supportano una migliore comprensione dell'organizzazione anatomica all'interno del bulbo allungato.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
L'indirizzamento delle strutture del bulbo caudale e del midollo cervicale superiore rimane una sfida nelle neuroscienze precliniche a causa dell'inaccessibilità anatomica, limitando gli studi meccanicistici di funzioni vitali come la respirazione e il controllo motorio. L'approccio alla cisterna magna fornisce un percorso riproducibile e guidato da visione diretta che migliora la precisione dell'iniezione in regioni ristrette, favorendo un'interazione affidabile con la struttura bersaglio nelle fasi iniziali della scoperta. Questo progresso metodologico riduce la variabilità biologica e aumenta l'affidabilità predittiva nella valutazione di bersagli neuromodulatori in sistemi rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette un'analisi precisa di ipotesi terapeutiche nei nuclei del bulbo allungato coinvolti nelle funzioni sensorimotorie e autonome.
- Valore operativo: Riduce l'errore di targeting rispetto ai metodi basati sui punti di repère cranici, aumentando la riproducibilità tra i diversi gruppi sperimentali.
- Valore strategico: Supporta le decisioni di avanzamento o interruzione dello studio migliorando la certezza riguardo all'efficacia e alla specificità della modulazione del bersaglio.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Facilita la preparazione di modelli validati di microiniezione nel SNC per lo screening di composti in circuiti del tronco encefalico.
- Valore operativo: Fornisce un accesso chirurgico standardizzato con guida basata su punti di riferimento visivi, migliorando la coerenza del saggio.
- Valore strategico: Permette una valutazione affidabile della risposta in funzione della dose in regioni di difficile accesso, supportando gli sforzi di identificazione dei composti promettenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Mantiene la rilevanza clinica consentendo un rilascio mirato a strutture del tronco encefalico coinvolte in disturbi respiratori e neurodegenerativi.
- Valore operativo: Garantisce continuità dalla fase di scoperta alla validazione preclinica grazie a una precisione riproducibile nel targeting.
- Valore strategico: Riduce i rischi nell'avanzamento traslazionale minimizzando effetti fuori bersaglio e variabilità anatomica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta, in cui l'individuazione mirata basata su ipotesi di circuiti del tronco encefalico precede l'identificazione del composto leader e i test di efficacia preclinica.
- Biologia della scoperta: Supporta la riduzione del rischio meccanicistico consentendo una modulazione accurata dei nuclei del bulbo encefalico caudale per chiarire la funzione delle vie.
- Screening: Migliora la prontezza del saggio grazie alla precisione stereotassica e alla somministrazione costante di volumi nell'ordine dei nanolitri a bersagli definiti.
- Analisi: Genera dati spaziali quantitativi sul posizionamento (metriche di errore anteroposteriore, mediolaterale e dorsoventrale) per confrontare l'accuratezza della somministrazione tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica permettendo un indirizzamento affidabile di regioni del bulbo encefalico rilevanti per i modelli di malattie umane.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma chirurgica riutilizzabile applicabile a diversi progetti di neurofarmacologia e neuromodulazione.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi riducendo l'incertezza anatomica negli interventi sul tronco encefalico.
- Valore operativo: Aumenta la riproducibilità e la standardizzazione delle procedure di microiniezione nel sistema nervoso centrale tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale riducendo gli esperimenti falliti a causa di errata somministrazione, favorendo un'allocazione migliore delle risorse.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione adeguata ai rischi dei terapeutici mirati al tronco encefalico, basata su dati preclinici più affidabili.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia stereotassica su roditori e nell'identificazione dei punti di repère neuroanatomici.
- È dipendente da strumenti microchirurgici quali pinze ottuse, forbici a molla e manipolatori stereotassici.
- Necessita di tecniche asettiche e protocolli di cura postoperatoria per garantire il benessere animale e l'integrità dei dati.
- L'adattamento tra diversi modelli può richiedere modifiche nel fissaggio della testa e nella posizione del corpo a causa delle variazioni anatomiche.
- I limiti pratici includono la necessità di una visualizzazione precisa della dura madre e del drenaggio del liquido cerebrospinale per mantenere un campo chirurgico chiaro.
Domande frequenti di biotecnologie farmaceutiche
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Positioning of the Mouse in the Stereotaxic Frame
2:04
Surgery to Access the Cisterna Magna
3:34
Opening of the Cisternal Membrane and Identification of Landmarks and Zero Point
4:11
Injection of the Target
4:45
Closure of the Surgical Field
5:10
Results: Stereotaxic Surgical Approach in Mice
6:14
Conclusion
