Name: Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Impara la microiniezione stereotassica nel tronco encefalico caudale e nel midollo spinale cervicale superiore tramite la cisterna magna nei topi. Questa tecnica aumenta la precisione delle iniezioni in regioni ristrette.

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L'autore dichiara che il protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso il Beth Israel Deaconess Medical Center.
1. Preparazione di strumenti chirurgici e telaio stereotassico
NOTA: L'intervento viene eseguito in condizioni asettiche. La sterilità viene mantenuta utilizzando la tecnica della punta sterile.
<ol><li>Installare il braccio stereotassico con una micropipetta o una siringa riempita con un iniettabile di scelta (virus adeno-associato (AAV) o tracciante convenzionale) sul telaio stereotassico e preparare l'adattatore per mouse (Figura 2A).</li>
	<li>Preparare strumenti chirurgici autoclavati (Tabella dei materiali) e posizionarli su una superficie sterile.</li>
</ol>2. Induzione dell'anestesia e preparazione del topo
<ol><li>Accendere O2 a 0,5 L/min e impostare il vaporizzatore isoflurano a 4.0, assicurandosi che il flusso di O2 sia alla scatola di induzione. ATTENZIONE: Assicurarsi che la scatola di induzione dell'isoflurano sia collocata in un cappuccio e che l'isoflurano sia rimosso dal sito chirurgico.</li>
	<li>Posizionare il mouse (maschio di 10 settimane C57BL/6J) nella camera di induzione.</li>
	<li>Una volta che la respirazione è rallentata, aprire la camera di induzione e sollevare leggermente il mouse. Usa i tagliacapelli per rimuovere i peli dalla testa alle spalle.</li>
</ol>3. Posizionamento del mouse nel frame stereotassico
<ol><li>Spostare il mouse sulla cornice stereotassica e posizionare il naso in un cono nasale flessibile. In questa fase, assicurarsi che il flusso di O2 sia ora diretto al cono del naso.</li>
	<li>Posizionare il mouse nella cornice stereotassica utilizzando solo le barre auricolari. NOTA: Assicurarsi che le barre auricolari siano uniformi e che la testa sia in piano.</li>
	<li>Anteroflex la testa del mouse ad un angolo di 90° guidando manualmente il naso. Per fissare questa posizione, posizionare una barriera di plastica tra i montanti del padiglione auricolare dell'adattatore del mouse, parallelamente ai pilastri. La parte piatta del cranio funge da riferimento, simile all'approccio del cranio piatto nella chirurgia stereotassica convenzionale. NOTA: Non flettere eccessivamente la testa (cioè oltre un angolo di 90° tra il piano dell'osso cranico frontale e il piano della superficie del tavolo) in quanto ciò impedisce il flusso d'aria attraverso le vie aeree superiori. Se il flusso d'aria è ostacolato, riposizionare il mouse, assicurandosi che il corpo sia supportato sotto il tronco e che una carta di plastica sia posizionata a 90 ° tra il piano dell'osso cranico frontale e il piano della superficie del tavolo come indicato nella Figura 2A, C.</li>
	<li>Posizionare la piastra riscaldante sotto il mouse, quindi assicurarsi che il collo e il resto del corpo siano posizionati allo stesso livello (cioè a circa 180 ° o parallelamente al tavolo). La cassetta degli attrezzi che contiene le forbici a molla può essere utilizzata per sollevare il corpo in questa posizione. NOTA: Questo passaggio è importante in quanto il tronco cerebrale caudale e il cordone cervicale superiore si muovono a seconda della posizione, in contrasto con più parti rostrali del SNC che sono tenute in posizione dal cranio.</li>
	<li>Iniettare una singola dose di 4 mg/kg di Meloxicam a lento rilascio (SR) per via sottocutanea (s.c.) ad un volume di 2 μL/g di peso corporeo e posizionare il lubrificante sugli occhi.</li>
	<li>Pulire prima il sito di incisione chirurgica con un tampone di preparazione all'alcol al 70%, poi con un tampone di preparazione betadine, e poi di nuovo con un tampone di preparazione dell'alcol e lasciare asciugare.</li>
	<li>Posiziona un drappo sotto il corpo.</li>
	<li>Disinfettare le mani e indossare guanti sterili.</li>
	<li>Posizionare un drappo nel sito chirurgico.</li>
</ol>4. Chirurgia per accedere alla cisterna magna
<ol><li>Assicurarsi che il mouse sia opportunamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi o controllando il riflesso corneale.</li>
	<li>Ridurre l'isoflurano a livelli di manutenzione (2.0).</li>
	<li>Fai un'incisione di 1-1,2 cm con la lama chirurgica #10 dal bordo dell'osso occipitale verso le spalle in un movimento regolare.</li>
	<li>Fai un'incisione nel rafe della linea mediana del muscolo trapezio. Questo espone i muscoli longus capitis accoppiati. NOTA: Nei topi, il muscolo trapezio è un muscolo molto sottile, quasi trasparente. Assicurati di rimanere nella linea mediana e non tagliare i muscoli sottostanti in quanto ciò causerà sanguinamento inutile.</li>
	<li>Posiziona entrambi i ganci di riavvolgimento tra i muscoli longus capitis accoppiati, uno orientato a sinistra e l'altro a destra. Il peso degli emostati fornisce tensione ai ganci di riavvolgimento che possono essere modificati regolando nuovamente la posizione degli emostati.</li>
	<li>Posizionare il microscopio chirurgico in posizione per visualizzare meglio il campo chirurgico.</li>
	<li>Utilizzare la pinza smussata per laminectomia per separare il ventre sinistro e destro del muscolo longus capitis accoppiato, a partire dall'occipite, dove la linea mediana è facilmente visibile. Guida la pinza smussata attraverso l'osso dell'occipite nella linea mediana fino a dove incontra la dura madre cisternale, quindi continua attraverso la dura madre fino all'atlante. NOTA: Non è necessario tagliare i muscoli longus capitis accoppiati poiché nulla li tiene insieme nella linea mediana; in questo modo causerà sanguinamento inutile.</li>
	<li>Riposizionare i riavvolgitori e regolare la tensione riposizionando gli emostati, aprendo la vista della cisterna magna.</li>
	<li>Utilizzare la pinza di laminectomia smussata per separare ulteriormente i muscoli nella linea mediana per ottenere una buona finestra di visualizzazione del tronco cerebrale e del cervelletto.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 4.7-4.9 secondo necessità fino a quando il cervelletto e il tronco cerebrale vengono visualizzati sotto la dura.</li>
	<li>Usando una pinza per laminectomia smussata, liberare la dura dei piccoli fili di tessuto connettivo spostando la pinza dalla linea mediana in direzione laterale, fino a quando non vi è una visione chiara del tronco cerebrale e creare più spazio laterale, se necessario per il bersaglio.</li>
</ol>5. Apertura della membrana cisternale
<ol><li>Usa la pinza Dumont angolata (#4/45) per afferrare la dura, che si estende dall'osso occipitale all'atlante. Afferrare la dura vicino all'osso occipitale e utilizzare le forbici a molla per creare una piccola apertura (~ 0,5 a 1,5 mm) nella dura. NOTA: In questa posizione rostrale, lo spazio tra il tronco cerebrale e la dura sovrastante è più ampio, fornendo ampio spazio per la manipolazione sicura della dura.</li>
	<li>Utilizzare le forbici a molla per sollevare la dura e aprire ulteriormente la dura. La dimensione della finestra dipende dalla destinazione. NOTA: Sarà necessaria una finestra più grande quando si effettuano iniezioni longitudinali multiple o iniezioni bilaterali; una piccola finestra sarà sufficiente quando si effettuano iniezioni unilaterali o intermedie singole.</li>
	<li>Una volta aperta la dura, drenare il liquido cerebrospinale in eccesso con una punta sterile.</li>
</ol>6. Identificazione dei punti di riferimento e del punto zero
<ol><li>Visualizza la superficie dorsale del tronco cerebrale con punti di riferimento dettagliati attraverso la dura aperta. L'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, è il punto zero anteriore-posteriore e mediolaterale standard.</li>
</ol>7. Coordinate target
NOTA: Per vari target, abbiamo incluso un elenco di coordinate standard con coordinate anteriori posteriori (AP) e mediolaterali (ML) relative alle coordinate bregma e cisterna magna a punto zero con coordinate AP e ML relative all'obex a punto zero per facilitare la transizione tra le metodologie (Tabella 1). Le coordinate dorsoventrali (DV) sono relative alla superficie del cervello o del cervelletto (approccio standard) o alla superficie del tronco cerebrale o del cordone cervicale superiore (approccio cisterna magna) nel punto di ingresso AP e ML. La pianificazione dovrebbe essere fatta prima dell'intervento chirurgico.
<ol><li>Utilizzare i tre set di coordinate per determinare la destinazione: AP, ML e DV. A causa della posizione della testa, l'orientamento relativo delle strutture del tronco cerebrale varia in base alla posizione.<ol>
<li>Per la distanza target >0,4 mm dall'ombelico all'obex (Figura 1B, verde) eseguire le seguenti operazioni.<ol>
<li>AP: Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard (ad esempio, Paxinos e Franklin atlas2) o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza AP tra obex e il bersaglio.</li>
			<li>ML: Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza ML tra obex e il bersaglio.</li>
			<li>DV: Stimare le coordinate relative alla superficie del cervello o del cervelletto nel punto target AP e ML. Utilizzare qualsiasi atlante di riferimento stereotassico standard o serie di tessuti tagliati nel piano trasversale per stimare la distanza tra la superficie del tronco cerebrale alle coordinate AP e ML desiderate e il bersaglio.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Per la distanza target <0,4 mm dall'caudale all'obex (Figura 1B, arancione) eseguire quanto segue.<ol>
<li>AP: Regola le coordinate per tenere conto dell'anteroflessione del tronco cerebrale. Per le coordinate ventrali e rostrali, il punto di ingresso del tronco cerebrale AP sarà più caudale rispetto alla coordinata AP target nel piano standard.</li>
			<li>ML: Derivare le coordinate target da un atlante di riferimento stereotassico standard o da una serie di tessuti tagliati nel piano trasversale. Le coordinate saranno relative alla linea mediana visualizzata a livello di AP di destinazione.</li>
			<li>DV: Stimare le coordinate relative alla superficie del tronco cerebrale nel punto target AP e ML. Regola DV per tenere conto dell'anteroflessione del tronco cerebrale. Per le coordinate ventrali e rostrali, le coordinate DV saranno maggiori della distanza dalla superficie dorsale del tronco cerebrale nel piano standard.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. Iniezione del bersaglio
<ol><li>Abbassare la pipetta o la siringa sul bersaglio utilizzando il braccio stereotassico e iniettare la soluzione come per gli approcci stereotassici standard. Lasciare in posa per 1-5 minuti dopo l'iniezione, per evitare una traccia dell'ago quando si utilizzano volumi compresi tra 3-50 nL. Quindi, sollevare la pipetta o la siringa utilizzando il braccio stereotassico.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 8.1. per obiettivi multipli.</li>
</ol>9. Chiusura del campo chirurgico
<ol><li>Rimuovere i ganci con attenzione dal campo chirurgico. I muscoli longus capitis accoppiati ricadranno in una posizione neutra, coprendo completamente la cisterna magna. Non chiudere il muscolo trapezio e la dura madre nella linea mediana in quanto sono troppo fragili per contenere le suture.</li>
	<li>Chiudere la pelle con tre punti di sutura in nylon o polipropilene (5-0 o 6-0).</li>
</ol>10. Assistenza post-operatoria
<ol><li>Spegnere l'isoflurano e rimuovere il mouse dalla cornice stereotassica. Metti il mouse in una gabbia pulita su una piastra riscaldante e osserva fino a quando non sei sveglio e in movimento.</li>
	<li>Monitorare lo stato di salute, il peso e le suture nei giorni post-operatori 1-3. Rimuovere le suture il giorno 10 se non sono già state rimosse.</li>
</ol>

<ol><li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+Stereotaxic+Surgery%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Rodent Stereotaxic Surgery.</a> JoVE Science Education Database. , Neuroscience (2021).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. (2001).</li>
<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li>
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<li>Blasiak, T., Czubak, W., Ignaciak, A., Lewandowski, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+detection+of+the+bregma+point+on+the+rat+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to detection of the bregma point on the rat skull.</a> Journal of Neuroscience Methods. 185 (2), 199-203 (2010).</li>
<li>Popesko, P., Rajtova, V., Horak, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPopesko%2C+P+%22A+Colour+Atlas+of+the+Anatomy+of+Small+Laboratory+Animals%2C+Volume+2%3A+Rat%2C+Mouse+and+Golden+Hamster%22">A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals, Volume 2: Rat, Mouse and Golden Hamster</a>. 2, Wolfe Publishing Ltd. (1992).</li>
<li>Allen Mouse Brain Atlas. Allen Institute for Brain Science. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas">https://mouse.brain-map.org/experiment/thumbnails/100042147?image_type=atlas</a> (2004).</li>
<li>Vanderhorst, V. G. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+retroambiguus-spinal+pathway+in+the+mouse%3A+Localization%2C+gender+differences%2C+and+effects+of+estrogen+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Nucleus retroambiguus-spinal pathway in the mouse: Localization, gender differences, and effects of estrogen treatment.</a> The Journal of Comparative Neurology. 488 (2), 180-200 (2005).</li>
<li>Yokota, S., Kaur, S., VanderHorst, V. G., Saper, C. B., Chamberlin, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory-related+outputs+of+glutamatergic%2C+hypercapnia-responsive+parabrachial+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Respiratory-related outputs of glutamatergic, hypercapnia-responsive parabrachial neurons in mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 907-920 (2015).</li>
<li>Anselmi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasonographic+anatomy+of+the+atlanto-occipital+region+and+ultrasound-guided+cerebrospinal+fluid+collection+in+rabbits+%28Oryctolagus+cuniculus%29%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Radiology+%26+Ultrasound%22%5BJournal%5D)">Ultrasonographic anatomy of the atlanto-occipital region and ultrasound-guided cerebrospinal fluid collection in rabbits (Oryctolagus cuniculus).</a> Veterinary Radiology & Ultrasound. 59 (2), 188-197 (2018).</li>
<li>Herbert, H., Moga, M. M., Saper, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connections+of+the+parabrachial+nucleus+with+the+nucleus+of+the+solitary+tract+and+the+medullary+reticular+formation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 293 (4), 540-580 (1990).</li>
<li>Vanderhorst, V. G., Holstege, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caudal+medullary+pathways+to+lumbosacral+motoneuronal+cell+groups+in+the+cat%3A+evidence+for+direct+projections+possibly+representing+the+final+common+pathway+for+lordosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Caudal medullary pathways to lumbosacral motoneuronal cell groups in the cat: evidence for direct projections possibly representing the final common pathway for lordosis.</a> The Journal of Comparative Neurology. 359 (3), 457-475 (1995).</li>
<li>Vanderhorst, V. G., Terasawa, E., Ralston, H. J., Holstege, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+projections+from+the+nucleus+retroambiguus+to+motoneurons+supplying+the+abdominal+wall%2C+axial%2C+hindlimb%2C+and+pelvic+floor+muscles+in+the+female+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic projections from the nucleus retroambiguus to motoneurons supplying the abdominal wall, axial, hindlimb, and pelvic floor muscles in the female rhesus monkey.</a> The Journal of Comparative Neurology. 424 (2), 233-250 (2000).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21848-21853 (2010).</li>
<li>Krashes, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+reversible+activation+of+AgRP+neurons+drives+feeding+behavior+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice.</a> The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).</li>
<li>Ganchrow, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+of+the+solitary+tract+in+the+C57BL%2F6J+mouse%3A+Subnuclear+parcellation%2C+chorda+tympani+nerve+projections%2C+and+brainstem+connections%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Nucleus of the solitary tract in the C57BL/6J mouse: Subnuclear parcellation, chorda tympani nerve projections, and brainstem connections.</a> The Journal of Comparative Neurology. 522 (7), 1565-1596 (2014).</li>
<li>Ung, K., Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiber-optic+implantation+for+chronic+optogenetic+stimulation+of+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Fiber-optic implantation for chronic optogenetic stimulation of brain tissue.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e50004(2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La chirurgia stereotassica standard si basa comunemente sui punti di riferimento del cranio per calcolare le coordinate dei siti target nel SNC1. I siti bersaglio sono quindi accessibili tramite fori di bava che vengono perforati attraverso il cranio1. Questo metodo non è ideale per il tronco cerebrale caudale in quanto i siti bersaglio si trovano distanti dai punti di riferimento del cranio nei piani anteroposteriore e dorsoventrale2 e poic...

La chirurgia stereotassica standard per colpire i siti cerebrali nei topi1 comporta comunemente la fissazione del cranio utilizzando una serie di barre auricolari e una barra della bocca. Le coordinate vengono quindi stimate in base agli atlantidi riferimento 2,3 e ai punti di riferimento del cranio, vale a dire, bregma (il punto in cui le suture delle ossa frontali e parietali si uniscono) o lambda (il punto in cui le suture delle ossa parietale e occipitale si uniscono; Figura 1A,B). Attraverso un foro di bava nel cranio sopra il bersaglio stimato, la regione target può quindi essere raggiunta, sia per la consegna di microiniezioni che per la strumentazione con cannule o fibre ottiche. A causa della variazione nell'anatomia di queste suture e degli errori nella localizzazione di bregma o lambda 4,5, la posizione dei punti zero in relazione al cervello varia da animale ad animale. Mentre piccoli errori nel targeting, che derivano da questa variabilità, non sono un problema per bersagli grandi o vicini, il loro impatto è maggiore per aree di interesse più piccole che sono lontane dai punti zero nei piani anteroposterior o dorsoventral e / o quando si studiano animali di dimensioni variabili a causa dell'età, della tensione e / o del sesso. Ci sono diverse sfide aggiuntive che sono uniche per il midollo allungato e il cordone cervicale superiore. In primo luogo, piccoli cambiamenti nelle coordinate anteroposteriore sono associati a cambiamenti significativi nelle coordinate dorsoventrali rispetto alla dura, a causa della posizione e della forma del cervelletto (Figura 1Bi)2,6,7. In secondo luogo, il cordone cervicale superiore non è contenuto all'interno del cranio2. In terzo luogo, la posizione obliqua dell'osso occipitale e lo strato sovrastante dei muscoli del collo2 rendono l'approccio stereotassico standard ancora più impegnativo per le strutture situate vicino alla transizione tra il tronco cerebrale e il midollo spinale (Figura 1Bi). Infine, molti bersagli di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale sono piccoli2, che richiedono iniezioni precise e riproducibili 8,9.
Un approccio alternativo attraverso la cisterna magna aggira questi problemi. La cisterna magna è un grande spazio che si estende dall'osso occipitale all'atlante (Figura 1A, cioè il secondo osso vertebrale)10. È riempito con liquido cerebrospinale e coperto da dura madre10. Questo spazio tra l'osso occipitale e l'atlante si apre quando si anterofisce la testa. È possibile accedervi navigando tra le pance accoppiate sovrastanti del muscolo longus capitis, esponendo la superficie dorsale del tronco cerebrale caudale. Le regioni di interesse possono quindi essere prese di mira in base ai punti di riferimento di queste regioni stesse se si trovano vicino alla superficie dorsale; o usando l'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel ventricolo IV, come punto zero per le coordinate per raggiungere strutture più profonde. Questo approccio è stato utilizzato con successo in una varietà di specie, tra cui il ratto11, il gatto12, il topo 8,9 e il primate non umano13 per colpire il gruppo respiratorio ventrale, la formazione reticolare mediale midollare, il nucleo del tratto solitario, l'area postrema o il nucleo ipoglosso. Tuttavia, questo approccio non è ampiamente utilizzato in quanto richiede conoscenze di anatomia, un toolkit specializzato e competenze chirurgiche più avanzate rispetto all'approccio stereotassico standard.
Qui descriviamo un approccio chirurgico passo-passo per raggiungere il tronco cerebrale e il cordone cervicale superiore attraverso la cisterna magna, visualizzare i punti di riferimento, impostare il punto zero (Figura 2) e stimare e ottimizzare le coordinate target per la consegna stereotassica di microiniezioni nelle regioni discrete del tronco cerebrale e del midollo spinale di interesse (Figura 3). Discutiamo quindi i vantaggi e gli svantaggi legati a questo approccio.

<table><tbody><tr><td>Cuscinetto imbevuto di alcol</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU: MDS090735Z</td><td>preparato per la pelle per la prevenzione dell'infezione del sito chirurgico</td></tr><tr><td>Pinze angolate, Dumont #5/45</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td>solo per afferrare la dura</td></tr><tr><td>Betadine pad</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU:Pvp-PAD</td><td>preparazione della pelle per la prevenzione dell'infezione del sito chirurgico</td></tr><tr><td>Subunità della tossina del colera-b, Alexa Fluor 488/594 coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>488: C34775, 594: C22842</td><td>Clipper traccianti</td></tr><tr><td>fluorescenti</td><td>Wahl</td><td>Modello MC3, 28915-10</td><td>per la rasatura del pelo nel sito chirurgico</td></tr><tr><td>Portaelettrodo con morsetto angolare</td><td>Kopf</td><td>1770</td><td>per contenere la pipetta di vetro</td></tr><tr><td>Flussometro</td><td>Strumenti Gilmont</td><td>modello # 65 MM</td><td>per regolare il flusso di isoflurano e ossigeno al topo sul piano chirurgico</td></tr><tr><td>Microsfere fluorescenti, polistirene</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F13080</td><td>Tracciante fluorescente</td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Stoelting</td><td>53800M</td><td></td></tr><tr><td>Termoregolazione Camera di induzione con kit di aggancio per porte</td><td>Camera di 93805107 92800131 Midmark Inc</td><td></td><td>che fornisce l'anestesia iniziale</td></tr><tr><td>Siringa per insulina</td><td>Exelint International</td><td>26028</td><td>per somministrare soluzione salina e analgesica</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU:RXISO-250</td><td>anestetico inalante</td></tr><tr><td>Isoflurane Matrix VIP 3000 vaporizzatore</td><td>Midmark Inc</td><td>91305430</td><td>apparecchio per la somministrazione di anestetico inalante</td></tr><tr><td>Pinze per laminectomia, Dumont #2</td><td>FST</td><td>11223-20</td><td>solo per pulire</td></tr><tr><td>l'aria dura Medical, compressa</td><td>Linde</td><td>UN 1002</td><td>utilizzato con stimolatore e PicoPump per l'erogazione di aria per l'iniezione di soluzione di precisione</td></tr><tr><td>Meloxicam SR</td><td>Zoo Pharm LLC</td><td>Lotto # MSR2-211201</td><td>analgesico</td></tr><tr><td>Microematocrito tubo capillare precalibrato in vetro borosilicato</td><td>Globe Scientific Inc</td><td>51628</td><td>per la trasfezione di materiale in coordinate designate</td></tr><tr><td>Adattatore per mouse</td><td>Stoelting</td><td>0051625</td><td>&nbsp; adattamento del telaio stereotassico del ratto per la chirurgia del topo</td></tr><tr><td>Porta ago, Student Halsted- Emostatici per zanzare</td><td>FST</td><td>91308-12</td><td>per la sutura Regolatore di</td></tr><tr><td>ossigeno</td><td>Prodotti di supporto vitale</td><td>S/N 909328, lotto 092109</td><td>regolare i livelli di ossigeno dal serbatoio di ossigeno</td></tr><tr><td>Serbatoio di ossigeno, compresso</td><td>Linde</td><td>USP UN 1072</td><td>fornito insieme all'anestesia con isoflurano</td></tr><tr><td>Carta di plastica</td><td>non applicabile</td><td>non applicabile</td><td>qualsiasi carta di plastica rigida, tagliata per adattarsi al telaio stereotassico (ad es. carta d'identità)</td></tr><tr><td>PicoPump pneumatica (o simile)</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SYS-PV820</td><td>Per l'iniezione di soluzione</td></tr><tr><td>di precisione Soluzione salina, sterile</td><td>Attrezzatura medica per montagna</td><td>H04888-10</td><td>per sostituire i fluidi corporei persi durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Manico per bisturi, #3</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td>a tenere il bisturi</td></tr><tr><td>Forbici, Wagner</td><td>FST</td><td>14070-12</td><td>per tagliare la sutura in polipropilene</td></tr><tr><td>Forbici a molla, Vannas 2,5 mm con scatola di accompagnamento</td><td>Forbici FST</td><td>15002-08</td><td>solo per aprire la dura, scatola per sollevare il corpo</td></tr><tr><td>Micromanipolatore stereotassico</td><td>Kopf</td><td>1760-61</td><td>attaccato al portaelettrodo per regolare la</td></tr> <tr><td>posizione in base alle coordinateGruppo telaio stereotassico a "U" e piastra di base intracellulare</td><td>Kopf</td><td>1730-B, 1711</td><td>telaio per chirurgia</td></tr><tr><td>Applicatori sterili con punta in cotone</td><td>Puritan</td><td>25-806 10WC</td><td>che assorbe il sangue dal campo chirurgico</td></tr><tr><td>Teli sterili non fenestrati Henry</td><td>Schein</td><td>9004686</td><td>per campo chirurgico sterile</td></tr><tr><td>Unguento oftalmico sterile</td><td>Puralube</td><td>P1490</td><td>oculare lubrificante</td></tr><tr><td>Stimolatore & Tubing</td><td>Grass Medical Instruments</td><td>S44</td><td>per fornire aria presurred controllata per l'iniezione di soluzione di precisione</td></tr><tr><td>Lama chirurgica #10</td><td>Med-Vet International</td><td>SKU: 10SS</td><td>per incisione cutanea</td></tr><tr><td>Pinze chirurgiche, Graefe extra fine</td><td>FST</td><td>11153-10</td><td>per trattenere la pelle</td></tr><tr><td>Guanti chirurgici</td><td>Med-Vet International</td><td>MSG2280Z</td><td>per chirurgia</td></tr> <tr><td>asceticaMicroscopio operatorio</td><td>Leica</td><td>Modello M320/ F12</td><td>per l'ingrandimento 5X-40X del sito chirurgico</td></tr><tr><td>Sutura 5-0 polipropilene</td><td>Oasis</td><td>MV-8661</td><td>per chiudere la pelle</td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td>3M</td><td>3M ID 70200749250</td><td>fornisce una barriera sterile</td></tr><tr><td>Morsetto universale e palo di supporto</td><td>Kopf</td><td>1725</td><td>attaccato al telaio a U stereotassico e alla piastra di base intracellulare</td></tr><tr><td>Gancio per ferite con Emostatici hartman</td><td>FST</td><td>18200-09, 13003-10</td><td>per separare i muscoli e fornire una finestra chirurgica</td></tr></tbody></table>

approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la cisterna magna nei topi

Stereotaxic Surgical Approach to Microinject the Caudal Brainstem and Upper Cervical Spinal Cord via the Cisterna Magna in Mice

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi è comunemente guidata da punti di riferimento del cranio. L'accesso è quindi ottenuto tramite fori di bava praticati attraverso il cranio. Questo approccio standard può essere difficile per gli obiettivi nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore a causa di specifiche sfide anatomiche in quanto questi siti sono lontani dai punti di riferimento del cranio, portando all'imprecisione. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo tramite la cisterna magna che è stato utilizzato per indirizzare regioni discrete di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. La cisterna magna si estende dall'osso occipitale all'atlante (cioè il secondo osso vertebrale), è piena di liquido cerebrospinale ed è ricoperta da dura madre. Questo approccio fornisce una via di accesso riproducibile a strutture selezionate del sistema nervoso centrale (SNC) che sono altrimenti difficili da raggiungere a causa delle barriere anatomiche. Inoltre, consente la visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale in prossimità dei siti target, aumentando la precisione quando si erogano piccoli volumi di iniezione a regioni ristrette di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel midollo cervicale superiore. Infine, questo approccio offre l'opportunità di evitare il cervelletto, che può essere importante per gli studi motori e sensomotori.

L'approccio cisterna magna consente di colpire il tronco cerebrale caudale e le strutture del cordone cervicale superiore che sono altrimenti difficili da raggiungere tramite approcci stereotassici standard o sono inclini a targeting incoerente. L'intervento chirurgico per raggiungere la cisterna magna richiede incisioni della pelle, un sottile strato di muscolo trapezio e l'apertura della dura madre ed è quindi ben tollerato dai topi. È particolarmente efficiente e meno invasivo quando si prendono di mira più s...

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi comporta comunemente l'accesso attraverso le ossa del cranio ed è guidata da punti di riferimento del cranio. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo per colpire il tronco cerebrale caudale e il midollo spinale cervicale superiore attraverso la cisterna magna che si basa sulla visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale.

Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi

Stereotaxic surgery to target brain sites in mice is commonly guided by skull landmarks. Access is then obtained via burr holes drilled through the skull. ...

Questo protocollo fornisce linee guida passo-passo per una via di accesso riproducibile alle regioni di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. Questa tecnica aumenta la precisione quando si erogano piccoli volumi di iniezione a regioni ristrette di interesse nel tronco cerebrale caudale e nel cordone cervicale superiore. Questa tecnica è stata e può essere applicata ad altri modelli animali.Il Dr.Veronique VanderHorst, professore associato di neurologia e ricercatore principale del VanderHorst Laboratory, dimostrerà questa procedura. Assicurarsi che il flusso di ossigeno sia diretto al cono del naso. Spostare il mouse sulla cornice stereotassica e posizionare il naso in un cono nasale flessibile.Posizionare il mouse nella cornice stereotassica utilizzando solo le barre auricolari. Posizionare il lubrificante sugli occhi. Anteroflex la testa del mouse ad un angolo di 90 gradi guidando manualmente il naso.Per fissare questa posizione, posizionare una barriera di plastica tra i montanti della barra auricolare dell'adattatore del mouse parallela ai pilastri con la parte piatta del cranio che funge da riferimento. Posizionare la piastra riscaldante sotto il mouse e assicurarsi che il collo e il resto del corpo siano posizionati parallelamente al tavolo sollevando il corpo con una piccola scatola. Posiziona un drappo sotto il corpo.Iniettare una singola dose di quattro milligrammi per chilogrammo Meloxicam a rilascio lento per via sottocutanea ad un volume di due microlitri per grammo di peso corporeo. Pulire prima il sito di incisione chirurgica con un tampone di preparazione all'alcol al 70%, poi con un tampone di preparazione alla betaina e poi di nuovo con un tampone per la preparazione dell'alcol e lasciarlo asciugare. Disinfettare le mani e indossare guanti sterili, quindi posizionare un drappo nel sito chirurgico.Assicurarsi che il mouse sia opportunamente anestetizzato pizzicando le dita dei piedi o controllando il riflesso corneale. Ridurre l'isoflurano per mantenere i livelli a 2.0. Fai un'incisione da uno a 1,2 centimetri con una lama chirurgica da 10 dal bordo dell'osso occipitale verso le spalle in un movimento regolare.Fai con attenzione un'incisione nel rafe della linea mediana del muscolo trapezio, esponendo i muscoli della capite longus accoppiati. Posizionare entrambi i ganci di riavvolgimento tra i muscoli longus capitis accoppiati, uno orientato a sinistra e l'altro a destra. Utilizzare la pinza di laminectomia smussata per separare la pance sinistra e destra del muscolo longus capitis accoppiato, a partire dall'occipite dove la linea mediana è facilmente visibile.Guida la pinza smussata attraverso l'osso dell'occipite nella linea mediana fino a dove incontra la dura madre cisternale e poi continua attraverso la dura madre fino all'atlante. Riposizionare i riavvolgitori e regolare la tensione riposizionando gli emostati. Utilizzare la pinza per laminectomia smussata per separare ulteriormente i muscoli nella linea mediana per ottenere una buona visione del tronco cerebrale e del cervelletto.Ripetere la procedura di cui sopra, se necessario, fino a quando il cervelletto e il tronco cerebrale appaiono sotto la dura. Usando una pinza per laminectomia smussata, liberare la dura dei piccoli filamenti di tessuto connettivo spostando la pinza dalla linea mediana in direzione laterale fino a quando non vi è una chiara visione del tronco cerebrale, creando più spazio laterale. Visualizza la superficie dorsale del tronco cerebrale con punti di riferimento dettagliati attraverso la dura aperta.Utilizzare la pinza angolata per afferrare la dura che si estende dall'osso occipitale all'atlante, quindi utilizzare le forbici a molla per creare una piccola apertura di circa 0,5-1,5 millimetri nella dura. Una volta aperta la dura, drenare il liquido cerebrospinale in eccesso con una punta Q sterile. L'obex, il punto in cui il canale centrale si apre nel quarto ventricolo, è il punto zero standard anteriore-posteriore e mediolaterale.Posizionare la pipetta o la siringa sul bersaglio utilizzando il braccio stereotassico. Abbassare il braccio della dorsale sulla superficie dorsale che si forma dal punto zero dorsoventrale. Quindi abbassare la pipetta sul tronco cerebrale e iniettare la soluzione.Lasciare l'ago in posizione da uno a cinque minuti dopo l'iniezione per evitare una traccia dell'ago quando si utilizzano volumi compresi tra tre e 50 nanolitri. Quindi sollevare la pipetta o la siringa usando il braccio stereotassico e ripetere questo per più bersagli. Rimuovere i ganci con attenzione dal campo chirurgico.I muscoli longus capitis accoppiati ricadranno in una posizione neutra coprendo completamente la cisterna magna. Non chiudere il muscolo trapezio e la dura madre nella linea mediana in quanto sono troppo fragili per contenere le suture. Chiudere la pelle con 3 suture in nylon o polipropilene.L'approccio cisterna magna consente di colpire il tronco cerebrale caudale e le strutture del cordone cervicale superiore che sono altrimenti difficili da raggiungere tramite approcci stereotassici standard o sono inclini a targeting incoerente. Nei topi, strutture come il nucleo ipoglosso, il gruppo respiratorio ventrale e la formazione reticolare adiacente nel tronco cerebrale caudale sono state regolarmente prese di mira utilizzando l'approccio cisterna magna come illustrato qui per il nucleo ipoglosso e il midollo ventromediale. Al fine di determinare l'accuratezza dell'approccio cisterna magna rispetto all'approccio standard, è stata misurata la distanza tra i siti bersaglio previsti ed effettivi nei piani anteroposteriore, mediolaterale e dorsoventrale per le regioni ventrale e dorsale.I risultati mostrano errori significativamente più piccoli nei piani anteroposterior, mediolaterale e dorsoventrale rispetto all'approccio standard, evidenziando la maggiore precisione dell'approccio cisterna magna per questi obiettivi. Quando si tenta questo protocollo, è fondamentale assicurarsi che l'anteroflessione della testa e l'elevazione del corpo vengano eseguite come descritto. Successivamente, è importante riconoscere i punti di riferimento chiave prima di manipolare il muscolo o la dura madre.Se questi punti di riferimento non vengono riconosciuti o se vengono persi, sarà difficile rimanere orientati ed eseguire la procedura come previsto. Questa tecnica ha aiutato ad affrontare questioni concettuali relative all'organizzazione anatomica funzionale all'interno del tronco cerebrale caudale e del cordone cervicale superiore.

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Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Fonte: Joshi, K., et al. Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore attraverso la cisterna magna nei topi. J. Vis. Exp. (2022)Questo video mostra l'approccio stereotassico della cisterna magna per la somministrazione mirata al tronco encefalico e al midollo spinale superiore. Accedendo alla cisterna magna piena di liquido cerebrospinale, questo approccio consente iniezioni precise in aree difficili da raggiungere...

Approccio stereotassico della Cisterna Magna per la somministrazione terapeutica in un modello murino

Fonte: Porlan, E., et al. Modificazione genetica stabile ed efficiente delle cellule nel topo adulto V-SVZ per l'analisi degli effetti autonomi e non autonomi delle cellule staminali neurali. J. Vis. Exp. (2016)Questo video dimostra la modificazione genetica stabile delle cellule staminali neurali (NSC) nella zona ventricolare-subventricolare (V-SVZ) attraverso l'iniezione stereotassica di un gene terapeutico portatore di virus in un modello murino. Il virus entra nelle NSC, subisce la...

Iniezione stereotassica di virus per la modificazione genetica stabile in un modello murino

Fonte: Zamboni, M., et al., Induzione della modifica delle cellule leptomeningee tramite iniezione intracisternale. J. Vis. Exp. (2020)Questo video mostra la procedura di somministrazione di un farmaco induttore nella cisterna magna di un topo anestetizzato. L'iniezione induce selettivamente l'espressione di marcatori fluorescenti nelle cellule della superficie cerebrale accessibili tramite il liquido cerebrospinale, confermata dall'imaging a fluorescenza.

Somministrazione mirata di farmaci in un modello murino tramite iniezione di Cisterna Magna

Fonte: Xavier, A. L. R., et al. Impianto di cannule nella Cisterna Magna dei Roditori. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra la procedura per l'impianto di una cannula nella cisterna magna di un topo anestetizzato. La tecnica consiste nel guidare una cannula montata su ago attraverso la dura madre nella cisterna magna triangolare invertita e fissarla per una somministrazione mirata nel liquido cerebrospinale.

Impianto di cannula nella Cisterna Magna in un modello murino

In questo video, descriviamo la procedura per rilasciare cellule tumorali di derivazione umana nella cisterna magna del cervello di un topo. Il modello murino ortotopico può essere utilizzato per studiare la diffusione metastatica del cancro alle meningi craniche.

Iniezione chirurgica di Cisterna Magna: un metodo per la somministrazione di cellule tumorali direttamente nel sistema nervoso centrale del modello murino

Fonte: Fricano-Kugler, C. J., et al. Progettazione, confezionamento e consegna di CRISPR retrò e lentivirus ad alto titolo tramite iniezione stereotassica. J. Vis. Exp. (2016)Questo video mostra l'iniezione virale stereotassica per un preciso editing genico neuronale nel cervello del topo. Il protocollo garantisce un'accurata consegna del virus al giro dentato, consentendo la marcatura fluorescente e il knockout genico mediato da CRISPR per studiare i circuiti neurali, la funzione genica e i...

Iniezione virale stereotassica per l'editing genico neuronale mirato nel cervello del topo

Vettori virali per consentire la manipolazione genica mirata. Abbiamo dimostrato un metodo per l'espressione genica condizionale o ablazione nel midollo spinale topo, utilizzando iniezione stereotassica di un vettore virale nel corno dorsale, un luogo di rilievo di contatto sinaptico tra afferenze somatosensoriali primarie e neuroni del sistema nervoso centrale.

Iniezione stereotassica di un vettore virale per la manipolazione del gene condizionale nel midollo spinale del mouse

Qui descriviamo un protocollo per eseguire cisterna magna inserimento di una canula (CMc), un modo minimamente invasivo per offrire elementi traccianti, substrati e molecole di segnalazione nel liquido cerebrospinale (CSF). In combinazione con differenti modalità di imaging, CMc permette glifatico sistema e valutazione dinamica di CSF, come pure la consegna di tutto il cervello di vari composti.

Impianto di cannula in Cisterna Magna di roditori

Miniscope in vivo calcium imaging è una potente tecnica per studiare le dinamiche neuronali e i microcircuiti in topi che si comportano liberamente. Questo protocollo descrive l'esecuzione di interventi chirurgici al cervello per ottenere una buona imaging del calcio in vivo utilizzando un miniscopio.

Iniezione virale stereotassica e impianto di lenti con indice di gradiente per l'imaging del calcio in vivo nel cervello profondo

Il presente protocollo descrive una strategia pratica per accelerare la fase di verifica delle coordinate di iniezione stereotassiche prima di eseguire il tracciamento virale utilizzando coloranti e sezioni congelate.

Validazione preliminare delle coordinate di iniezione stereotassiche tramite criosezione

Il protocollo descrive un metodo per iniettare cellule tumorali attraverso la via di puntura percutanea nella cisterna magna che induce in modo robusto metastasi leptomeningee nei topi, riducendo il trauma e il carico tumorale extracranico.

Modello di iniezione minimamente invasivo di Cisterna Magna per studi di metastasi leptomeningee nei topi

Impara la microiniezione stereotassica nel tronco encefalico caudale e nel midollo spinale cervicale superiore tramite la cisterna magna nei topi. Questa tecnica aumenta la precisione delle iniezioni in regioni ristrette.

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Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi

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