Name: Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando lanalisi del flusso extracellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Scopri il metabolismo energetico mitocondriale in sferoidi 3D di linee cellulari tumorali utilizzando l'analisi del flusso extracellulare Seahorse. Questo metodo offre un modello fisiologico superiore rispetto ai tradizionali esperimenti su monostrati cellulari.

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Principali risultati e realizzazioni Questo documento fornisce un protocollo dettagliato per sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi 3D utilizzando una serie di linee cellulari derivate dal cancro con l'analizzatore XF XFe96. Viene sviluppato e descritto un metodo per la rapida coltivazione di sferoidi cellulari A549, HepG2/C3A, MCF7 e SK-OV-3 utilizzando tecnologie cellorepellenti per l'aggregazione forzata. Questo protocollo affronta molte considerazioni sulla sonda del m...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results section was updated.
Figure 5 was updated from:
<img alt="Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig05.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig05large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
to:
<img alt="Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="Figure 5"> 
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63346/63346fig5v2large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/63346">Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis</a>. The Representative Results&#160;section was&#160;updated.

Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis

I progressi nei modelli in vitro nella ricerca biologica sono progrediti rapidamente negli ultimi 20 anni. Tali modelli ora includono modalità organ-on-a-chip, organoidi e sferoidi microtesssuei 3D, che sono diventati tutti un obiettivo comune per migliorare la traduzione tra studi in vitro e in vivo. L'uso di modelli avanzati in vitro, in particolare sferoidi, abbraccia diversi campi di ricerca, tra cui l'ingegneria tissutale, la ricerca sulle cellule staminali, il cancro e la biologia delle malattie 1,2,3,4,5,6,7 e i test di sicurezza, tra cui la tossicologia genetica 8,9,10, la tossicologia dei nanomateriali11, 12,13,14 e test di sicurezza ed efficacia dei farmaci 8,15,16,17,18,19.
La normale morfologia cellulare è fondamentale per il fenotipo e l'attività biologica. La coltivazione di cellule in sferoidi microtissuei 3D consente alle cellule di adottare una morfologia, una funzione fenotipica e un'architettura, più simile a quella osservata in vivo ma difficile da catturare con le classiche tecniche di coltura cellulare monostrato. Sia in vivo che in vitro, la funzione cellulare è direttamente influenzata dal microambiente cellulare, che non si limita alla comunicazione e alla programmazione cellulare (ad esempio, formazioni di giunzione cellula-cellula, opportunità di formare nicchie cellulari); esposizione cellulare agli ormoni e ai fattori di crescita negli ambienti immediati (ad esempio, esposizione cellulare alle citochine come parte di una risposta infiammatoria); composizione di matrici fisiche e chimiche (ad esempio, se le cellule vengono coltivate in plastica di coltura tissutale rigida o in un ambiente di tessuto elastico); e, soprattutto, come il metabolismo cellulare è influenzato dalla nutrizione e dall'accesso all'ossigeno, nonché dalla lavorazione di prodotti di scarto metabolici come l'acido lattico.
L'analisi del flusso metabolico è un modo potente per esaminare il metabolismo cellulare all'interno di sistemi in vitro definiti. In particolare, la tecnologia XF consente l'analisi di cambiamenti vivi e in tempo reale nella bioenergetica cellulare di cellule e tessuti intatti. Dato che molti eventi metabolici intracellulari si verificano nell'ordine di secondi o minuti, gli approcci funzionali in tempo reale sono fondamentali per comprendere i cambiamenti in tempo reale nel flusso metabolico cellulare in cellule e tessuti intatti in vitro.
Questo documento fornisce protocolli per la coltivazione di linee cellulari derivate dal cancro A549 (adenocarcinoma polmonare), HepG2 / C3A (carcinoma epatocellulare), MCF-7 (adenocarcinoma mammario) e SK-OV-3 (adenocarcinoma ovarico) come modelli sferoidi 3D in vitro utilizzando approcci ad aggregazione forzata (Figura 1). Inoltre (i) descrive in dettaglio come sondare il metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi 3D utilizzando l'analizzatore Agilent XFe96 XF, (ii) evidenzia i modi per ottimizzare i saggi XF utilizzando singoli sferoidi 3D e (iii) discute importanti considerazioni e limitazioni del sondaggio del metabolismo sferoide 3D utilizzando questo approccio. Ancora più importante, questo documento descrive come vengono raccolti i set di dati che consentono il calcolo del tasso di consumo di ossigeno (OCR) per determinare la fosforilazione ossidativa e quindi la funzione mitocondriale negli sferoidi cellulari. Sebbene non sia stato analizzato per questo protocollo, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) è un altro parametro che viene misurato insieme ai dati OCR negli esperimenti XF. Tuttavia, ECAR è spesso interpretato in modo errato o errato dai set di dati XF. Forniamo un commento sui limiti del calcolo dell'ECAR seguendo gli approcci di base del produttore della tecnologia.

<table><tbody><tr><td>A549</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#86012804</td><td>Linea cellulare di carcinoma polmonare</td></tr><tr><td>Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4</td><td>Agilent Technologies Inc.</td>Terreno di prova <td>103576-100</td><td>XF con 1 mM HEPES, senza rosso fenolo, bicarbonato di sodio, glucosio, L-glutammina e piruvato di sodio</td></tr><tr><td>Analizzatore di flusso extracellulare Agilent Seahorse XFe96</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td>Strumento per la misurazione dei tassi di assorbimento di ossigeno sferoidale in singoli sferoidi</td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Merck Life Science</td><td>A8674</td><td>Inibitore del complesso respiratorio mitocondriale III</td></tr><tr><td>BAM15</td><td>TOCRIS bio-techne</td><td>5737</td><td>Disaccoppiatore di protnofori mitocondriali</td></tr><tr><td>Micropiastra a parete nera</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655076</td><td>Per saggi</td></tr> <tr><td>basati sulla fluorescenzaSuperficie repellente per cellule CELLSTAR Micropiastre a 96 pozzetti</td><td>U Greiner Bio-One</td><td>650970</td><td>Micropiastre per la generazione di sferoidi</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Saggio di vitalità cellulare 3D</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td>Saggio per la determinazione della vitalità cellulare in sferoidi microtissutali 3D</td></tr><tr><td>Cultrex Poly-D-Lysine</td><td>R& D Systems a marchio biotechne</td><td>3439-100-01</td><td>Adesivo cellulare molecolare per il rivestimento di micropiastre sferoidi XFe96 per facilitare l'attacco di sferoidi</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Merck Life Sciences</td><td>G8270</td><td>Integratore per la crescita di colture cellulari e terreno di analisi XF</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>Terreno di coltura <td>Gibco</td><td>11885084</td><td>per sferoidi HepG2/C3A</td></tr><tr><td>EVOS XL Core Imaging System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMEX1000</td><td>Microscopio per immagini a contrasto di fase</td></tr><tr><td>EZ-PCR Kit per il test del micoplasma Biological</td><td>Industries</td><td>20-700-20</td><td>Screening del micoplasma in colture cellulari</td></tr><tr><td>FIJI è solo l'immagine J</td><td></td><td></td><td>Analisi delle immagini raccolte</td></tr><tr><td>Siero bovino fetale</td><td>Merck Life Science</td><td>F7524</td><td>Integratore per terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>HepG2/C3A</td><td>ATCC</td><td>&nbsp;#CRL-10741</td><td>Linea cellulare di carcinoma epatico, un derivato clonale della linea cellulare HepG2 madre</td></tr><tr><td>Lattato-Glo</td><td>Promega</td><td>J5021</td><td>Test per la misurazione del lattato all'interno del terreno di coltura sfeoride</td></tr><tr><td>L-glutammina (soluzione 200 mM)</td><td>Merk Life Sciences</td><td>G7513</td><td>Integratore per la crescita di colture cellulari e il terreno di analisi XF</td></tr><tr><td>Stereomicroscopio M50</td> Leica <td>Microsytems</td><td>LEICAM50</td><td>Stereoscopio a dissezione; utilizzato per la manipolazione di spheoridi</td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ECACC</td><td>#86012803</td><td>Linea cellulare di adenocarcinoma mammario</td></tr><tr><td>Oligomicina da Streptomyces diastatochromogenes</td><td>Merck Life Science</td><td>O4876</td><td>Inibitore dell'ATP sintasi</td></tr><tr><td>Penicilina-Streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Antibiotici aggiunti al terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsKit di analisi del DNA</td><td>Azoto</td><td>P7589</td><td>Analisi del dsDNA negli spehroidi</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Merck Life Science</td><td>R8875</td><td>Inibitore del complesso respiratorio mitocondriale I</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>21875091</td><td>Terreno di coltura per A549, MCF7 e SK-OV-3 sferoidi</td></tr><tr><td>Seahorse Analytics</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>Costruisci 421 https://seahorseanalytics.agilent.com</td><td></td></tr><tr><td>Cavalluccio Marino XFe96 Sferoide FluxPak</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>102905-100</td><td>Ogni Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak contiene: 6 micropiastre per sferoidi Seahorse XFe96 (102978-100), 6 cartucce per sensori XFe96 e 1 flacone di soluzione calibrante Seahorse XF da 500 mL (100840-000)</td></tr><tr><td>Pipetta sierologica: 5, 10 e 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606107; 607107; 760107</td><td>Materiali di consumo per colture cellulari</td></tr><tr><td>SK-OV-3</td><td>ECACC</td><td>&nbsp;#HTB-77</td><td>Linea</td></tr> <tr><td>cellulare di adenocarcinoma ovaricoPiruvato di sodio (soluzione 100 mM)</td><td>Merck Life Science</td><td>S8636</td><td>Integratore per la crescita di colture cellulari e terreno di saggio XF</td></tr><tr><td>T75 cm2 pallone per colture cellulari</td><td>Greiner Bio-One</td><td>658175</td><td>Fiasche trattate per colture tissutali per il mantenimento di colture cellulari</td></tr><tr><td>TrypLExpress</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td>Reagente per dissociazione cellulare</td></tr><tr><td>Software di controllo delle onde</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Punta a orifizio largo</td><td>STARLAB International GmbH</td><td>E1011-8400</td><td>Puntali per pipette con ampia apertura per la manipolazione di sferoidi</td></tr></tbody></table>

esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3d utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids Using Extracellular Flux Analysis

Gli aggregati cellulari tridimensionali (3D), chiamati sferoidi, sono diventati l'avanguardia della coltura cellulare in vitro negli ultimi anni. A differenza della coltura delle cellule come monostrati bidimensionali a singola cellula (coltura 2D), la coltura cellulare sferoide promuove, regola e supporta l'architettura cellulare fisiologica e le caratteristiche che esistono in vivo, compresa l'espressione di proteine della matrice extracellulare, la segnalazione cellulare, l'espressione genica, la produzione di proteine, la differenziazione e la proliferazione. L'importanza della cultura 3D è stata riconosciuta in molti campi di ricerca, tra cui oncologia, diabete, biologia delle cellule staminali e ingegneria tissutale. Nell'ultimo decennio, sono stati sviluppati metodi migliorati per produrre sferoidi e valutare la loro funzione metabolica e il loro destino.
Gli analizzatori di flusso extracellulare (XF) sono stati utilizzati per esplorare la funzione mitocondriale in microtessuti 3D come gli sferoidi utilizzando una piastra di cattura delle isole XF24 o una micropiastra sferoide XFe96. Tuttavia, protocolli distinti e l'ottimizzazione del metabolismo energetico mitocondriale di sonda negli sferoidi utilizzando la tecnologia XF non sono stati descritti in dettaglio. Questo documento fornisce protocolli dettagliati per sondare il metabolismo energetico mitocondriale in singoli sferoidi 3D utilizzando micropiastre sferoidi con l'analizzatore XF XFe96. Utilizzando diverse linee cellulari tumorali, la tecnologia XF ha dimostrato di essere in grado di distinguere tra respirazione cellulare in sferoidi 3D non solo di diverse dimensioni, ma anche di diversi volumi, numeri di cellule, contenuto e tipo di DNA.
Le concentrazioni ottimali di composti effettori mitocondriali di oligomicina, BAM15, rotenone e antimicina A vengono utilizzate per sondare parametri specifici del metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi 3D. Questo documento discute anche i metodi per normalizzare i dati ottenuti dagli sferoidi e affronta molte considerazioni che dovrebbero essere prese in considerazione quando si esplora il metabolismo sferoide utilizzando la tecnologia XF. Questo protocollo aiuterà a guidare la ricerca in modelli sferoidi avanzati in vitro .

Per ottenere sferoidi compatti e ben formati, ogni linea cellulare è stata ottimizzata individualmente per la densità di semina e la durata della coltivazione (Figura 3). Le linee cellulari A549, HepG2/C3A e SK-OV-3 inizialmente formavano aggregati sciolti che non progredivano verso sferoidi rotondi con perimetri chiaramente definiti fino a dopo 7 giorni in coltura. Al contrario, le cellule MCF-7 potrebbero formare sferoidi entro 3 giorni. C'era una chiara correlazione tra la densità inizial...

Questi protocolli aiuteranno gli utenti a sondare il metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi derivati dalla linea cellulare del cancro 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare di Cavalluccio marino.

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

Three-dimensional (3D) cellular aggregates, termed spheroids, have become the forefront of in vitro cell culture in recent years. In contrast to culturing ...

Il nostro protocollo consente ai ricercatori di sondare il metabolismo energetico mitocondriale e gli sferoidi senza soluzione di continuità per consentire confronti tra diverse linee cellulari, numeri di cellule e fenotipi, nonché trattamenti farmacologici in un campo di scoperta di farmaci e ricerca sul cancro. Il nostro lavoro presenta un protocollo dettagliato per esplorare il metabolismo energetico mitocondriale utilizzando sferoidi 3D che forniscono il modello fisiologico superiore rispetto agli esperimenti monostrato cellulare. Le osservazioni biologiche potrebbero estrapolare da uno sferoide vitreo a tumori in vivo e identificare percorsi che possono indirizzare il metabolismo del tumore sferoide.Ad esempio, l'utilità dei carboidrati durante la crescita degli sferoidi. Tutti i dati seahorse extracellular flux 96 strumento è molto sensibile. Il posizionamento di sferoidi in vitro all'interno della piastra di dosaggio è fondamentale per ottenere dati accurati a livello di singolo sferoide.Controllare la vitalità sferoidale utilizzando un microscopio a luce invertita con contrasto di fase con ingrandimento 4x per garantire la struttura sferoide intatta, la morfologia e l'uniformità generale tra i campioni. Per idratare la cartuccia del sensore, aliquotare circa 20 millilitri del calibrante in un tubo conico. Posizionare il tubo conico contenente il calibrante in un incubatore non di anidride carbonica a 37 gradi Celsius durante la notte.Estrarre il contenuto del kit di analisi. Posizionare la cartuccia del sensore capovolta accanto alla piastra di utilità. Pipettare 200 microlitri di acqua sterile a doppio distillato in ogni pozzo della piastra di utilità utilizzando una pipetta P300 multicanale.Posizionare la cartuccia del sensore sulla parte superiore della piastra di utilità. Controllare se il livello dell'acqua in ciascun pozzo è abbastanza alto da immergere le sonde del sensore. Trasferire la cartuccia del sensore assemblata in un incubatore non a 37 gradi Celsius di anidride carbonica e lasciarlo durante la notte.Per rivestire la micropiastra di saggio sferoidale, aggiungere 30 microlitri di 0,1 milligrammi sterili per millilitro di soluzione di poli-D-lisina per pozzetto di micropiastra sferoide utilizzando una tecnica settica. Aspirare la soluzione da ciascun pozzetto della micropiastra sferoidale, invertire la piastra e picchiettarla saldamente sulla carta velina per rimuovere qualsiasi soluzione residua. Lavare ogni pozzetto della piastra con 200 microlitri di acqua sterile a doppia distillazione.Dopo il lavaggio finale, capovolgere la micropiastra e picchiettarla saldamente sulla carta velina per rimuovere l'acqua residua. Lasciare asciugare la piastra all'aria per 30 minuti prima dell'uso futuro. Preparare il supporto RPMI XF come descritto nel manoscritto.Prima del riscaldamento il mezzo di saggio XF RPMI integrato a 37 gradi Celsius un'ora prima del test. E prima del riscaldamento la micropiastra di analisi sferoide rivestita in un incubatore non di anidride carbonica a 37 gradi Celsius. Estrarre il tubo conico contenente il calibrante e la cartuccia del sensore dall'incubatore ad aria.Rimuovere la cartuccia del sensore dalla piastra di utilità e posizionarla a testa in giù sul piano di lavoro. Utilizzando una pipetta multicanale P300, aspirare l'acqua dalla piastra di servizio e scartarla. Aggiungere 200 microlitri del calibrante preriscaldato a ciascun pozzetto della piastra di utilità.Posizionare la cartuccia del sensore sulla piastra di utilità assicurandosi che i sensori siano ben immersi nel calibrante. Trasferire la cartuccia del sensore assemblata nell'incubatore non a 37 gradi Celsius fino a quando non è pronto per caricare le soluzioni di iniezione della porta. Estrarre la piastra di coltura sferoidale dall'incubatore e osservare gli sferoidi al microscopio per garantirne l'integrità prima delle fasi di trasferimento degli sferoidi.Caricare 180 microlitri di mezzo di saggio prebellico in ciascun pozzetto della piastra sferoide, compresi eventuali pozzetti di correzione dello sfondo. Riempire parzialmente una capsula di Petri di sette centimetri con tre millilitri del mezzo di analisi. Trasferire gli sferoidi dalla piastra di coltura del pozzo 96 in una capsula di Petri, utilizzando una pipetta multicanale caricata con ampie punte di pipetta orifizio e volume impostato su 10-50 microlitri.Impostare il volume di un pipettor a canale singolo dotato di un'ampia punta della pipetta dell'orifizio su 20 microlitri e aspirare accuratamente un singolo sferoide. Posizionare la punta direttamente al centro di ciascun pozzetto di questa micropiastra di analisi sferoidale e consentire l'azione capillare per prelevare lo sferoide dalla punta della pipetta. Confermare l'evoluzione al microscopio pipettando il contenuto del pipettatore nella capsula di Petri.Una volta che tutti questi sferoidi sono stati trasferiti nella micropiastra di analisi sferoidale, trasferire la piastra in un incubatore non di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un minimo di un'ora. Preparare le concentrazioni di stock di lavoro di ciascun composto come descritto nel manoscritto, utilizzando un mezzo di saggio XF RPMI preriscaldato completamente integrato. Erogato 20 microlitri della soluzione di lavoro di ciascun composto in tutte le porte corrispondenti utilizzando una pipetta multicanale P100 calibrata.Preparare l'analizzatore per il caricamento della cartuccia del sensore. Per ottenere sferoidi compatti ben formati, ogni linea cellulare è stata ottimizzata individualmente per la densità di semina e la durata della coltivazione. Con strategie di semina ottimizzate, il volume sferoidale per SK-OV-3 era di circa 5,46 x 10 ai sette micrometri cubetti e per A549, era di 1,45 x 10 a otto micrometri cubi.Tutti i tipi di sferoidi avevano una correlazione lineare tra la densità iniziale di semina e il volume sferoide. La simmetria sferoide perfetta aveva una circolarità di 1,0 e una deviazione da 1,0 indicava una perdita di circolarità. Per tutti i tipi di sferoidi, il tasso di consumo di ossigeno è aumentato con le dimensioni dello sferoide ed è stato linearmente correlato al volume sferoide con il più alto negli sferoidi MCF-7 e il più basso negli sferoidi SK-OV-3.Gli sferoidi MCF-7 non hanno risposto al controllo del veicolo durante l'esperimento. Il tasso di consumo di ossigeno negli sferoidi MCF-7 è stato abbassato con oligomicina dopo cinque cicli di misurazione in seguito alla prima iniezione di 0,5 microgrammi per millilitro. In risposta a BAM15, il tasso di consumo di ossigeno è aumentato prima della seconda iniezione.Considerando che la combinazione di Rotenone più Antimicina A lo ha abbassato. Un protocollo per sondare accuratamente la respirazione mitocondriale basale. La respirazione di fosforilazione ADP, la respirazione a perdita, l'efficienza di accoppiamento, la capacità respiratoria massima e la capacità respiratoria di riserva sono state sviluppate utilizzando sferoidi 3D derivati dal cancro.Tutti i composti respiratori hanno prodotto i profili di consumo cinetico di ossigeno attesi per i composti selezionati che rivelano un tasso medio di respirazione basale costante da 20 a 30 picomoli di ossigeno al minuto, per pozzetto. Posizione degli sferoidi all'interno della micropiastra e numero del ciclo di misurazione dopo l'iniezione del composto per garantire che i tassi di respirazione siano stabili tra le aggiunte di composti. Quando si esplora la capacità respiratoria mitocondriale con gli unbunplers, non solo la concentrazione è la chiave, ma anche la sua capacità di disaccoppiare la respirazione in presenza di oligomicina, che viene tipicamente aggiunta prima del disaccoppiatore negli esperimenti che sondano il metabolismo energetico mitocondriale.

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Cancer Research

Ricerca sul cancro

Una descrizione di un metodo per la profilatura funzione mitocondriale nelle cellule è fornito. Il profilo mitocondriale generato fornisce quattro parametri della funzione mitocondriale, che può essere misurata in un esperimento: frequenza respiratoria basale, ATP-linked respirazione, perdita protonica, e la capacità di riserva.

Profilo Esperimento bioenergetica utilizzando cellule dei mioblasti C2C12

Questo protocollo descrive la tecnica per eseguire il saggio del flusso extracellulare su sferoidi 3D generati dalla co-coltura di cellule tumorali pancreatiche (Patu8902) e fibroblasti pancreatici attivati (PS1) per misurare le due principali vie di produzione di energia, la glicolisi e la respirazione mitocondriale.

Saggio del flusso extracellulare in sferoidi 3D: un metodo per misurare l'attività metabolica degli sferoidi tumorali del pancreas

Qui, un metodo è descritto per la preparazione di co-coltura 3-dimensionale della sferoide (3D) delle cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti, seguiti dalla misura delle funzioni metaboliche utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Preparazione e dosaggio metabolica della sferoide 3-dimensionale co-colture di cellule di cancro del pancreas e dei fibroblasti

Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

L'obiettivo del presente protocollo è quello di illustrare come utilizzare cardiomiociti neonatali del mouse come sistema modello per esaminare come i vari fattori possono alterare il consumo di ossigeno nel cuore.

Analizzando il tasso di consumo di ossigeno nei Cardiomyocytes neonatali coltivati primari del topo utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

In questo lavoro, descriviamo un protocollo modificato per testare il flusso del substrato respiratorio mitocondriale utilizzando la perfringolisina O ricombinante in combinazione con la respirometria basata su micropiastre. Con questo protocollo, mostriamo come la metformina influisce sulla respirazione mitocondriale di due diverse linee cellulari tumorali.

Misurazione del flusso del substrato mitocondriale in cellule ricombinanti perfringolisina O-permeabilizzate

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Descriviamo protocolli graduali che misurano la respirazione mitocondriale di neutrofili di topo e umani e cellule HL60 utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare metabolico.

Misurazione in tempo reale del profilo bioenergetico mitocondriale dei neutrofili

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Qui, stabiliamo una piattaforma di profilazione metabolica che integra gliomi sferoidi tridimensionali (3D) e normalizzazione basata sull'imaging tramite analisi del flusso extracellulare. Questo approccio consente una valutazione più accurata delle risposte metaboliche dei tumori ai trattamenti farmacologici e fornisce informazioni sui potenziali meccanismi di resistenza.

Progressi nella profilazione metabolica degli sferoidi tridimensionali dei tumori cerebrali per lo screening dei farmaci

Questo protocollo descrive un modo conveniente per eseguire un test di sforzo per la glicolisi al fine di quantificare la riprogrammazione metabolica nella microglia primaria del topo. Dopo l'isolamento e la stimolazione infiammatoria, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) viene misurato utilizzando reagenti appena preparati e regolati per il pH, seguiti dalla normalizzazione proteica per consentire una valutazione accurata e riproducibile degli spostamenti glicolitici.

Indagine della glicolisi nella microglia primaria tramite test di flusso extracellulare

Scopri il metabolismo energetico mitocondriale in sferoidi 3D di linee cellulari tumorali utilizzando l'analisi del flusso extracellulare Seahorse. Questo metodo offre un modello fisiologico superiore rispetto ai tradizionali esperimenti su monostrati cellulari.

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando lanalisi del flusso extracellulare (Video) | JoVE Journal

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

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