Isolamento delle cellule staminali mesenchimali del tessuto adiposo di ratto per la differenziazione in cellule produttrici di insulina
29 agosto 2022
Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSC) possono essere una potenziale fonte di MSC che si differenziano in cellule produttrici di insulina (IPC). In questo protocollo, forniamo passaggi dettagliati per l'isolamento e la caratterizzazione di Ad-MSC epididimali di ratto, seguiti da un protocollo semplice e breve per la generazione di IPC dallo stesso Rat Ad-MSCs.
L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di isolare e caratterizzare il tessuto adiposo rosso, le cellule staminali mesenchimali essiccate e differenziarle verso le cellule produttrici di insulina utilizzando metodi semplici. Le cellule staminali mesenchimali hanno trovato la strada nel campo della genetica. Possono essere isolati da varie fonti come il midollo osseo, il tessuto adiposo e il tessuto perinatale.
Accettano eccellenti caratteristiche culturali. Sono multi potenti e possono potenzialmente trattare varie malattie. Il tessuto adiposo fornisce una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali.
Queste MSC adipose possono essere isolate facilmente dagli aspirati lipo con alta resa rispetto ad altre fonti come il midollo osseo. E possono fornire una buona fonte sia per il trapianto autologo che allogenico. In questo video vengono presentati un semplice protocollo per l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali adipose da grasso epididimale di ratto.
Questa procedura è un metodo semplice e altamente efficiente per l'isolamento. Dopo l'isolamento, sopporteremo la differenziazione di queste cellule staminali mesenchimali adipose in cellule produttrici di insulina utilizzando un protocollo semplice e relativamente breve. Inizieremo con l'isolamento delle cellule staminali mesenchimali adipose mediante digestione collagenosa del grasso epididimale per ottenere una frazione vascolare più forte.
Quindi le cellule staminali mesenchimali saranno caratterizzate dalla loro aderenza plastica, nonché dall'espressione di marcatori CD e dalla differenziazione in più lignaggi mesodermici. Anaesthise l'animale, quindi eutanasia usando la lussazione cervicale. Spruzzare su tutto il corpo con etanolo al 70% e iniziare con l'escissione della pelle e dei muscoli nella parte inferiore dell'addome.
Quindi esporre i testicoli con il grasso epididimale. Tagliare delicatamente il grasso epididimale. Fare attenzione a non tagliare i vasi sanguigni con i grassi.
In un armadietto di sicurezza bio, tagliare il tessuto adiposo in piccoli pezzi usando pinze e bisturi. Trasferire il tessuto adiposo in tubo centrifugo contenente 10 millilitri di PBS sterile. Inizia il lavaggio inclinando il tubo Falcon per 45 secondi.
Quindi tenere il tubo in piedi per cinque minuti per separarlo in due strati. Rimuovere il PBS infranato utilizzando una siringa da 10 millilitri. Ripeti questa procedura di lavaggio da quattro a cinque volte fino a quando PBS non è chiaro.
Dopo il lavaggio, sospendere nuovamente il tessuto adiposo in soluzione collagenosa, quindi incubare a bagno d'acqua tremante fino a quando il tessuto è quasi omogeneo. Successivamente, ruotare la miscela collagenosa tissutale per 15 secondi, quindi centrifugare successivamente per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, avrai tre strati.
Scartare con attenzione il surnatante sulla frazione vascolare stromale. Per prima cosa scartare con attenzione lo strato di olio nella parte superiore, seguito dallo strato di echi senza disturbare il pellet della frazione vascolare stromale. Sospendere nuovamente la frazione vascolare stromale in BSA sterile e ricentrare per cinque minuti.
Centrifugazione intera, posizionare il supporto DMEM F-12 completo in un pallone quadrato di 25 centimetri. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e sospendere nuovamente il pellet vascolare stromale in un mezzo DMEM F-12 completo. E trasferisci al pallone di coltura.
Posizionare in 37 gradi 5% incubatore di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere le celle non attaccate e sostituire il supporto con un supporto nuovo. A partire dal giorno successivo di isolamento, le cellule simili ai fibroblasti inizieranno ad apparire.
Poi gradualmente con il passare del tempo aumenteranno di numero e dimensioni. Passando, le cellule diventeranno più omogenee. Queste cellule presentano tutti i criteri di caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali.
Queste cellule sono state differenziate verso le cellule produttrici di insulina utilizzando questo semplice protocollo contenente nicotinamide beta mercaptoetanolo ed Exendin-4. Durante le fasi di differenziazione, le cellule iniziano a perdere la loro forma fibroblastica e penso che la morfologia sia simile a un cluster. Quando le cellule produttrici di insulina utilizzate mostrano una colorazione positiva del disitone rosso cremisi, quindi le cellule produttrici di insulina utilizzate esprimono vari marcatori delle cellule beta come Pdx-1, mafA e insulina.
Inoltre, le cellule produttrici di insulina indotte secernono livelli più elevati di insulina nel surnatante quando sfidate con una maggiore concentrazione di glucosio. Abbiamo fornito un protocollo dettagliato e graduale per l'isolamento e la caratterizzazione delle cellule staminali mesenchimali adipose. Forniamo anche qui un protocollo relativamente breve, semplice ed efficiente per la differenziazione delle cellule staminali mesenchimali adipose in cellule produttrici di insulina.
Ciò fornisce un gateway per il ricercatore per entrare nel campo delle cellule staminali mesenchimali e studiare la loro differenziazione in cellule produttrici di insulina.
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Panoramica
Questo protocollo descrive l'isolamento e la caratterizzazione di cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSCs) da tessuto epididimale di ratto, seguito dalla loro differenziazione in cellule produttrici di insulina (IPCs). I metodi forniti sono semplici e progettati per essere facilmente applicabili in un ambiente di laboratorio.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia delle Cellule Staminali
- Medicina Rigenerativa
- Endocrinologia
Sfondo
- Le cellule staminali mesenchimali (MSCs) possono essere ottenute da diversi tessuti, incluso il tessuto adiposo.
- Il tessuto adiposo rappresenta una ricca fonte di MSCs con caratteristiche di coltura favorevoli.
- Le MSCs hanno la capacità di differenziarsi in vari tipi cellulari, inclusi le cellule produttrici di insulina.
- Comprendere il processo di differenziamento può contribuire allo sviluppo di terapie per il diabete.
Scopo dello studio
- Isolare e caratterizzare le Ad-MSC provenienti dall'epididimo di ratto.
- Sviluppare un protocollo per differenziare queste cellule in IPC.
- Fornire un metodo affidabile per la ricerca futura in medicina rigenerativa.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di MSC derivati dal tessuto adiposo dal grasso epididimale del ratto.
- Caratterizzazione dei MSC isolati mediante marcatori standard.
- Induzione della differenziazione in cellule produttrici di insulina.
- Valutazione della funzionalità delle cellule produttrici di insulina dopo la differenziazione.
Risultati principali
- Isolamento riuscito di Ad-MSCs con marcatori di superficie caratteristici.
- Differenziamento dimostrato di Ad-MSCs in IPCs.
- La valutazione funzionale ha mostrato che gli IPCs sono in grado di secernere insulina.
- Il protocollo fornisce un metodo riproducibile per generare IPCs a partire da Ad-MSCs.
Conclusioni
- Gli Ad-MSC sono una fonte valida per generare cellule produttrici di insulina.
- Il protocollo può facilitare ulteriori ricerche sul trattamento del diabete.
- Studi futuri potrebbero esplorare il potenziale terapeutico di queste IPC.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Le cellule staminali mesenchimali derivate dal tessuto adiposo (Ad-MSCs) offrono una fonte rinnovabile e non controversa dal punto di vista etico per la generazione di cellule produttrici di insulina (IPCs) nella ricerca sul diabete. Il protocollo fornisce un metodo semplice e riproducibile per isolare e caratterizzare Ad-MSCs dal tessuto adiposo epididimale di ratto, seguito dalla differenziazione in IPCs mediante segnali biochimici definiti. Questo approccio supporta la validazione degli obiettivi e la riduzione del rischio meccanicistico nella fase iniziale della scoperta di terapie per le malattie metaboliche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi della multipotenza delle cellule staminali mesenchimali e del loro impegno verso il destino delle cellule beta pancreatiche.
- Valore operativo: Fornisce una fonte standardizzata di cellule staminali mesenchimali adipose con espressione confermata di CD90, CD73 e CD105 per esperimenti riproducibili.
- Valore scientifico: Supporta la validazione funzionale delle cellule produttrici di insulina mediante secrezione di insulina stimolata dal glucosio (GSIS) e colorazione con ditionite, confermando una funzionalità simile a quella delle cellule beta.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera cellule produttrici di insulina che esprimono fattori di trascrizione chiave delle cellule beta (Pdx-1, MafA, NKX6.1, Ins1) per l'uso in saggi di screening di composti.
- Valore operativo: Consente la produzione scalabile di cellule produttrici di insulina da cellule staminali mesenchimali adipose per la valutazione ad alto rendimento della dinamica di secrezione dell'insulina.
- Valore scientifico: Facilita la standardizzazione dei saggi attraverso protocolli di differenziamento costanti che utilizzano HG-DMEM, β-mercaptoetanolo, nicotinamide ed exendina-4.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Dimostra una rilevanza traslazionale producendo cellule produttrici di insulina (IPCs) che rispondono a stimoli glucidici con un aumento della secrezione di insulina.
- Valore operativo: Favorisce la continuità preclinica fornendo una fonte cellulare rinnovabile per test di dose-risposta e di efficacia nei modelli di diabete.
- Valore scientifico: Riduce il rischio biologico confermando la multipotenza attraverso differenziazione osteogenica, adipogenica e condrogenica prima dell’induzione in IPCs.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla validazione iniziale della proteina bersaglio all'identificazione del composto promettente fino alla valutazione preclinica, in particolare per terapie antidiabetiche mirate al ripristino o alla funzionalità delle cellule beta.
- Biologia della Scoperta Supporta il test di ipotesi sulla plasticità e sulla specificazione della linea cellulare delle cellule staminali mesenchimali utilizzando segnali definiti di differenziamento.
- Screening: Consente la produzione di IPC pronti per il saggio con output quantificabili, come i livelli di secrezione di insulina e l'espressione dei marcatori.
- Analitica: Fornisce endpoint misurabili, inclusi GSIS, colorazione con ditizona e qPCR per marcatori delle cellule beta, per confrontare le condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale Collega la generazione in vitro di IPC alla validazione preclinica mediante saggi funzionali di rilascio di insulina.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la generazione di cellule progenitrici insulari (IPCs) da fonti adipose in progetti multipli e linee cellulari.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Previsione affidabile nella generazione di IPC mediante caratterizzazione multilinaggio e validazione funzionale.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità dell'isolamento e differenziamento di Ad-MSC tra diversi laboratori.
- Valore strategico: Guida le decisioni di avanzamento o interruzione nello sviluppo precoce di terapie per il diabete, validando modelli cellulari della funzione delle cellule beta.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione basata sulla gestione del rischio negli approcci basati sulle cellule staminali per le patologie metaboliche.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di cellule staminali, nelle tecniche di differenziamento e nella citometria a flusso per l'immunofenotipizzazione.
- Necessita dell'accesso a centrifughe, armadi a flusso laminare, incubatrici e attrezzature per saggi di secrezione di insulina stimolata dal glucosio.
- Richiede la standardizzazione delle procedure di digestione, lavaggio e semina per garantire un rendimento costante della frazione vascolare stromale.
- Richiede l'adattamento dei tempi di differenziamento e delle concentrazioni dei reagenti quando si applica a diversi depositi adiposi o specie.
- Limitato dalla necessità di utilizzare cellule al passaggio 3-5 per garantire omogeneità e multipotenza prima dell'induzione del differenziamento.
