Name: Generazione ed espansione delle linee tumorali primarie e maligne del mesotelioma pleurico (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T12:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Scopri un metodo robusto per generare ed espandere linee tumorali primarie di mesotelioma pleurico da tessuto paziente. Questo protocollo riduce la contaminazione fibroblastica e permette studi approfonditi sulle interazioni tumore-sistema immunitario.

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Vorremmo ringraziare Raquel Laza-Briviesca per il suo contributo all'avvio di questo protocollo e i dottori Boris Sepesi, Reza Mehran e David Rice per la collaborazione sulle collezioni di tessuti. Non ci sono finanziamenti aggiuntivi associati a questo lavoro.

Tutti i metodi qui descritti sono stati approvati dall'Institution Review Board (IRB) dell'Università del Texas MD Anderson Cancer Center. Ciò riguarda i tumori MPM standard-of-care, resecati chirurgicamente, rimossi a seguito del consenso informato.
1. Preparazione dei mezzi di digestione tumorale e di altri mezzi associati
<ol><li>Per preparare i mezzi di digestione tumorale, aggiungere 5 ml di 100% Pen/Strep (Penicillina/Streptomicina) a 500 mL di mezzo sterile Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 in una cappa a flusso laminare.<ol>
<li>Trasferire il mezzo in un filtro sterile da 500 mL, 0,22 μm in polietersolfone (PES) per la filtrazione sotto vuoto. NOTA: le fasi di filtrazione e aspirazione devono essere eseguite con una pressione di vuoto standard di 75-150 torr.</li>
		<li>Etichettare e datare il mezzo di digestione del tumore e conservarlo a 4 °C. NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare il cocktail enzimatico che digerisce il tumore, aggiungere 2,5 mL di collagenasi al 3% di tipo 1, 1 mL di 1,5 mg/mL di ialuronidasi, 20 μL di 250.000 unità/mL di DNAse da 1 a 16,5 mL di mezzo di digestione in un tubo conico da 50 mL in una cappa a flusso laminare. NOTA: Il volume totale del cocktail enzimatico che digerisce il tumore è di 20 ml; tuttavia, sono necessari solo 10 ml per campione di tumore. Pertanto, il cocktail rimanente può essere conservato a -20 °C fino a quando necessario. Non ricongelare le aliquote.</li>
	<li>Per preparare il mezzo tumorale completo, aggiungere 5 mL di 100% Pen/Strep e 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.<ol>
<li>Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 500 mL, 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.</li>
		<li>Etichettare e datare il mezzo tumorale completo e conservarlo a 4 °C. NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare il mezzo sierico ridotto per la fame, aggiungere 5 mL di 100% Pen/Strep e 5 mL di FBS a 500 mL di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.<ol>
<li>Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 500 mL, 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.</li>
		<li>Etichettare e datare il mezzo a siero ridotto e conservarlo a 4 °C. NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare il mezzo di congelamento, aggiungere 5 mL di dimetilsolfossido (DMSO) a 45 ml di FBS in una cappa a flusso laminare.<ol>
<li>Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 50 ml e 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.</li>
		<li>Etichettare e datare cinque tubi conici da 15 mL.</li>
		<li>Trasferire 10 mL di mezzo di congelamento in ciascun tubo e conservare i tubi a -20 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare un mezzo privo di antibiotici per il test del micoplasma, aggiungere 50 ml di FBS a 500 ml di RPMI 1640 sterile in una cappa a flusso laminare.<ol>
<li>Trasferire il mezzo in un filtro sterile PES da 50 ml e 0,22 μm per la filtrazione sotto vuoto.</li>
		<li>Etichettare e datare il mezzo privo di antibiotici e conservarlo a 4 °C. NOTA: Il supporto può essere conservato per 1 mese a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per preparare il tampone di selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) per l'analisi fenotipica, aggiungere 16,6 ml di albumina sierica bovina sterile a 500 ml di soluzione salina sterile tamponata con 1x fosfato (PBS) in una cappa a flusso laminare.<ol>
<li>Etichettare e datare il buffer FACS e conservarlo a 4 °C. NOTA: il buffer FACS non richiede la sterilizzazione del filtro finché entrambi i componenti sono conservati sterili. Il buffer FACS può essere conservato prima dell'apertura per 6 mesi a 4 °C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Digestione del tessuto tumorale
<ol><li>Trasferire 10 ml di cocktail enzimatico che digerisce il tumore dalla fase 1.2 a un tubo di dissociazione.</li>
	<li>Trasferire il pezzo di tessuto tumorale in un coperchio sterile a 6 pozzetti usando un bisturi sterile. NOTA: La quantità di mezzo che viene trasferita con il tessuto tumorale è sufficiente per l'elaborazione.<ol>
<li>Rimuovere tutto il tessuto adiposo, il tessuto necrotico e / o i coaguli di sangue utilizzando un nuovo bisturi sterile e una pinza. NOTA: Il tessuto adiposo è normalmente di aspetto giallastro e semisolido. Il tessuto necrotico è più scuro del tessuto circostante in apparenza e molto morbido; sia il tessuto grasso che quello necrotico si rompono facilmente. Il tessuto sanguinante appare rosso vivo e può rilasciare sangue nel mezzo quando manipolato. Una volta rimosso, il tessuto tumorale risultante dovrebbe mantenere la forma ed essere pallido o rosa, a seconda del tipo di tessuto.</li>
		<li>Tagliare l'intero tessuto tumorale in 1 mm3 piccoli frammenti. Per garantire che il tessuto non si asciughi, aggiungere 500 μL di 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) sterile al tessuto tumorale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasferire frammenti tumorali nel tubo di dissociazione contenente 10 ml di cocktail enzimatico che digerisce il tumore (fase 2.1). Chiudere saldamente il tubo, posizionarlo con il cappuccio verso il basso sul dissociatore tissutale e aggiungere l'apparato riscaldante applicandolo come un manicotto sul tubo di dissociazione e premendo per fare clic per fare clic su di esso in posizione. NOTA: La capacità massima per ogni tubo è di 4 g di tumore e 10 ml di volume.</li>
	<li>Selezionare l'impostazione preprogrammata sul dissociatore 37C_h_TDK_1. Controllare lo stato dopo 10 minuti per assicurarsi che non vi sia alcun errore di intasamento come indicato dalla luce rossa lampeggiante. NOTA: questo programma lavora a 1.865 giri/min per 1 ora con temperatura accesa a 37 °C. NOTA: se si verifica l'intasamento, rimuovere il tubo di dissociazione e ruotarlo manualmente per rimuovere qualsiasi tessuto catturato nel coperchio; quindi sostituire il tubo sul dissociatore e riprendere il programma.</li>
	<li>Dopo la digestione di 1 ora, rimuovere il tubo di dissociazione e metterlo in una cappa a flusso laminare. Filtrare il tumore digerito posizionando un filtro a cellule da 70 μm sopra un tubo conico da 50 ml e pipettando il tumore digerito utilizzando una pipetta da 10 ml sul filtro. Se il filtro si intasa, passare a un nuovo filtro.<ol>
<li>Risciacquare il tubo di dissociazione con 10 ml di mezzi di digestione tumorale freschi e passare il lavaggio attraverso il filtro.</li>
		<li>Rimuovere il filtro da 70 μm ed eliminarlo.</li>
		<li>Portare il volume totale a 40 ml con mezzo di digestione tumorale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Centrifugare a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizzando una pipetta aspirante da 2 ml collegata a una fonte di vuoto, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet e risospescere le cellule utilizzando 10 mL di mezzo tumorale completo sterile.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 2.6.</li>
	<li>Aspirare il surnatante come descritto al punto 2.7. Risospesere le cellule in 3 mL di mezzo tumorale sterile completo e trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto di una piastra sterile a 6 pozzetti.</li>
	<li>Tenere la piastra in un'incubatrice a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo 24 ore, trasferire il mezzo usato dal tumore digerito in ben 1 a un nuovo pozzo (bene 2) nella stessa piastra a 6 pozzetti. Aggiungere 3 ml di terreno tumorale completo sterile al pozzo 1.</li>
	<li>Trasferire il mezzo usato dai pozzetti 1 e 2 e combinarlo nel pozzo 3 nella stessa piastra a 6 pozzetti 24 ore dopo il passaggio 2.11. Aggiungere 3 ml di mezzo tumorale completo sterile nei pozzetti 1 e 2.</li>
	<li>Aspirare il mezzo da tutti e 3 i pozzetti e pipettare 3 mL di mezzo tumorale completo in ciascun pozzetto 48 ore dopo il passaggio 2.12.</li>
</ol>3. Generazione della linea cellulare tumorale primaria
<ol><li>Utilizzando un microscopio a fase invertita, determinare la percentuale di contaminazione da fibroblasti nella coltura di passaggio precoce. NOTA: I fibroblasti sono generalmente lunghi e irregolari e hanno una membrana cellulare mal definita. Appaiono sottili o piatti su una scala Z.<ol>
<li>Se la contaminazione dei fibroblasti è superiore al 20% delle cellule nella coltura a passaggio precoce, continuare la coltura dopo aver sostituito il mezzo completo con un mezzo sierico ridotto.</li>
		<li>Ripetere la sostituzione con mezzo sierico ridotto nel passaggio 3.1.1 due volte a settimana per 3-4 settimane.</li>
		<li>Quando la coltura raggiunge l'80% di confluenza, passare le cellule dividendo 50:50 in 2 nuovi pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Continuare a passare 50:50 in mezzi sierici ridotti una volta che le cellule raggiungono l'80% di confluenza.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 3.1.3 per un massimo di 4 settimane, passando in palloni di coltura più grandi secondo necessità dividendo 50:50 una volta che la coltura raggiunge l'80% di confluenza. Se la popolazione di fibroblasti non è ridotta al 10% o meno, continuare al passo 3.2 per tentare il metodo di tripsinizzazione differenziale per rimuovere la contaminazione da fibroblasti. In caso contrario, procedere al passaggio 3.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per arricchire le cellule tumorali, sciacquare delicatamente il pozzetto con 1x PBS per rimuovere il siero contenente il mezzo.<ol>
<li>Aggiungere la tripsina come segue: 1 mL per pozzetto se in una piastra a 6 pozzetti, 2 mL per un matraccio T25, 3 mL per un pallone T75.</li>
		<li>Posizionare la piastra o il matraccio a 6 pozzetti in un'incubatrice a 37 °C per 1 minuto. Rimuovere la piastra o il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le cellule sono parzialmente sollevate o galleggianti, rimuovere delicatamente le cellule sospese e solo la tripsina. Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 ml contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo. NOTA: questa raccolta parziale di celle basata sulle proprietà di adesione è la prima di più frazioni.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 3.2.1 e 3.2.2 fino a quando tutte le celle non vengono sollevate o vengono rimosse 4 frazioni.</li>
		<li>Centrifugare tutte le frazioni indipendenti a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare il surnatante come descritto nel passaggio 2.7 e risospesare le cellule utilizzando 5 mL di terreno sterile a ridotto siero.</li>
		<li>Placcare le celle in un matraccio T25 per ogni frazione e porre i palloni in un'incubatrice a 37 °C.</li>
		<li>Valutare la coltura dopo 48 ore per determinare quale frazione è arricchita per le cellule tumorali rispetto ai fibroblasti. Scartare i palloni ricchi di fibroblasti. Se la contaminazione da fibroblasti è <10%, continuare l'espansione nel mezzo tumorale completo e procedere alla fase 4. Se la contaminazione da fibroblasti è del 10-30%, ripetere i passaggi 3.1.2-3.1.4. Se la contaminazione dei fibroblasti è superiore al 30%, ripetere i passaggi 3.2-3.2.7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Se pochi o nessun fibroblasto viene rilevato all'interno della coltura di passaggio precoce, continuare a passare le cellule in mezzo tumorale completo dividendo 50:50 una volta che le cellule sono confluenti all'80% nella loro piastra o pallone a 6 pozzetti.</li>
</ol>4. Espansione della linea cellulare tumorale primaria a passaggio precoce
<ol><li>Una volta che la coltura tumorale primaria contiene il 10% o meno di contaminazione da fibroblasti, aspirare il mezzo e sostituirlo con un mezzo tumorale completo sterile due volte a settimana. NOTA: il volume medio ottimale per un T25 è di 5 ml; T75 è di 12 ml; T150 è di 25 ml.<ol>
<li>Passare la coltura 50:50 in palloni più grandi secondo necessità una volta raggiunta l'80% di confluenza nel piatto o nel pallone. NOTA: potrebbe essere necessario passare la coltura a un rapporto più elevato a seconda della sua crescita. Regola in modo che la cultura raggiunga l'80% di confluenza ogni 3-5 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Passaggio fino a quando la cultura è al passaggio 4 o superiore. Una volta che la coltura è confluente all'80% in un minimo di due palloni T75, continuare con la fase 5.</li>
</ol>5. Caratterizzazione e banking di linee cellulari tumorali primarie consolidate
<ol><li>Crioconservare un pallone T75 come congelamento a passaggio precoce. Per il test del micoplasma dei restanti palloni T75, continuare con il punto 5.2.<ol>
<li>Per la crioconservazione delle cellule a passaggio precoce, scongelare 1 tubo di terreno di congelamento aliquotato preparato nella fase 1.5.</li>
		<li>Raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione lavando prima la piastra con 1x PBS come descritto nel passaggio 3.2 e aggiungendo tripsina come descritto nel passaggio 3.2.1.</li>
		<li>Mettere il matraccio in un'incubatrice a 37 °C per 3 minuti. Rimuovere il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le cellule si sollevano o galleggiano, rimuovere delicatamente le cellule sospese e la tripsina. Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 ml contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo. NOTA: Se le cellule rimangono aderenti dopo 3 minuti, riposizionare il pallone nell'incubatrice per altri 2 minuti.</li>
		<li>Mescolare bene il tubo pipettando delicatamente e rimuovere 20 μL per il conteggio.</li>
		<li>Centrifugare il tubo a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Mentre le cellule girano, contare utilizzando un protocollo di conteggio specifico per il laboratorio come il blu di tripano o l'acridina arancione / ioduro di propidio (AO / PI).</li>
		<li>Risospesere le cellule dopo centrifugazione in mezzo di congelamento con un minimo di 2 × 106 celle/1 mL di terreno di congelamento.</li>
		<li>Trasferire 1 mL della sospensione cellulare dal punto 5.1.7 a crioviali premarcati da 1,5 mL.</li>
		<li>Posizionare i criocerali in una camera di congelamento a velocità controllata e trasferirli immediatamente a -80 °C.</li>
		<li>Conservare le celle a -80 °C per un massimo di 1 settimana prima di trasferirle in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.</li>
	</ol></li>
	<li>Dividere un pallone T75 50:50 per il test del micoplasma. Cambiare il mezzo in mezzo privo di antibiotici preparato nel passaggio 1.6.<ol>
<li>Dopo 72 ore, scongelare il reagente di rilevamento del micoplasma, il substrato e i controlli a temperatura ambiente per 15 minuti prima del test.</li>
		<li>Raccogliere 1 mL del surnatante da ogni coltura da testare e posizionarlo in un tubo conico da 15 mL.</li>
		<li>Pellet le celle sospese centrifugando il surnatante a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Caricare 100 μL di supernatanti campione e controlli in una piastra bianca a 96 pozzetti. Aggiungere 100 μL di reagente per il rilevamento del micoplasma a ciascun campione e controllo.</li>
		<li>Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Posizionare la piastra in un lettore di piastre e leggere la luminescenza (lettura A, cioè prima lettura). NOTA: il protocollo del produttore del kit mycoplasma indica il mantenimento delle impostazioni predefinite sui lettori di piastre multifunzionali. La lettura è impostata sull'endpoint di luminescenza con un tempo di integrazione di 1 s e un guadagno di 135. Il lettore di piastre utilizza una routine di scalabilità automatica per ottimizzare il segnale di guadagno per ogni esperimento. Il tempo di integrazione di 1 s è predefinito standard. Entrambe le impostazioni vengono utilizzate per regolare l'intensità del segnale luminescente interpretato dal lettore di piastre e potrebbe essere necessario regolarle in base al singolo lettore di piastre.</li>
		<li>Rimuovere la piastra dal lettore di piastre e aggiungere 100 μL del substrato di rilevamento del micoplasma a ciascun campione e ai controlli.</li>
		<li>Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Posizionare la piastra nel lettore di piastre e leggere la luminescenza (lettura B, cioè seconda lettura).</li>
		<li>Per determinare la positività al micoplasma, determinare il rapporto tra la lettura B e la lettura A. NOTA: i rapporti di positività del micoplasma sono descritti nel protocollo del produttore del kit mycoplasma. Le letture A e B vengono acquisite con le stesse impostazioni e riflettono semplicemente l'ordine di lettura.<ol>
<li>Si consideri un rapporto < 1 come micoplasma-negativo.</li>
			<li>Considerare un rapporto di 1-1,2 come inconcludente e ripetere il passaggio 5.2.</li>
			<li>Considerare un rapporto > 1,2 per essere micoplasma-positivo e monitorare questa coltura; terminare la lingua, se necessario.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Caratterizzazione della citometria a flusso di cellule tumorali micoplasma-negative<ol>
<li>Rimuovere le cellule tumorali utilizzando il tampone di dissociazione cellulare.</li>
		<li>Contare le celle e risospesce le celle a 1 × 106/mL nel buffer FACS dal passaggio 1.7.</li>
		<li>Rimuovere 100 μL di sospensione cellulare in singoli tubi per la colorazione superficiale.</li>
		<li>Centrifugare a 500 × g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare il surnatante e bloccare i recettori Fc incubando le cellule in 500 μL di siero di capra al 5% in tampone FACS a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 2 mL di tampone FACS e centrifugare la sospensione a 500 × g per 5 minuti a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare il surnatante e aggiungere la miscela superficiale di anticorpi (Tabella 1) e tampone FACS in modo che il volume finale sia di 100 μL. Coprire i campioni e macchiarli sul ghiaccio per 30 minuti.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 5.3.6.</li>
		<li>Aspirare il surnatante e fissare le cellule riesuscendo in 200 μL di paraformaldeide (PFA) all'1% più 0,25% di EtOH. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti con i campioni al riparo dalla luce.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 5.3.6. Risospesare le cellule in 200 μL di tampone FACS per l'acquisizione utilizzando un citometro a flusso appropriato. NOTA: Le cellule tumorali del mesotelioma dovrebbero essere positive per mesotelina e N-caderina. Alcuni possono anche esprimere CD90.</li>
	</ol></li>
	<li>Espandere nel mezzo tumorale completo e nella banca come descritto nei passaggi 4.1 e 5.1, rispettivamente.</li>
</ol>

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</ol>

CH è membro del SAB for Briacell Therapeutics e della Mesothelioma Applied Research Foundation. Tutti gli altri autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre questo protocollo è semplice, ci sono alcuni passaggi critici che devono essere seguiti da vicino. Il congelamento del passaggio precoce è importante per preservare la capacità di ripetere il processo di arricchimento delle cellule tumorali se inizialmente non ha successo. La capacità di valutare la contaminazione fibroblastica ad occhio per decidere la corretta tecnica di scissione e fame dei media è vitale per prevenire la crescita eccessiva dei fibroblasti nella coltura. Inoltre, il metodo di tripsinizzazione d...

Il mesotelioma pleurico maligno (MPM) è un tumore raro altamente associato all'esposizione all'amianto. Sebbene gli approcci basati sull'immunoterapia abbiano mostrato risultati incoraggianti, c'è una scarsità di opzioni di trattamento disponibili per i pazienti che sviluppano questa malattia e il tasso di sopravvivenza complessivo a 5 anni è basso 1,2. Sono in corso sforzi in più istituzioni per comprendere meglio questa malattia e identificare nuovi bersagli terapeutici che possono migliorare i risultati dei pazienti. Mentre ci sono più modelli murini di mesotelioma, l'accesso alle cellule tumorali del mesotelioma primario è più limitato3. L'espansione in vitro delle cellule tumorali del mesotelioma primario fornirebbe un prezioso sistema modello che può essere utilizzato per studiare direttamente le cellule tumorali e la loro interazione con le cellule immunitarie autologhe come i linfociti infiltranti il tumore. Mentre ci sono state segnalazioni sull'espansione delle linee di cellule tumorali del mesotelioma primario, queste sono poche e non forniscono una procedura operativa standard dettagliata (SOP). Inoltre, poche linee cellulari sono disponibili da fonti commerciali come American Type Culture Collection (ATCC). Mentre la disponibilità di linee tumorali primarie è limitata, è stato dimostrato che le cellule tumorali possono essere espanse da versamenti pleurici e direttamente dal tessuto tumorale 4,5. Inoltre, le linee cellulari tumorali espanse hanno dimostrato di preservare il profilo molecolare del tumore originale 4,5,6.
Il nostro laboratorio sta studiando il microambiente immuno-tumorale del MPM e ha sviluppato un metodo per espandere le linee primarie di cellule tumorali MPM da casi resecati chirurgicamente. Questo metodo è adattato dalla nostra esperienza nello stabilire linee cellulari tumorali di melanoma metastatico primario. L'obiettivo di questo lavoro è quello di fornire un approccio dettagliato e pratico all'espansione della linea tumorale del mesotelioma primario utilizzando un sistema di modelli 2D e la successiva profilazione fenotipica. Dato il recente successo delle strategie di blocco dei checkpoint mirate a CTLA4 e PD-1 nell'impostazione di prima linea2, la capacità di generare molte linee tumorali primarie potrebbe favorire la comprensione di entrambi i meccanismi intrinseci di resistenza del tumore e fornire un importante sistema modello per valutare il riconoscimento delle cellule T, approfondendo così la nostra comprensione della risposta immunitaria nel MPM.
Il principale limite di questo protocollo è che ogni tumore contiene un microambiente diverso e c'è un alto grado di variabilità del successo dell'espansione. Inoltre, questo metodo seleziona le cellule tumorali che possono espandersi in un sistema di coltura 2D. Altri metodi che prevedono la produzione di una coltura sferoide o organoide 3D potrebbero fornire un approccio alternativo che potrebbe consentire un più alto tasso di successo di espansione o comportare la capacità di derivare linee cellulari che non sono in grado di espandersi in un sistema 2D tradizionale. Tali colture 3D hanno dimostrato di essere utili per la generazione di tipi di tumore che sono difficili da espandere, ad esempio il cancro del pancreas7.

<table><tbody><tr><td>Pipette sierologiche da 10 mL</td><td>BD Falcon</td><td>357551</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 15 mL</td><td>BD</td><td>Falcon 352097</td><td></td></tr><tr><td>Pipette ad aspirazione da 2 mL BD</td><td>Falcon</td><td>357558</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche da 5 mL BD</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>Provette coniche da 50 mL</td><td>BD Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>micropiastre a 6 pozzetti, coltura tissutale trattato</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>AT104</td><td>Una miscela proteasi-collagenasi considerata più efficace nella conservazione degli epitopi per la citometria a flusso.</td></tr><tr><td>anti-CD325 (N-Caderina) PE</td><td>Invitrogen</td><td>12-3259-42</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD90 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>561558</td><td></td></tr><tr><td>anti-Mesothelin APC</td><td>Miltenyi</td><td>130-118-096</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina 30%</td><td>Sigma</td><td>A8577-1L</td><td></td></tr><tr><td>Tampone di dissociazione cellulare, privo di enzimi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13151014</td><td></td></tr><tr><td>Cell filtro (70 &micro; m)</td><td>Centrifuga Greiner Bio-One</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>con adattatori da 15 mL e 50 mL Collagenasi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>di tipo 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-0130</td><td>Sciogliere 1,5 g di collagenasi di tipo I in 100 mL di DMEM sterile e aliquotare in volumi da 5 mL. Etichettare bene e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Camera di congelamento a velocità controllata</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-350-50</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>5000-0020</td><td></td></tr><tr><td>CulturPlate-96</td><td>Packard Instrument Company</td><td>6005680</td><td>Micropiastra bianca opaca a 96 pozzetti.</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNAsi I (da pancreas bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>Aliquot a 50 &mu; L, etichettare bene e conservare a -20 °C. Dopo lo scongelamento, mantenere a 4 gradi C per un massimo di 1 mese.</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1x</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo 200 proof</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4094</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubi-filtro superiore</td><td>BD Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C-tubes</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Octo-dissociator con apparecchio di riscaldamento</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-427</td><td>Include manicotti specializzati per apparecchi di riscaldamento utilizzati per applicare calore ai tubi C durante la dislocazione.</td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td>Aliquot e conservare a -20 &deg;C.</td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata di Hank, 500 mL</td><td>di Corning</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Sciogliere 0,15 g di ialuronidasi in 100 ml di DMEM sterile e distribuire in aliquote da 1,0 ml. Etichettare bene e conservare a -20 °C.</td></tr><tr>Microscopio <td></td><td></td><td></td><td>a fase invertita</td></tr><tr>Cappa <td></td><td></td><td></td>a<td>flusso laminare</td></tr><tr><td>Colorante giallo vivo/morto</td><td>Life Technologies</td><td>L-34968</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per micropipettatore, 20 &; L</td><td>ART</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Micropipettatore, 0,5-20 &; </td><td></td><td></td><td></td>L</tr><tr><td>Set di controllo del test Mycoalert</td><td>Lonza</td><td>LT07-518</td><td>Aliquot controlli positivi e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Kit di rilevamento del micoplasma Mycoalert Plus</td><td>Lonza</td><td>LT07-710</td><td>Aliquotare il reagente e il substrato e conservare a -20 °C. Conservare il tampone e l'aliquota rimanenti per il controllo negativo e conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Paraformaldeide 16%</td><td>Microscopia Elettronica Scienze</td><td>15710</td><td>Preparare il materiale filtrando attraverso un filtro per siringa in PVDF (Millex cat. n. SLVV033RS) e aliquotare sotto cappa aspirante. Conservare a -20 °C.</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina 10.000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Aiuto per</td><td></td><td></td><td></td>pipette</tr><tr><td>Lettore di piastre con capacità luminescenti</td><td>BioTek</td><td>Synergy HT</td><td>qualsiasi lettore di piastre con queste specifiche può essere utilizzato</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Bisturi</td><td>Andwin</td><td>2975#21</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di filtrazione sottovuoto sterile Stericup Quick Release-GP, 0,22 & micro; m PES Express PLUS, 500 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>filtro Steriflip-GP, 0,22 & micro; m PES Express PLUS, 50 mL</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Pinze sterili</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-000-157</td><td></td></tr><tr><td>Palloni T25, palloni</td><td>Corning</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>T75 trattati con coltura tissutale, Corning</td><td></td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu 0,4%</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,05% </td><td>Corning</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>ViaStain soluzione di arancio/ioduro di propidio (AO/PI)</td><td>Nexcelom</td><td>CS2-0106-5ML</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione ed espansione delle linee tumorali primarie e maligne del mesotelioma pleurico

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Mancano le attuali metodologie per l'espansione delle linee cellulari tumorali primarie da tipi di tumore rari. Questo protocollo descrive i metodi per espandere le cellule tumorali primarie dal mesotelioma pleurico maligno (MPM) resecato chirurgicamente fornendo una panoramica completa del processo dalla digestione all'arricchimento, all'espansione, alla crioconservazione e alla caratterizzazione fenotipica. Inoltre, questo protocollo introduce concetti per la generazione di tumori che possono essere utili per più tipi di tumore come la tripsinizzazione differenziale e l'impatto dei metodi di dissociazione sulla rilevazione di marcatori di superficie cellulare per la caratterizzazione fenotipica. Il principale limite di questo studio è la selezione di cellule tumorali che si espanderanno in un sistema di coltura bidimensionale (2D). Variazioni a questo protocollo, inclusi sistemi di coltura tridimensionali (3D), integratori di supporti, rivestimento di piastre per migliorare l'adesione e metodi di disaggregazione alternativi, potrebbero migliorare questa tecnica e il tasso di successo complessivo della creazione di una linea tumorale. Nel complesso, questo protocollo fornisce un metodo di base per stabilire e caratterizzare le cellule tumorali da questo raro tumore.

Per determinare la contaminazione dei fibroblasti delle colture a passaggio precoce, le cellule vengono valutate utilizzando un microscopio a fase invertita per identificare la frequenza dei fibroblasti rispetto alle altre cellule aderenti presenti. La Figura 1 mostra esempi di aumento della contaminazione da fibroblasti dell'80% (Figura 1A), del 50% (Figura 1B) e del 30% (Figura 1C), rispetto a una col...

L'obiettivo di questo documento di metodo è dimostrare una metodologia robusta e riproducibile per l'arricchimento, la generazione e l'espansione di linee cellulari tumorali primarie da mesotelioma pleurico resecato chirurgicamente.

Generazione ed espansione delle linee tumorali primarie e maligne del mesotelioma pleurico

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

Questo protocollo fornisce una base per l'espansione delle cellule tumorali che, a sua volta, consente uno studio approfondito della funzione delle cellule tumorali e degli stati genomici. Inoltre, fornisce un sistema modello in vitro per valutare l'impatto del tumore sulla risposta immunitaria. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un protocollo basato per stabilire linee tumorali mesoteliali dal tessuto del paziente.Attualmente non esiste un protocollo standardizzato per questo sistema modello. L'aspetto più difficile di questa tecnica è la presenza di contaminazione da fibroblasti nelle colture di passaggio precoce. È fondamentale avere una solida comprensione dei fibroblasti rispetto alla morfologia delle cellule tumorali per determinare se i tentativi di fame dei fibroblasti stanno funzionando.Inizia trasferendo 10 millilitri di cocktail enzimatico di digestione del tumore in un tubo di dissociazione. Trasferire il pezzo di tessuto tumorale in un coperchio sterile a sei pozzetti usando un bisturi sterile. Rimuovere tutti i tessuti necrotici grassi e coaguli di sangue utilizzando un nuovo bisturi sterile e una pinza.Tagliare l'intero tessuto tumorale in piccoli frammenti di un millimetro cubo. Per garantire che il tessuto non si secchi, aggiungere 500 microlitri di soluzione sterile hank's balanced salt, o HBSS, al tessuto tumorale. Trasferire frammenti tumorali nel tubo di dissociazione contenente 10 millilitri di cocktail enzimatico di digestione del tumore.Chiudere saldamente il tubo. Posizionare il cappuccio rivolto verso il basso sul dissociatore tissutale e fornire calore al dissociatore. Selezionare l'impostazione pre-programmata sul dissociatore per l'impostazione 1 del kit di dissociazione del tumore umano a 37 gradi Celsius e controllare lo stato dopo 10 minuti per assicurarsi che nessun errore di intasamento sia indicato dalla luce rossa lampeggiante.Dopo un'ora, rimuovere il tubo di dissociazione e metterlo in una cappa a flusso laminare. Filtrare il tumore digerito posizionando un filtro cellulare da 70 micrometri su un tubo conico da 50 millilitri e pipettando il tumore digerito usando una pipetta da 10 millilitri sul filtro. Se il filtro si intasa, passare a un nuovo filtro.Risciacquare il tubo di dissociazione con 10 millilitri di mezzi di digestione tumorale freschi e lavare attraverso il filtro. Rimuovere e scartare il filtro. Portare il volume totale a 40 millilitri con il mezzo di digestione del tumore.Centrifugare a 500 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta aspirante da due millilitri collegata a una fonte di vuoto, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet e risospescere le cellule usando 10 millilitri di mezzo tumorale sterile. Quindi, di nuovo, centrifugare i tubi e aspirare il surnatante come dimostrato.Successivamente, risospese le cellule in tre millilitri di terreno tumorale sterile e trasferire la sospensione cellulare in un pozzo di una piastra sterile a sei pozzetti. Tenere la piastra in un'incubatrice a 37 gradi con il 5% di anidride carbonica. Dopo 24 ore, trasferire il mezzo usato dal tumore digerito in un pozzo uno a un nuovo pozzo nella stessa piastra a sei pozzetti, quindi aggiungere tre millilitri di mezzo tumorale sterile a uno bene.Utilizzando un microscopio a fase invertita, determinare la percentuale di contaminazione da fibroblasti nella coltura di passaggio precoce. Se la contaminazione dei fibroblasti è superiore al 20% delle cellule nella coltura di passaggio precoce, continuare la coltura dopo aver sostituito il mezzo tumorale con il mezzo sierico ridotto. Se la popolazione di fibroblasti non è ridotta al 10% o meno, sciacquare delicatamente il pozzetto con PBS per rimuovere il siero contenente il mezzo.Aggiungere un millilitro di tripsina per pozzetto in un piatto a sei pozzetti. Posizionare la piastra o il pallone a sei pozzetti in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per un minuto. Rimuovere la piastra o il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito.Quando le cellule sono parzialmente sollevate o galleggianti, rimuovere delicatamente le cellule sospese e solo la tripsina. Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo. Ripetere la tripsinizzazione fino a quando non vengono rimosse tre o quattro frazioni.Centrifugare tutte le frazioni indipendenti a 500 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pipetta aspirante da due millilitri collegata a una fonte di vuoto, aspirare il surnatante senza disturbare il pellet. Risospese le cellule utilizzando cinque millilitri di mezzo sierico sterile ridotto.Placcare le celle in un matraccio T-25 per ogni frazione e posizionare i palloni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius. Per la crioconservazione delle cellule di passaggio precoce, scongelare un tubo di terreno di congelamento aliquotato. Raccogliere le cellule per tripsinizzazione lavando prima la piastra con PBS e aggiungendo tripsina come dimostrato in precedenza.Mettere il pallone in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per tre minuti. Rimuovere il pallone dall'incubatrice e controllare l'adesione delle cellule utilizzando un microscopio invertito. Se le cellule si sollevano o galleggiano, rimuovere delicatamente le cellule sospese e la tripsina.Posizionare le cellule in un tubo conico da 15 millilitri contenente un volume uguale o maggiore di mezzo tumorale completo. Mescolare il contenuto del tubo pipettando delicatamente. Rimuovere 20 microlitri di sospensione cellulare per il conteggio.Quindi centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 500 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Quando le cellule girano, contare utilizzando un protocollo di conteggio specifico di laboratorio, come il tripano blu o l'acridina arancione / ioduro di propidio. Risospese le cellule dopo centrifugazione in mezzo di congelamento con un minimo di 5 x 10 alla sesta cella per millilitro di mezzo di congelamento e trasferire un millilitro di questa sospensione cellulare a 1,5 millilitri pre-marcati di crioviali.Posizionare i crioviali in una camera di congelamento a velocità controllata e trasferirli immediatamente a meno 80 gradi Celsius. La figura mostra un aumento della contaminazione da fibroblasti dell'80%50% e del 30% rispetto a una coltura senza contaminazione da fibroblasti. Questa figura mostra la colorazione rappresentativa della superficie della citometria a flusso di quattro linee tumorali primarie del mesotelioma, MESO171, MESO176, NCIH2452, MS TO-211H e una linea tumorale del melanoma, MEL526 come controllo negativo.Queste linee cellulari possono esprimere sia mesotelina che N-caderina. L'importanza di testare l'impatto del distacco enzimatico sull'espressione dei marcatori proteici di superficie è anche dimostrata in quanto sia la tripsina che la miscela di proteasi collagenasi hanno provocato la perdita dell'espressione superficiale di N-caderina, mentre CD90 non è stato influenzato. I passaggi importanti includono la corretta elaborazione del tumore, compresa la rimozione di sangue e grassi prima della digestione, l'identificazione della contaminazione dei fibroblasti e la determinazione di come limitare la crescita eccessiva dei fibroblasti è vitale.Un metodo importante che segue questa procedura include saggi citotossici dei linfociti per testare la capacità delle cellule T autologhe di riconoscere le cellule tumorali derivate dal paziente. Questa tecnica identificherà nuovi recettori delle cellule T antitumorali specifici che potrebbero essere di importanza terapeutica. Inoltre, ci permetterà di studiare l'interazione tra tumore e tumore accoppiato che infiltra i linfociti e la disfunzione immunitaria.

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Ricerca sul cancro

Il saggio di liquidazione mesoteliali qui descritto si avvale di cellule fluorescente e microscopia time-lapse video visualizzare e misurare quantitativamente le interazioni di sferoidi multicellulari di cancro ovarico e monostrati di cellule mesoteliali. Questo saggio modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico.

In vitro test Clearance mesoteliali che modella i primi passi di metastasi del cancro ovarico

Questo video dimostra un metodo per generare un modello murino di disseminazione pleurica iniettando una sospensione di cellule tumorali polmonari nella cavità toracica di un topo immunodeficiente.

Stabilire un modello murino di carcinoma polmonare pleurico disseminato

L'obiettivo di questo protocollo è studiare la tumorigenesi mammaria. Con questa tecnica, i tumori mammari di topo vengono rimossi e le cellule primarie vengono preparate dai tumori. È incluso un protocollo di estrazione polmonare per lo studio delle metastasi polmonari. Inoltre, è incluso un altro protocollo per l'analisi dei fibroblasti embrionali di topo dall'embrione di topo.

Tumore primario e isolamento delle cellule MEF per studiare Lung Metastasi

La generazione di un modello di ratto ortotopico di pleurico mesotelioma maligno da impianto di II-45 cellule di mesotelioma nella cavità pleurica di topi immunocompetenti è presentato. Metodo citometria di flusso per analizzare sette sottoinsiemi di cellule immunitarie di questi animali da un campione di sangue di 25 ml è anche descritto.

Ortotopico impianto e periferico immunitario monitoraggio cellulare nel Modello II-45 Singenico Rat mesotelioma

Presentiamo qui un metodo di coltura cellulare per indurre transizioni mesenchimali-epiteliale (MET) in cellule di sarcoma basato su espressione ectopica combinata di microRNA-200 familiari e grainyhead-like 2 (GRHL2). Questo metodo è adatto per una migliore comprensione dell'impatto biologico della plasticità fenotipica sull'aggressività cancro e trattamenti.

Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma

L'obiettivo di questo articolo è di fornire una descrizione dettagliata del protocollo per il dosaggio di metastasi polmonare (PuMA). Questo modello permette ai ricercatori di studiare la crescita delle cellule di osteosarcoma metastatico (OS) nel tessuto del polmone usando un widefield fluorescenza o il microscopio confocale a scansione laser.

Considerazioni pratiche nello studio di colonizzazione del polmone metastatico nell'Osteosarcoma usando l'analisi di metastasi polmonare

Descriviamo un metodo per migliorare in modo significativo orthotopic engraftment delle cellule di cancro del polmone nei polmoni murini di pre-condizionamento delle vie aeree con la ferita. Questo approccio può essere applicato anche per studiare le interazioni stroma all'interno del microambiente polmonare, la disseminazione metastatica, la co-morbidità, cancro del polmone, e per generare in modo più efficiente paziente derivato xenotrapianti.

Pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina aumenta l'efficienza di Orthotopic del polmone cancro Engraftment delle cellule

Il seguente protocollo si concentra sulla creazione di una coltura primaria di sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato (STS). Questo modello potrebbe aiutarci a comprendere meglio le priorità bassa molecolare e il profilo farmacologico di queste malignità rare e potrebbe rappresentare un punto di partenza per ulteriori ricerche finalizzate a migliorare la gestione di STS.

Istituzione di una coltura primaria di Sarcoma dei tessuti molli paziente-derivato

Qui, presentiamo un protocollo per generare un modello di pelle 3D organotipiche melanoma sferoide che ricapitola sia l'architettura e pluricellulari complessità di un organo/del tumore in vivo ma allo stesso tempo accomoda sistematica sperimentale intervento.

Un modello di pelle sferoide 3D Organotypic Melanoma

Il protocollo attuale descrive i metodi per stabilire modelli di xenotrapianto (PDX) derivati dal paziente e linee cellulari tumorali primarie da campioni di cancro gastrico chirurgico. I metodi forniscono uno strumento utile per lo sviluppo di farmaci e la ricerca sulla biologia del cancro.

Stabilimento di modelli Xenograft derivati dal paziente derivato dal paziente e linee cellulari primarie

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