Name: Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine con tag eGFP (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-01-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Scopri metodi non invasivi per localizzare proteine di membrana nei fotorecettori di Drosophila utilizzando proteine GFP. Questa tecnica consente di studiare il trasporto proteico e la degenerazione retinica, offrendo approfondimenti sulle malattie ereditarie della cecità umana.

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Vorremmo ringraziare i nostri studenti ricercatori nel corso degli anni. In particolare, Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim e Laura Jaggy, i cui dati sono stati utilizzati in questo protocollo come risultati rappresentativi. La ricerca del nostro gruppo qui presentata è stata finanziata da sovvenzioni della Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) ad Armin Huber.

<ol><li>Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+protein+trafficking+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration.+9%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of protein trafficking in neurodegeneration.</a> Molecular Neurodegeneration. 9. 9, 31(2014).</li>
<li>Schopf, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+trafficking+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells.</a> European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).</li>
<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+photoreceptor+array+of+the+dipteran+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The photoreceptor array of the dipteran retina.</a> Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).</li>
<li>Wang, T., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+and+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+-+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila.</a> Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).</li>
<li>Xiong, B., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin+homeostasis+and+retinal+degeneration%3A+lessons+from+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly.</a> Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).</li>
<li>Bähner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-regulated+subcellular+translocation+of+Drosophila+TRPL+channels+induces+long-term+adaptation+and+modifies+the+light-induced+current%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current.</a> Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).</li>
<li>Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+stages+of+light-dependent+TRPL-channel+translocation+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).</li>
<li>Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+translocation+of+the+eGFP-tagged+TRPL+channel+in+Drosophila+photoreceptors+requires+activation+of+the+phototransduction+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade.</a> Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).</li>
<li>Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+TRPL+ion+channel+shares+a+Rab-dependent+translocation+pathway+with+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin.</a> European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).</li>
<li>Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipase+D+and+retromer+promote+recycling+of+TRPL+ion+channel+via+the+endoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum.</a> Traffic. , (2021).</li>
<li>Franceschini, N., Kirschfeld, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Les+ph%C3%A9nom%C3%A9nes+de+pseudopupille+dans+l%27oeil+compose+de+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Kybernetik%22%5BJournal%5D)">Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila.</a> Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).</li>
<li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128 (6), 815-826 (2001).</li>
<li>Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+fluorescent+proteins+for+functional+dissection+of+the+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).</li>
<li>Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2005).</li>
<li>Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+eGFP-based+genetic+screen+for+defects+in+light-triggered+subcelluar+translocation+of+the+Drosophila+photoreceptor+channel+TRPL%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL.</a> Fly. 2 (1), 36-46 (2008).</li>
<li>Zheng, L., Carthew, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lola+regulates+cell+fate+by+antagonizing+Notch+induction+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye.</a> Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).</li>
<li>Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+cytoplasmic+DEAD+box+helicase+Dbp21E2+in+rhodopsin+maturation+and+photoreceptor+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability.</a> Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).</li>
<li>Huang, Y., Xie, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fluorescence-based+genetic+screen+to+study+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila.</a> PloS One. 10 (12), 0144925(2015).</li>
<li>Zhao, H., Wang, J., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+V-ATPase+V1+subunit+A1+is+required+for+rhodopsin+anterograde+trafficking+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila.</a> Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).</li>
<li>Xiong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER+complex+proteins+are+required+for+rhodopsin+biosynthesis+and+photoreceptor+survival+in+Drosophila+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice.</a> Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).</li>
<li>Zhao, H., Wang, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PE+homeostasis+rebalanced+through+mitochondria-ER+lipid+exchange+prevents+retinal+degeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila.</a> PLoS Genetics. 16 (10), 1009070(2020).</li>
<li>Cerny, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+GTP-+and+phospholipid-binding+protein+TTD14+regulates+trafficking+of+the+TRPL+ion+channel+in+Drosophila+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells.</a> PLoS Genetics. 11 (10), 1005578(2015).</li>
<li>Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22University+of+Karlsruhe+%28TH%29%22">University of Karlsruhe (TH)</a>. , Karlsruhe. (2007).</li>
<li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).</li>
<li>Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+phosphoinositides+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors.</a> Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).</li>
<li>Chakrabarti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dPIP5K+dependent+pool+of+phosphatidylinositol+4%2C5+bisphosphate+%28PIP2%29+is+required+for+G-protein+coupled+signal+transduction+in+Drosophila+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors.</a> PLoS Genetics. 11 (1), 1004948(2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'applicabilità delle proteine di fluorescenza e la semplicità dello screening mediante imaging DPP e microscopia ad immersione in acqua retinica hanno dimostrato di avere successo in molti gruppi12. Strategie simili a quelle qui presentate sono state utilizzate in diversi screening genetici per rilevare difetti nei livelli di espressione della rodopsina, nell'omeostasi, nell'organizzazione retinica o nell'integrità cellulare con l'aiuto di Rh1::eGFP 17,18,19,20,21.</s...

Fornendo e rimuovendo proteine da e verso la membrana plasmatica, il traffico di proteine di membrana nei neuroni controlla l'apparecchiatura della membrana plasmatica con recettori e canali ionici e, di conseguenza, regola la funzione neuronale. La cattiva regolazione o i difetti nel traffico proteico hanno in genere effetti dannosi sulle cellule e provocano la degenerazione neuronale. Nell'uomo, questo può causare malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e Parkinson o la retinite pigmentosa1. I fotorecettori nell'occhio composto di Drosophila melanogaster sono diventati un sistema modello in vivo per lo studio del traffico proteico di membrana2. Ciò non è dovuto solo alla versatilità genetica di Drosophila che consente screening genetici efficaci, ma anche perché tutti i componenti essenziali della membrana fotorecettore che assorbe la luce sono caratterizzati in grande dettaglio e sono disponibili tecniche microscopiche efficienti che possono essere applicate all'occhio della mosca. Queste tecniche sono al centro di questo articolo.
Nelle cellule fotorecettori di Drosophila, la membrana plasmatica apicale forma una pila densamente imballata di microvilli lungo un lato della cellula, chiamata rabdomere. I rabdomeri delle cellule fotorecettrici R1-6 sono disposti in un caratteristico schema trapezoidale mentre le cellule fotorecettrici R7 e R8 formano un unico rabdomere al centro di questo trapezio3. Il traffico proteico di membrana è necessario per un turnover regolato delle proteine di membrana rabdomerali come la rodopsina e i canali ionici TRP (potenziale recettore transitorio) e TRPL (TRP-like) attivati dalla luce per assicurare la giusta quantità di queste proteine di fototrasduzione nel rabdomere. Le proteine di membrana dei fotorecettori sono sintetizzate nel reticolo endoplasmatico e trasportate attraverso l'apparato di Golgi al rabdomero. Dopo l'attivazione della rodopsina da parte della luce, una molecola di rodopsina può essere inattivata dall'assorbimento di un secondo fotone o può essere rimossa dal rabdomere mediante endocitosi mediata dalla clatrina. La rodopsina endocitosa viene degradata nel lisosoma o viene riciclata nel rabdomero 4,5. Anche il canale ionico TRPL viene internalizzato in seguito all'attivazione della cascata di fototrasduzione e subisce una traslocazione dipendente dalla luce tra il rabdomere (dove si trova quando le mosche sono tenute al buio) e un vano di stoccaggio arricchito di ER nel corpo cellulare (a cui viene trasportato entro diverse ore dall'illuminazione)6,7,8,9,10 . A differenza della rodopsina endocitosa, solo piccole quantità di TRPL vengono degradate attraverso la via endolisosomiale e la maggior parte viene invece immagazzinata intracellulare e riciclata nel rabdomere dopo l'adattamento oscuro6. TRPL può quindi essere utilizzato per analizzare il traffico innescato dalla luce delle proteine della membrana plasmatica. Le cellule fotorecettrici di Drosophila sono anche impiegate per studiare la degenerazione neuronale. La degenerazione delle cellule fotorecettrici è spesso determinata valutando la struttura dei rabdomeri, che si disintegrano a seguito di processi degenerativi5.
Al fine di studiare la localizzazione subcellulare di TRPL e rodopsina nelle cellule fotorecettrici o la degenerazione cellulare dei fotorecettori, sono stati applicati qui due metodi di microscopia a fluorescenza che differiscono per quanto riguarda la velocità e la risoluzione dell'analisi. Un metodo molto veloce e non invasivo che può essere utilizzato per gli screening genetici ma con una risoluzione spaziale limitata è il rilevamento della fluorescenza nello pseudopupil profondo (DPP). Il DPP è un fenomeno ottico di occhi composti di artropodi la cui origine geometrica è stata spiegata in dettaglio da Franceschini e Kirschfeld nel 197111. In breve, su diversi piani ottici al di sotto della retina si possono osservare immagini di rabdomere da ommatidi adiacenti. Su un piano focale attraverso il centro della curvatura dell'occhio, queste proiezioni sovrapposte formano un'immagine che assomiglia al layout trapezoidale dei rabdomeri in un singolo ommatidio solo ordini di grandezza più grande. Questo fenomeno può essere osservato anche indipendentemente dall'espressione esogena delle proteine di fluorescenza (ad esempio TRPL::eGFP8), che tuttavia rendono il DPP più facile da rilevare (Figura 1A-A'')12. Un secondo metodo non invasivo è la microscopia ad immersione in acqua che si basa sull'imaging di proteine marcate fluorescentemente dopo aver neutralizzato otticamente l'apparato diottrico degli occhi con acqua (Figura 1B-C'')12. Utilizzando il metodo dell'immersione in acqua, la quantità relativa di TRPL::eGFP nei rabdomeri o nel corpo cellulare può essere valutata quantitativamente per le singole cellule fotorecettrici. Inoltre, le proteine non traslocanti marcate con fluorescenza possono essere utilizzate per valutare l'integrità rabdomerale e per determinare il decorso temporale di una potenziale degenerazione in modo quantitativo, come descritto qui.
Mentre le registrazioni del DPP sono di gran lunga il più semplice e veloce di questi metodi da eseguire, la risoluzione spaziale dei dati che generano è limitata. Inoltre, ci sono numerose ragioni per cui un DPP può essere assente, che non sono necessariamente distinguibili dall'imaging DPP stesso. Poiché il DPP rappresenta una somma di diversi ommatidi, le informazioni sulle singole cellule vengono perse. Pertanto, l'imaging DPP a bassa risoluzione svolge una funzione importante nello screening di un gran numero di mosche, ma dovrebbe generalmente essere seguito da registrazioni a risoluzione più elevata mediante microscopia ad immersione in acqua. Le micrografie ad immersione in acqua consentono interpretazioni su singole cellule, difetti dello sviluppo, morfologia oculare, errata localizzazione proteica o degenerazione retinica, nonché la quantificazione di questi effetti. Questo protocollo descrive in dettaglio queste due tecniche.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63375/63375fig01.jpg"> Figura 1: Panoramica delle variazioni di microscopia per l'occhio Drosophila presentate in questo protocollo. Rappresentazioni schematiche e micrografie esemplari di (A-A'') imaging fluorescente a pseudopupila profonda (DPP), (B-B'') microscopia ad immersione in acqua letale di rabdomere fluorescenti e (C-C'') microscopia a goccia d'acqua non letale di rabdomere fluorescenti. Barra di scala (A''): 100 μm. Barre di scala (B''-C''): 10 μm. La figura è stata modificata dal riferimento13. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63375/63375fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Provetta da centrifuga da 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>CO2 cuscinetto per anestesia</td><td>Flystuff</td><td>59-172</td><td></td></tr><tr><td>Lampada a luce fredda (KL 1500 LCD)</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji/ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza con lampada UV, fotocamera, set di filtri e software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue Tubo</td> <td>fluorescente Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 &micro; W cm-2, Ee590nm = 215 &micro; W cm-2] e [760 Lux, Ee470nm = 173 &micro; W cm-2, Ee590nm = 147 &micro; W cm-2]</td><td>Osram</td><td>4050300518039</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da laboratorio (20-200 &micro; L)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per oggetti</td><td>Roth</td><td>0656.1</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (94 mm)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633102</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette (200 &; L)Labsolute</td><td></td> <td>7695844</td><td></td></tr><tr><td>Plastilina (Blu-Tack)</td><td>Stereomicroscopio Bostik</td><td>30811745</td><td></td></tr><tr><td>(SMZ445)</td><td>Stereomicroscopio Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>con lampada UV, fotocamera, set di filtri e software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12)</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di drosophila utilizzando proteine con tag egfp

Studying Membrane Protein Trafficking in Drosophila Photoreceptor Cells Using eGFP-Tagged Proteins

Il traffico proteico di membrana regola l'incorporazione e la rimozione di recettori e canali ionici nella membrana plasmatica. Questo processo è di fondamentale importanza per la funzione cellulare e l'integrità cellulare dei neuroni. Le cellule fotorecettori di Drosophila sono diventate un modello per lo studio del traffico proteico di membrana. Oltre alla rodopsina, che dopo l'illuminazione viene internalizzata dalla membrana dei fotorecettori e viene degradata, il canale ionico potenziale del recettore transitorio (TRPL) in Drosophila mostra una traslocazione dipendente dalla luce tra la membrana del fotorecettore rabdomerale (dove si trova al buio) e il corpo cellulare del fotorecettore (a cui viene trasportato all'illuminazione). Questo trasporto intracellulare di TRPL può essere studiato in modo semplice e non invasivo esprimendo TRPL marcato con eGFP nelle cellule dei fotorecettori. La fluorescenza eGFP può quindi essere osservata sia nello pseudopupil profondo che mediante microscopia ad immersione in acqua. Questi metodi consentono il rilevamento della fluorescenza nell'occhio intatto e sono quindi utili per saggi ad alto rendimento e screening genetici per mutanti di Drosophila difettosi nella traslocazione TRPL. Qui, la preparazione delle mosche, le tecniche microscopiche e i metodi di quantificazione utilizzati per studiare questa traslocazione innescata dalla luce di TRPL sono spiegati in dettaglio. Questi metodi possono essere applicati anche per studi di traffico su altre proteine fotorecettrici di Drosophila , ad esempio la rodopsina. Inoltre, utilizzando proteine rabdomerali marcate con eGFP, questi metodi possono essere utilizzati per valutare la degenerazione delle cellule fotorecettrici.

Sono state generate mosche transgeniche drosophila che esprimono una proteina di fusione TRPL::eGFP sotto il controllo del promotore della rodopsina 1. In queste mosche, TRPL::eGFP è espresso nelle cellule fotorecettrici R1-6 dell'occhio composto e mostra una localizzazione dipendente dall'illuminazione. Quando le mosche sono tenute al buio, TRPL::eGFP è incorporato nei rabdomeri esterni. Dopo l'illuminazione per diverse ore, TRPL trasloca nel corpo cellulare dove viene immagazzinato in un compartimento arricchi...

Qui, vengono descritti metodi non invasivi per la localizzazione delle proteine di membrana dei fotorecettori e la valutazione della degenerazione retinica nell'occhio composto Drosophila utilizzando la fluorescenza eGFP.

Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine con tag eGFP

Membrane protein trafficking regulates the incorporation and removal of receptors and ion channels into the plasma membrane. This process is fundamentally ...

Le proteine fotorecettrici con tag GFP, come il canale ionico TRPL GFP, ci consentono di studiare il trasporto proteico nei neuroni utilizzando tecniche non invasive. Questo metodo può anche essere utilizzato per monitorare la degenerazione dei fotorecettori. Pertanto, le basi molecolari delle malattie ereditarie con conseguente cecità negli esseri umani possono essere studiate nell'occhio di Drosophila.La localizzazione cellulare delle proteine marcate con GFP può essere valutata osservando la fluorescenza nello pseudopupil profondo o mediante microscopia ad immersione in acqua. Entrambi i metodi consentono una rapida determinazione della localizzazione delle proteine visive e l'osservazione dei difetti strutturali dei rabdomeri dovuti alla degenerazione delle cellule fotorecettrici. Per ottenere immagini di alta qualità, l'aspetto più importante è l'orientamento dell'occhio di mosca.Durante l'esecuzione di questa tecnica, ci si dovrebbe concentrare su ommatidi situati leggermente verso la periferia dell'occhio. Dimostrerò la procedura di imaging DPP, mentre le due tecniche che utilizzano la microscopia ad immersione in acqua saranno dimostrate dalla mia collega, la dott.ssa Krystina Wagner, e Matthias Zeger, uno studente di dottorato nel nostro gruppo. Per iniziare l'imaging profondo di pseudopupil, o DPP, anestetizzare mosche da uno a tre giorni e posizionarne una al centro dell'obiettivo del microscopio su un lato in modo che l'occhio sinistro o destro sia rivolto verso l'obiettivo esattamente radialmente.Aumentare l'ingrandimento per adattarsi all'intero occhio e centrare l'ommatidi centrale dell'occhio. Se possibile, ridurre la profondità di campo del microscopio regolando il diaframma a doppia iride su un'impostazione poco profonda. Quindi, accendere la lampada UV del microscopio alla massima intensità.Quindi, selezionare il set di filtri di fluorescenza del microscopio in base alla proteina di fluorescenza espressa negli occhi e impostare il percorso della luce verso la fotocamera montata sul microscopio. Utilizzando la funzione di imaging dal vivo all'interno del software, regolare la luminosità dell'immagine su un'impostazione che rileva solo segnali specifici dall'occhio aumentando il tempo di esposizione e guadagnando valore. Riregolare la messa a fuoco del microscopio nell'occhio per generare l'immagine sovrapposta del DPP.Quindi, scatta un'istantanea del DPP fluorescente. Per preparare una mosca in una variante letale, far aderire un pezzo di plastilina su una diapositiva di un oggetto e un altro pezzo al centro di una capsula di Petri. Riempire la capsula di Petri con acqua distillata ghiacciata e alcuni fiocchi di ghiaccio.Quindi, metti una mosca anestetizzata dal ghiaccio sotto uno stereomicroscopio sopra il vetrino dell'oggetto rivestito di plastilina. Gira la mosca sulla schiena e perfora una spilla da insetto attraverso il centro del torace. Fissare il perno orizzontalmente sulla diapositiva dell'oggetto rivestito in plastilina e orientare l'occhio sinistro o destro della mosca verso l'alto.Quindi, fissare con cura la diapositiva dell'oggetto con il suo lato privo di plastilina rivolto verso il basso nella capsula di Petri, impedendo la rotazione della testa della mosca. Assicurarsi che l'occhio della mosca sia coperto d'acqua. In alternativa, per preparare una mosca in una variante non letale, trasferire prima la testa di mosca anestetizzata dal ghiaccio in una punta di pipetta da 200 microlitri e spingere con attenzione la mosca verso la punta con aria compressa.Quindi, usando un bisturi, tagliare la punta della pipetta proprio davanti alla testa e usando una pinzetta spingere con attenzione la mosca di alcuni millimetri nella punta della pipetta. Tagliare di nuovo la punta della pipetta e spingere la mosca indietro verso la punta con l'aria compressa in modo che solo la testa della mosca sporga dalla punta della pipetta. Dopo aver aderito un pezzo di plastilina su una diapositiva di oggetto, premere la punta della pipetta in modo che l'occhio sinistro o destro sia rivolto verso l'alto.Assicurarsi che l'occhio sia orientato correttamente al microscopio. Per l'acquisizione delle immagini, selezionare un obiettivo di immersione in acqua. Nel caso di una variazione non letale, utilizzare una pipetta da laboratorio per far aderire una grande goccia di acqua refrigerata sul lato inferiore dell'obiettivo di immersione in acqua.Posizionare con attenzione il vetrino dell'oggetto con la mosca preparata sul palco del microscopio. Quindi, abbassare manualmente l'obiettivo di immersione in acqua fino a quando non entra in contatto con la superficie dell'acqua o l'occhio della mosca tocca la goccia. Quindi, cambia il percorso della luce verso la fotocamera del microscopio e genera un'immagine dal vivo.Riregolare la messa a fuoco per la fotocamera e valutare l'orientamento dell'occhio, considerando che l'occhio deve essere rivolto verso l'obiettivo del microscopio radialmente. Utilizzare il software della tabella di ricerca per rilevare la sovrasaturazione. Nel caso di mosche non pigmentate, regolare il tempo di esposizione in modo che i pixel più luminosi siano appena al di sotto del limite di saturazione per ogni immagine.Registrare un'immagine e salvarla come file raw per archiviare tutti i metadati corrispondenti della registrazione. Quindi, esporta l'immagine in un formato tif. Per quantificare la fluorescenza eGFP relativa nei rhabdomere delle micrografie ad immersione in acqua, regolare le impostazioni imageJ facendo clic su Analizza, quindi su Imposta misurazioni e selezionare solo la casella Valore grigio medio.Importa l'immagine tif facendo clic su File, quindi su Apri. Scegliere un'area rappresentativa dell'immagine a fuoco e ingrandirla al 200-300% premendo ripetutamente Ctrl e insieme. Quindi, selezionare lo strumento Ovale e, mentre si preme il tasto Maiusc, generare una selezione circolare nell'immagine che è significativamente più piccola di un rabdomere fluorescente.Quindi, cerca la dimensione esatta visualizzata sotto la barra degli strumenti nella finestra principale di ImageJ. Per misurare le intensità di fluorescenza all'interno della selezione circolare, spostare il cerchio sul primo rabdomere con i tasti freccia sulla tastiera e fare clic su Analizza, quindi su Misura. Verrà visualizzata una finestra dei risultati che elenca il valore grigio misurato.Continua con le misurazioni dei rabdomeri da due a sei e misura anche il segnale di fondo. Nel caso di mosche non pigmentate, effettuare ulteriori misurazioni delle corrispondenti aree del corpo cellulare. Misurare la fluorescenza di altri due ommatidi, ottenendo tre repliche tecniche.Contrassegnare l'ommatidi analizzata utilizzando lo strumento Matita e salvare questa immagine per la documentazione. Selezionare e copiare i valori di grigio misurati dalla finestra dei risultati e incollarli nel software del foglio di calcolo per ulteriori calcoli. Ordina i valori di intensità della fluorescenza in base alla loro origine nelle categorie rhabdomere, corpo cellulare e sfondo e calcola l'intensità media di ciascuna categoria.Quindi, calcolare la quantità relativa di eGFP presente nel rabdomere utilizzando la prima formula per gli occhi non pigmentati e la seconda per gli occhi pigmentati. In alternativa, per quantificare la morfologia dell'occhio mediante fluorescenza eGFP in micrografie ad immersione in acqua, scegliere tre ommatidi adiacenti in una regione rappresentativa dell'immagine a fuoco. Valutare i 18 rhabdomere della selezione individualmente in base alla loro intensità eGFP, nitidezza dei bordi e contrasto rispetto al segnale di sfondo circostante.Infine, assegna un punteggio ai rabdomeri chiaramente visibili con un valore di due, ai rabdomeri visibili settimanali con un valore di uno e ai rabdomere assenti con un valore pari a zero per generare un indice di degenerazione. Nelle mosche transgeniche Drosophila che esprimono una proteina di fusione eGFP TRPL, la fluorescenza rabdomerale scompare alla luce a causa della traslocazione del TRPL eGFP. Ciò consente di eseguire uno screening genetico per identificare i mutanti difettosi nell'internalizzazione del TRPL eGFP.Nelle mosche di controllo, eGFP TRPL trasloca dai rabdomeri nel corpo cellulare dopo 16 ore di illuminazione, con conseguente significativa diminuzione della fluorescenza rabdomerale rispetto allo stato adattato al buio. La seconda incubazione scura aumenta nuovamente la fluorescenza rabdomerale verso il valore iniziale. Tuttavia, nel mutante difettoso di traslocazione TRPL vps35MH20, il modello di fluorescenza non cambia drasticamente dopo 16 ore di illuminazione e un successivo adattamento al buio per 24 ore.Questo metodo di quantificazione è in grado di rilevare un difetto di riciclaggio statisticamente molto significativo. Le mosche dagli occhi bianchi consentono il rilevamento di segnali di fluorescenza sia dal rabdomere che dal corpo cellulare. Al contrario, nelle mosche dagli occhi rossi, i segnali di fluorescenza sono rilevabili solo nei rabdomeri ma non nel corpo cellulare.Per quanto riguarda la quantificazione della degenerazione retinica, la fluorescenza eGFP TRP può essere valutata nel corso di diverse settimane. Se tenuto in un ciclo di luce di 12 ore e buio di 12 ore per due settimane, l'indice di degenerazione è diminuito nelle mosche mutanti ma non nelle mosche di controllo. In questo protocollo, è necessario distinguere tra occhi pigmentati e non pigmentati.Poiché la pigmentazione influisce sul segnale fluorescente, la microscopia quantitativa ad immersione in acqua è stata ottimizzata per entrambi i casi individualmente. L'imaging DPP e la microscopia ad immersione in acqua sono metodi ad alta produttività con risoluzione limitata. Per studiare la localizzazione subcellulare, raccomandiamo la microscopia a immunofluorescenza su sezioni di tessuto.Per un'analisi dettagliata dei fenotipi degenerativi, è possibile eseguire la microscopia elettronica.

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