Quantificazione del trasporto del ferro attraverso la placenta di topo in vivo utilizzando isotopi di ferro non radioattivi

Questo protocollo è significativo perché consente ai ricercatori di tracciare e quantificare la distribuzione del ferro in vivo senza la necessità di radioattività. Poiché più isotopi di ferro stabili possono essere rilevati contemporaneamente all'interno dello stesso campione, questa tecnica può essere utilizzata per comprendere l'assorbimento, la regolazione e la distribuzione del ferro da fonti diverse. Per iniziare, aggiungere 12 acido cloridrico normale al ferro-58 nella fiala di vetro fornita dal venditore e sostituire il tappo in modo approssimativo.

Per sciogliere il ferro, riscaldare la soluzione a 60 gradi Celsius per un'ora. Se ancora non è disciolto, lasciare la soluzione per una notte a temperatura ambiente nella cappa aspirante per sciogliersi. Quindi, per generare la soluzione di cloruro ferrico, ossidare qualsiasi cloruro ferroso rimanente riscaldando la soluzione a 60 gradi Celsius con il tappo spento per facilitare l'ossidazione.

Aggiungere un microlitro di perossido di idrogeno al 35% per 50 microlitri della soluzione per facilitare ulteriormente l'ossidazione. Lasciare la soluzione di cloruro ferrico nella cappa a 60 gradi Celsius con il tappo spento per far evaporare il campione. Quindi ricostituire il cloruro ferrico a 100 millimoli con acqua ultrapura.

Calcola la quantità di acqua necessaria in base al peso iniziale del metallo. Quindi, preparare un millilitro di nitrilotriacetato ferrico incubando la soluzione di cloruro ferrico preparata con nitrilotriacetato in un rapporto molare da uno a cinque in presenza di bicarbonato di sodio 20 millimolari per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi sciogliere 500 milligrammi di apotransferrina in quattro millilitri di tampone di trasferimento e carico e aggiungere quattro millilitri di questa soluzione di apotransferrina alla soluzione di nitrilotriacetato ferrico preparata nel tubo da 15 millilitri.

Per consentire il carico massimo di nitrilotriacetato ferrico su apotransferrina, controllare che la soluzione sia a pH 7,5 e regolare il pH se necessario con bicarbonato di sodio o acido cloridrico. Incubare la miscela per 2 1/2 ore a temperatura ambiente. Quindi, rimuovere il nitrilotriacetato ferrico non legato in eccesso e rilasciare nitrilotriacetato trasferendo la soluzione di transferrina di ferro-58 su una colonna di cutoff del peso molecolare e centrifugando la colonna.

Dopo la centrifugazione, lavare la colonna due volte aggiungendo 10 millilitri di tampone di carico della transferrina e centrifugando la colonna. Quindi lavare la colonna con 10 millilitri di soluzione salina e centrifugare nuovamente. Infine, sterilizzare la soluzione di transferrina di ferro-58 utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micron e conservare a quattro gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Preparare una soluzione di transferrina di ferro-58 da 35 milligrammi per millilitro in soluzione salina. Quindi posizionare un topo gravido anestetizzato su una piastra riscaldante e iniettare lentamente e con attenzione la soluzione di transferrina di ferro-58 nel seno retroorbitale. Sei ore dopo l'iniezione, eutanasia del topo e rimuovere con cura l'utero usando una pinza sterile e forbici da dissezione.

Tagliare un'unità placentare fetale comprendente un singolo feto e placenta nel sacco amniotico circondato da una porzione dell'utero. Quindi, tagliare con cura l'utero e il sacco amniotico senza disturbare il feto e la placenta. Quindi staccare il sacco amniotico e rimuovere il feto e la placenta.

Dopo aver tagliato il cordone ombelicale, asciugare il feto e la placenta su una pulizia per rimuovere il liquido amniotico in eccesso e registrare il peso dell'intera placenta. Tagliare ogni placenta a metà con una lama di rasoio. Mettere ogni metà in un tubo da due millilitri e congelare a scatto in azoto liquido.

Per raccogliere i fegati dell'embrione, sacrificare l'embrione e fissare l'embrione per la stabilizzazione lasciando l'addome esposto. Usando le forbici da dissezione fare una piccola incisione dove è stato attaccato il cordone ombelicale. Inserire un'estremità della forbice di dissezione nell'incisione ed eseguire un taglio del piano mediano da 1/4 di pollice verso il piano coronale.

Quindi eseguire tagli piani trasversali per esporre il fegato fetale. Usando una pinza, rimuovere il fegato fetale e registrare il peso dell'intero fegato embrionale. Mettere l'intero fegato dell'embrione in un tubo da due millilitri e congelarlo in azoto liquido.

Conservare i tessuti a tempo indeterminato a meno 80 gradi Celsius. Per quantificare il ferro non-eme nelle placenta e nei fegati fetali, scongelare le metà placentari e i fegati fetali interi. Quindi pesare le metà placentari.

Aggiungere 400 microlitri di soluzione di precipitazione proteica ai campioni di tessuto e omogeneizzare il tessuto utilizzando un omogeneizzatore elettrico. Incubare i campioni a 100 gradi Celsius per un'ora. Quindi raffreddarli a temperatura ambiente per due minuti.

Aprire i tappi per rilasciare la pressione. Quindi chiudere nuovamente i tubi. Dopo aver centrifugato il campione per pellettare i detriti tissutali, trasferire con attenzione il surnatante in una nuova provetta marcata per l'analisi ICP-MS.

Successivamente per quantificare il ferro eme, registrare il peso del pellet ottenuto dopo la centrifugazione. Quindi digerire i pellet in 10 millilitri di acido nitrico concentrato al 70%, integrato con un millilitro di perossido di idrogeno al 30%. Riscaldare i campioni a 200 gradi Celsius per 15 minuti prima di inviarli per l'analisi ICP-MS.

La misura ICP-MS ha permesso di rilevare due diversi isotopi del ferro. L'isotopo di ferro più abbondante, il ferro-56, riflette i cambiamenti ionici cronici nei tessuti. Un altro isotopo, il ferro-58, riflette cambiamenti acuti nella distribuzione del ferro iniettato.

La misurazione del ferro-56 ha confermato che i fegati embrionali provenienti da gravidanze carenti di ferro avevano ridotto le riserve di ferro rispetto a quelli nelle gravidanze piene di ferro. La misurazione del ferro-58 ha confermato che nelle gravidanze con carenza di ferro, meno ferro è stato trasferito al fegato dell'embrione nell'arco di sei ore rispetto alle gravidanze piene di ferro. Durante l'esecuzione della procedura, ricordarsi di registrare il peso dei tessuti.

Questi pesi sono necessari per calcolare le concentrazioni di ferro. Poiché il ferro-58 non richiede particolari precauzioni di manipolazione e smaltimento, il tessuto non trattato può essere utilizzato per altre analisi, tra cui, ma non solo, il western blotting, o qPCR.