Name: Applicazioni dellinterferenza dellRNA nello scarafaggio americano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Scopri le applicazioni dell'interferenza dell'RNA nello scarafaggio americano per studiare i meccanismi molecolari del comportamento e dello sviluppo. Questo metodo versatile consente il knockdown genico in organismi non modificabili.

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 32070500, 31620103917, 31330072 e 31572325 a C.R., Sh.L.), dalla Natural Science Foundation della provincia del Guangdong (Grant No. 2021B1515020044 e 2020A1515011267 a C.R.), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia nella Provincia del Guangdong (Grant Nos. 2019B090905003 e 2019A0102006), dal Dipartimento di Scienza e Tecnologia di Guangzhou (Grant No. 202102020110), dal Shenzhen Science and Technology Program (Grant No. KQTD20180411143628272 a Sh.L.).

La linea di P. americana è stata inizialmente fornita dal Dr. Huiling Hao. Questa specie è stata mantenuta consanguineità per 30 anni9.
1. Schiusa e alimentazione di P. americana
<ol><li>Raccogliere oothecae fresche (immediatamente dopo la deposizione delle uova) di P. americana e incubare nell'incubatrice scura a 25 ° C e 60% di umidità per ~ 25 giorni. Quindi aumentare la temperatura e l'umidità a 30 ° C e 75% 3 giorni prima della schiusa.</li>
	<li>Utilizzare un setaccio con apertura di 4 mm per separare le ninfe tratteggiate dalle oothecae.</li>
	<li>Tenere le ninfe in contenitori cilindrici (12 cm di diametro e 10 cm di altezza) al buio a 28 °C, 70% di umidità. Spazzolare il bordo interno dei contenitori con vaselina per evitare che gli scarafaggi fuoriescano. Fornire cibo per topi, acqua e riparo (vassoi per uova). Presta attenzione all'attività delle ninfe e pulisci regolarmente le feci e i detriti.</li>
</ol>2. Selezione delle ninfe in instar corretta
<ol><li>Usa un tubo di vetro per scegliere il P. americana appena fuso (bianco nel colore del corpo). Conservali in nuovi contenitori e attendi la fase corretta per il trattamento. NOTA: Dopo ~ 19 giorni nelle condizioni di alimentazione di cui sopra, le ninfe nel 3° instars saranno disponibili per l'iniezione. Il colore degli scarafaggi appena fusi è bianco e le stelle sono chiarite dai tempi di muta.</li>
</ol>3. Preparazione del frammento target con promotori T7
<ol><li>Utilizzando il cDNA di P. americana come modello, progettare primer accoppiati per eseguire la PCR per ottenere un frammento di DNA da 300-800 bp del gene bersaglio9. Quindi clonare il frammento PCR in un vettore pTOPO (vedere Tabella dei materiali) per il sequenziamento.</li>
	<li>Utilizzando il DNA del frammento bersaglio come modello, sintetizzare una nuova coppia di primer con sequenza di promotori T7 (5'-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3') ai terminali 5' ed eseguire un altro ciclo di PCR per ottenere il frammento bersaglio con promotori T7 su ciascun lato9.</li>
</ol>4. Trascrizione e sintesi di dsRNA in vitro
<ol><li>Aggiungere 10 μL di tampone T7 2X, 2 μL della miscela enzimatica, T7 Express (vedere tabella dei materiali) e 2 μg di prodotto PCR (ottenuto al punto 3.2) nel sistema di reazione e aggiungere il volume totale a 20 μL con ddH2O. Mescolare delicatamente manualmente e incubare a 37 °C per 30 minuti e 70 °C per 10 minuti, e poi raffreddare lentamente a temperatura ambiente.</li>
	<li>Soluzione diluita di RNasi A (4 μg/μL) con ddH2O in rapporto 1:200. Quindi aggiungere al sistema 1 μL di DNasi RQ1 RNasi-Free (1 U/μL) e 1 μL di soluzione di RNasi A diluita (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Ora, il volume di un singolo sistema è di 22 μL.</li>
	<li>Incubare a 37 °C per 30 min. Quindi aggiungere il 10% del volume totale (quando si eseguono reazioni N contemporaneamente, il volume totale è N x 22 μL) di acetato di sodio e tre volumi del volume totale di isopropanolo.</li>
	<li>Mescolare delicatamente a testa in giù manualmente, mettere su ghiaccio per 5 minuti e centrifugare a 13.000 x g per 10 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante con una pipetta, lavare il residuo con etanolo al 75% (con acqua trattata con pirocarbonato di dietile (DEPC) al 25%) e quindi centrifugare a 13.000 x g per 5 minuti a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere di nuovo il surnatante. Asciugare all'aria il pellet per 15 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare ~ 100 μL di acqua DEPC per sciogliere il dsRNA, quindi diluire il dsRNA fino ai 2 μg / μL finali. NOTA: Il dsRNA potrebbe essere conservato a -80 °C per 6 mesi.</li>
</ol>5. Caricamento della soluzione di dsRNA nella siringa
<ol><li>Impostare il programma nella pompa di microiniezione (vedere Tabella dei materiali) in anticipo per garantire che il volume di ciascuna iniezione sia coerente. Prima di utilizzare la siringa, pulire la siringa riempiendola con acqua DEPC 8-10 volte.</li>
	<li>Installare la siringa da 10 μL sulla pompa di microiniezione, avviare la pompa e riempire la siringa con 10 μL di soluzione di dsRNA (preparata al punto 4.6). Iniettare 1 μL del dsRNA in una ninfa3a instar (vedere il passo 2) e assicurarsi che non fuoriesca nel corpo.</li>
</ol>6. Iniezione di dsRNA a P. americana
<ol><li>Anestetizzare gli scarafaggi con una maggiore concentrazione di CO2 in un contenitore fino a quando gli scarafaggi non si muovono più, quindi procedere immediatamente con l'iniezione.</li>
	<li>Raccogli delicatamente lo scarafaggio con una pinzetta e consegna lo scarafaggio verso l'ago con la mano. Quindi, inserire l'ago attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide. A proposito di inserire la profondità, più basso, meglio è.</li>
	<li>Quindi, iniettare la soluzione di dsRNA nello scarafaggio. Infine, estrarre la punta dell'ago. Assicurarsi che la punta dell'ago sia il più vicino possibile all'epidermide per evitare di danneggiare gli organi interni. NOTA: L'iniezione deve essere effettuata al microscopio di dissezione.</li>
	<li>Metti gli scarafaggi iniettati in contenitori puliti per il biodosaggio. Attendere circa 10-20 minuti per farli recuperare dagli effetti della CO2 . Etichettare i contenitori con la data di iniezione, il tipo e la dose di dsRNA e l'età del P. americana.</li>
	<li>Posizionare gli scarafaggi iniettati in un ambiente buio a 28 ° C, 70% di umidità, fornire acqua, mangime e riparo e osservare regolarmente possibili cambiamenti nel fenotipo degli scarafaggi.</li>
</ol>7. Conferma knockdown e analisi fenotipica
<ol><li>Valutare l'efficienza dell'RNAi utilizzando tutte le tecniche di biologia molecolare disponibili come la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e il Western blotting. Per le procedure dettagliate di qRT-PCR e Western blotting, vedere i riferimenti 1,12.</li>
	<li>Per osservare e analizzare fenotipi correlati all'RNAi, utilizzare il microscopio adatto per animali viventi. NOTA: RNAi può influenzare la morfologia, il comportamento, la muta, la rigenerazione degli arti e altre attività fisiologiche degli scarafaggi. La frequenza specifica del fenotipo viene calcolata in base a condizioni specifiche.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, S. C., Miyata, K., Brown, S. J., Tomoyasu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+systemic+RNA+interference+in+the+red+flour+beetle+Tribolium+castaneum%3A+Parameters+affecting+the+efficiency+of+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Dissecting systemic RNA interference in the red flour beetle Tribolium castaneum: Parameters affecting the efficiency of RNAi.</a> PloS One. 7 (10), 47431(2012).</li>
<li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Ambesajir, A., Kaushik, A., Kaushik, J. J., Petros, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference%3A+A+futuristic+tool+and+its+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference: A futuristic tool and its therapeutic applications.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 19 (4), 395-403 (2012).</li>
<li>Younis, A., Siddique, M. I., Kim, C. K., Lim, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+%28RNAi%29+induced+gene+silencing%3A+A+promising+approach+of+hi-tech+plant+breeding%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">RNA interference (RNAi) induced gene silencing: A promising approach of hi-tech plant breeding.</a> International Journal of Biological Sciences. 10 (10), 1150-1158 (2014).</li>
<li>Bellés, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+Drosophila%3A+RNAi+in+vivo+and+functional+genomics+in+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Beyond Drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects.</a> Annual Review of Entomology. 55, 111-128 (2010).</li>
<li>French, A. S., Meisner, S., Liu, H., Weckström, M., Torkkeli, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+and+RNA+interference+of+cockroach+phototransduction+indicate+three+opsins+and+suggest+a+major+role+for+TRPL+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis and RNA interference of cockroach phototransduction indicate three opsins and suggest a major role for TRPL channels.</a> Frontiers in Physiology. 6, 207(2015).</li>
<li>Hennenfent, A., Liu, H., Torkkeli, P. H., French, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+supports+a+role+for+Nanchung-Inactive+in+mechanotransduction+by+the+cockroach%2C+Periplaneta+americana%2C+tactile+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Invertebrate+Neuroscience%3A+IN%22%5BJournal%5D)">RNA interference supports a role for Nanchung-Inactive in mechanotransduction by the cockroach, Periplaneta americana, tactile spine.</a> Invertebrate Neuroscience: IN. 20 (1), 1(2020).</li>
<li>Immonen, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EAG+channels+expressed+in+microvillar+photoreceptors+are+unsuited+to+diurnal+vision%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">EAG channels expressed in microvillar photoreceptors are unsuited to diurnal vision.</a> The Journal of Physiology. 595 (16), 5465-5479 (2017).</li>
<li>Li, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+functional+landscapes+of+developmental+plasticity+in+the+American+cockroach%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The genomic and functional landscapes of developmental plasticity in the American cockroach.</a> Nature Communications. 9 (1), 1008(2018).</li>
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<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+interference-based+specific+and+efficient+gene+inactivation+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">CRISPR interference-based specific and efficient gene inactivation in the brain.</a> Nature Neuroscience. 21 (3), 447-454 (2018).</li>
<li>Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+double-stranded+RNA+in+insect+hemolymph+as+a+potential+determiner+of+RNA+interference+success%3A+Evidence+from+Manduca+sexta+and+Blattella+germanica%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica.</a> Journal of Insect Physiology. 59 (2), 171-178 (2013).</li>
<li>Parrish, S., Fleenor, J., Xu, S., Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+anatomy+of+a+dsRNA+trigger%3A+differential+requirement+for+the+two+trigger+strands+in+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional anatomy of a dsRNA trigger: differential requirement for the two trigger strands in RNA interference.</a> Molecular Cell. 6 (5), 1077-1087 (2000).</li>
<li>Lemonds, T. R., Liu, J., Popadić, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contribution+of+the+melanin+pathway+to+overall+body+pigmentation+during+ontogenesis+of+Periplaneta+americana%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">The contribution of the melanin pathway to overall body pigmentation during ontogenesis of Periplaneta americana.</a> Insect Science. 23 (4), 513-519 (2016).</li>
<li>Jackson, A. L., Linsley, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+amidst+the+silence%3A+Off-target+effects+of+siRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%3A+TIG%22%5BJournal%5D)">Noise amidst the silence: Off-target effects of siRNAs.</a> Trends in Genetics: TIG. 20 (11), 521-524 (2004).</li>
<li>Patel, M., Peter, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+DISE-inducing+shRNAs+by+monitoring+cellular+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle+%28Georgetown%2C+Tex%29%22%5BJournal%5D)">Identification of DISE-inducing shRNAs by monitoring cellular responses.</a> Cell Cycle (Georgetown, Tex). 17 (4), 506-514 (2018).</li>
<li>Ventós-Alfonso, A., Ylla, G., Montañes, J. C., Belles, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNMT1+promotes+genome+methylation+and+early+embryo+development+in+cockroaches%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNMT1 promotes genome methylation and early embryo development in cockroaches.</a> iScience. 23 (12), 101778(2020).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNAi+efficacy+among+insect+species+is+attributable+to+dsRNA+degradation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 77, 1-9 (2016).</li>
<li>Bi, F., Liu, N., Small Fan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((interfering+RNA%3A+A+new+tool+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">interfering RNA: A new tool for gene therapy.</a> Current Gene Therapy. 3 (5), 411-417 (2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Questo rapporto descriveva una strategia metodologica passo-passo RNAi in P. americana; da notare, può anche essere applicato ad altri scarafaggi (Blattella germanica, per esempio) e molti altri insetti con piccoli cambiamenti. Tuttavia, l'efficienza di silenziamento genico dell'RNAi non è sempre abbastanza elevata, con un evidente svantaggio rispetto alla strategia di knockout genico13. Il seguente effetto residuo del livello genico può interferire con i fenotipi reali. Per gara...

L'interferenza dell'RNA (RNAi), un meccanismo conservato evolutivamente, diventa gradualmente uno strumento genetico inverso essenziale per inibire l'espressione genica in molti organismi1, da quando Andrew Fire e Craig Mello2 hanno sviluppato la strategia di silenzio genico mediato dall'RNA a doppio filamento (dsRNA). Il dsRNA viene scisso in frammenti di 21-23 nucleotidi, piccoli RNA interferenti (siRNA), dall'enzima Dicer nelle cellule per attivare la via dell'RNAi. Quindi i siRNA vengono incorporati nel complesso di silenziamento indotto dall'RNA (RISC), che si accoppia all'mRNA bersaglio, provoca la scissione dell'mRNA e infine provoca la perdita della funzione genica 3,4,5. Tra le specie di insetti, molti esperimenti sistemici RNAi sono stati finora segnalati in molti ordini di insetti, come Orthoptera, Isoptera, Hemiptera, Coleoptera, Neuroptera, Ditteri, Hymenoptera, Lepidoptera e Blattodea 5,6,7,8.
Gli scarafaggi (Blattaria) sono una famiglia di insetti essenziale negli studi sullo sviluppo e metamorfici con i loro rapidi cicli di crescita, la forte adattabilità all'ambiente e l'elevata plasticità dello sviluppo9. Prima di scoprire che l'RNAi era compatibile con gli scarafaggi, la ricerca precedente si è concentrata solo sulla prevenzione e il controllo degli scarafaggi a causa della scarsità di tecniche di manipolazione genetica negli scarafaggi. La struttura unica dell'ooteca scarafaggio ha reso difficile eseguire il knockout genetico basato sull'iniezione di embrioni con il sistema CRISPR-Cas9. Inoltre, la maggior parte dei tessuti negli scarafaggi (come P. americana) mostra una robusta risposta sistemica all'RNAi, consentendo la rapida generazione di fenotipi disfunzionali iniettando uno o più dsRNAmirati 9,10,11. Queste caratteristiche hanno reso l'RNAi una tecnica indispensabile nella ricerca funzionale genica in P. americana.
Anche se è stato riportato l'uso di RNAi nella ricerca sui geni funzionali in P. americana , non era disponibile alcuna descrizione dettagliata o dettagliata. Questo rapporto fornisce una linea guida operativa passo-passo per RNAi in P. americana, utile per lo studio della funzione genica in altri scarafaggi. Inoltre, questa guida non si limita a Blattodea e può essere applicata a molti altri insetti con piccole modifiche.

<table><tbody><tr><td>701 N 10 &micro; L Syr (26s/51/2)</td><td>Hamilton</td><td>PN:80300</td><td>Incubatore per iniezione</td></tr><tr><td></td><td>Ningbo Jiangnan Instrument Factory</td><td>RXZ-380A-LED</td><td>Per la schiusa e l'alimentazione di scarafaggi</td></tr><tr><td>Pompa per micro-iniezione</td><td>Alcott Biotechnology</td><td>ALC-IP600</td><td>Kit</td></tr><tr><td>di clonazione pTOPO-Blunt</td> per iniezione <td>Aidlab Biotechnology</td><td>CV16</td><td>Per la clonazione genetica</td></tr><tr><td>quantitativa Sistemi di PCR in tempo reale</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX Connect</td><td>Per l'analisi qRT-PCR</td></tr><tr><td>Sistema RNAi T7 RiboMAX Express</td><td>Promega</td><td>P1700</td><td>Per la sintesi di dsRNA, che contiene una soluzione di Rnasi A (4 &mu; g/&mu; L), acetato di sodio, 3,0 M (pH 5,2), miscela enzimatica, T7 Express, acqua priva di nucleasi, tampone Express T7 2x, termociclatori DNasi privi di RNasi RQ1</td></tr><tr><td></td><td>Bio-Rad</td><td>S1000</td><td>per l'amplificazione del DNA</td></tr></tbody></table>

applicazioni dell'interferenza dell'rna nello scarafaggio americano

Applications of RNA Interference in American Cockroach

Gli scarafaggi, un parassita sanitario, sono specie essenziali negli studi sullo sviluppo degli insetti e metamorfici grazie alla loro facile alimentazione e alle caratteristiche emimetaboliche. Complessivamente con sequenze di genoma ben annotate, questi vantaggi hanno reso lo scarafaggio americano, Periplaneta americana, un importante modello di insetto emimetabolico. Limitato dalla carenza di strategia di knockout, l'efficace knockdown genico basato sull'interferenza dell'RNA (RNAi) diventa una tecnica indispensabile nella ricerca genica funzionale di P. americana. Il presente protocollo descrive le tecniche di funzionamento RNAi in P. americana. Il protocollo include (1) la selezione della P. americana nelle fasi di sviluppo appropriate, (2) la preparazione per l'impostazione dell'iniezione, (3) l'iniezione di dsRNA e (4) il rilevamento dell'efficienza del knockdown genico. RNAi è un potente strumento genetico inverso in P. americana. La maggior parte dei tessuti di P. americana sono sensibili al dsRNA extracellulare. La sua semplicità consente ai ricercatori di ottenere rapidamente fenotipi disfunzionali sotto una o più iniezioni di dsRNA, consentendo ai ricercatori di utilizzare meglio il P. americana per studi di sviluppo e metamorfici.

La Figura 1 mostra un'iniezione riuscita. La siringa per microiniezione con un ago di microdiametro deve essere posizionata orizzontalmente sul booster (Figura 1A). L'ago viene inserito attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide (Figura 1B). Assicurarsi che il liquido entri nell'addome di P. americana . L'angolo troppo ripido dell'ago danneggerà gli organi interni (<strong cl...

Il presente protocollo descrive le linee guida passo-passo per le tecniche operative RNAi in P. americana.

Applicazioni dell'interferenza dell'RNA nello scarafaggio americano

Cockroaches, a sanitary pest, are essential species in insect developmental and metamorphic studies due to their easy feeding and hemimetabolous ...

Il protocollo fornisce un modo semplice per studiare gli scarafaggi americani. Un parassita sanitario comune e un insetto benefico per la medicina tradizionale cinese. Aiuterà a esplorare i meccanismi molecolari di molteplici attività vitali degli scarafaggi americani abbattendo geni specifici.Il vantaggio principale di questa tecnologia è che può abbattere i geni nello scarafaggio americano o in altri insetti simili che non sono adatti per l'editing genetico. Questa tecnologia può essere utilizzata per esplorare vari campi come la regolazione genetica ed epigenetica, il processo di sviluppo dei tessuti, la rigenerazione delle appendici, il comportamento di accoppiamento e altri lati interessanti dello scarafaggio americano. Questa tecnologia è facile da usare e versatile.Suggeriamo di mantenere gli animali sani durante il trattamento di iniezione DSRA. Credo che i principianti possano facilmente padroneggiare questa tecnica dopo diverse sessioni di pratica. Per iniziare, separa le ninfe tratteggiate dalle oothecae con un setaccio con apertura di quattro millimetri.Scegli la P.americana bianca appena maltata con un tubo di vetro. Metti il P.americana in contenitori nuovi e attendi lo stadio corretto per il trattamento. Nel sistema di reazione, aggiungere 10 microlitri di tampone T7 2X, 2 microlitri del T7 Express Enzyme Mix e due microgrammi di prodotto PCR.Infine, portare il volume totale a 20 microlitri con acqua doppia distillata. Mescolare delicatamente a testa in giù manualmente e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti, quindi 70 gradi Celsius per 10 minuti. Diluire 4 microgrammi per microlitro RNasi A soluzione con acqua DEPC in un rapporto da 1 a 200.Quindi aggiungere al sistema 1 microlitro di un'unità per microlitro RQ1 RNase Free Dnase e 1 microlitro di RNasi A diluita. Incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi aggiungere il 10% del volume totale di acetato di sodio e tre volumi del volume totale di isopropanolo.Mescolare delicatamente a testa in giù manualmente, quindi mettere su ghiaccio per cinque minuti e centrifugare a 13.000 g per 10 minuti a 4 gradi Celsius. Rimuovere il surnatante con una pipetta. Quindi, lavare il residuo con il 75% di etanolo, con il 25% di acqua trattata CON DEPC, quindi centrifugare a 13.000 g per 5 minuti a 4 gradi Celsius.Rimuovere nuovamente il surnatante, asciugare all'aria il pellet per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi sciogliere l'RNA a doppio filamento con circa 100 microlitri di acqua DEPC e diluirlo alla concentrazione finale di 2 microgrammi per microlitro. Impostare il programma nella pompa di microiniezione per garantire che il volume di ogni iniezione sia coerente.Quindi pulire la siringa riempiendola con acqua DEPC da 8 a 10 volte. Installare la siringa da 10 microlitri sulla micropompa di iniezione. Quindi avviare la pompa e riempire la siringa con 10 microlitri di soluzione di RNA a doppio filamento.Anestetizzare gli scarafaggi con anidride carbonica, quindi raccoglierli delicatamente con una pinzetta e consegnare lo scarafaggio verso l'ago a mano. Quindi, inserire l'ago attraverso lo spazio tra due somiti addominali orizzontalmente contro l'epidermide. Iniettare la soluzione di RNA a doppio filamento nello scarafaggio assicurandosi che la punta dell'ago sia il più vicino possibile all'epidermide per evitare di danneggiare gli organi interni.Infine, estrarre la punta dell'ago. Metti gli scarafaggi iniettati in contenitori puliti per il biodosaggio. Attendere circa 10-20 minuti per farli recuperare dagli effetti dell'anidride carbonica.Etichettare i contenitori con la data di iniezione, il tipo e la dose di RNA a doppio filamento e l'età del P.americana. I geni Ddc o DOPA decarbossilasi e Dpp o decapentaplegici sono stati selezionati come due esempi per osservare il fenotipo degli scarafaggi maltati dopo l'iniezione di RNA a doppio filamento e dsMocK che non ha bersaglio negli animali è stato preso come controllo negativo. L'efficienza RNAi è stata rilevata dalla pcr qRT.I geni sono stati significativamente abbattuti con un valore P inferiore a 0,01 per dsDdc e inferiore a 0,05 per dsDpp. P.americana con geni Ddc knockdown aveva l'epidermide bianca a causa della melanizzazione bloccata. Nell'esperimento con iniezioni di dsDpp, l'RNAi ha interrotto la rigenerazione degli arti.Gli insetti dovrebbero essere sani e iniettati senza danni. Questa tecnologia fornisce un modo semplice per esplorare le funzioni geniche per gli insetti che non possono essere modificati geneticamente come lo scarafaggio americano.

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RNA interference è stato dimostrato molto efficace per analizzare la funzione del gene...

L&#39;interferenza di RNAi per iniezione in dsRNA Drosophila Embrioni

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RNAi trigger consegna in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupe

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In questo articolo vengono illustrate le tecniche romanzo sviluppati per la consegna orale del RNA double-stranded (dsRNA) attraverso i tessuti vascolari delle piante per interferenza del RNA (RNAi) in sap floema insetti d'alimentazione.

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Interferenza dell'RNA nei Coleotteri acquatici come potente strumento per manipolare l'espressione genica in punti specifici del tempo di sviluppo

La somministrazione orale di dsRNA prodotto dai batteri, un metodo di consegna per l'interferenza dell'RNA (RNAi) che viene regolarmente utilizzato in Caenorhabditis elegans, è stato applicato con successo qui alle zanzare adulte. Il nostro metodo consente robusti studi di genetica inversa e studi vettoriali che bloccano la trasmissione senza l'uso dell'iniezione.

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La manipolazione dell'interferenza dell'RNA (RNAi) rappresenta una sfida formidabile in molte specie di parassitoidi di dimensioni ridotte, come le vespe Trichogramma . Questo studio ha delineato un metodo RNAi efficiente in Trichogramma denrolimi. La presente metodologia fornisce un modello robusto per lo studio della regolazione genica nelle vespe Trichogramma .

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Scopri le applicazioni dell'interferenza dell'RNA nello scarafaggio americano per studiare i meccanismi molecolari del comportamento e dello sviluppo. Questo metodo versatile consente il knockdown genico in organismi non modificabili.

Applicazioni dell'interferenza dell'RNA nello scarafaggio americano

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