Determinazione della distribuzione della lunghezza della catena glucano del glicogeno utilizzando il metodo dell'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)

Questo metodo fornisce una migliore comprensione delle organizzazioni strutturali delle particelle di glicogeno. È una questione importante perché la popolazione delle catene glucaniche, la cosiddetta distribuzione della lunghezza della catena, determina le proprietà chimiche fisiche delle particelle di glicogeno. Come la solubilità in acqua.

Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che la fluorescenza è costante indipendentemente dalla lunghezza della catena glucano. C'è solo una molecola APTS legata dal glucano. Pertanto, l'intensità della fluorescenza è direttamente proporzionale al numero di catene di glucano.

Il campo per l'elettroforesi capillare assistita è adatto a risolvere il meccanismo medico degli enzimi che metabolizzano il glicogeno. Ad esempio, possiamo determinare il grado di polimerizzazione delle catene di glucano trasferite dagli enzimi ramificati sul glucano accettato. La reazione deve essere eseguita in condizioni.

Pertanto, le regioni devono essere protette dall'umidità. Mescolare 200 microlitri di 0,5-2 milligrammi per millilitro di glicogeno purificato con 200 microlitri di tampone di acetato 100 di pH 4,8. Aggiungere 2 microlitri di isoamilasi e 1,5 microlitri di pullulanasi.

Mescolare delicatamente pipettando su e giù. Quindi incubare a 42 gradi Celsius per 16 ore in un tubo da 1,5 millilitri. Interrompere le reazioni incubando a 95 gradi Celsius per 5 minuti.

Centrifugare a 16, 100 volte G'per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettificare e rimuovere qualsiasi materiale insolubile. Rimuovere la super manutenzione con una pipetta e trasferirli su nuovi tubi annotati. Dopo aver aggiunto perline di resina in un tubo di micro-fuga vuoto, dissalare i supernatanti aggiungendo l'equivalente di 100 microlitri di un perle di resina a scambio cationico anionico e agitare.

Raccogliere i campioni mediante pipettaggio e inserirli in nuovi tubi annotati. Congelare i campioni. Conservare i campioni essiccati a temperatura ambiente o 20 gradi Celsius.

Mescolare i campioni essiccati con 2 microlitri di 1 cianoboroidruro di sodio molare e tetraidrofurano e 2 microlitri di 8 aminoacidi 1-3-6 pirene trisolfonico. Incubare a 42 gradi Celsius per 16 ore al buio. Aggiungere 46 microlitri di acqua ultra pura a ciascun campione.

Per diluire i campioni 50 volte, aggiungere un microlitro del campione a 49 microlitri di acqua ultra pura in 100 microlitri. In vortice per mescolare accuratamente. Posizionare i campioni al buio per 5-10 minuti mentre si imposta il viso.

Per eseguire l'elettroforesi a polarità inversa, impostare il metodo, impostare la pressione di iniezione su una forza di 0,5 libbre per pollice quadrato. Quindi impostare la polarità in modalità inversa per la separazione. Diluire il tampone di separazione dei carboidrati legati all'N a un terzo in acqua ultra pura.

Effettuare la separazione apts labelta Glucans nel tampone diluito a 30 kilovolt in un capillare di silice fusa nuda. Quindi impostare il tempo di iniezione e avviare l'analisi. Esportare i file ASC e CDF contenenti rispettivamente il profilo dell'elettroferogramma e i dati di integrazione.

Aprire il file ASC e disegnare l'unità di fluorescenza relativa in base al grafico temporale. Aprire il file CDF. Procedere con una prima integrazione automatica e regolare i seguenti parametri con integrazione da valle a valle e superficie minima.

Controllare e correggere manualmente qualsiasi evento di integrazione improprio. I segnali di fluorescenza osservati tra 4,13 e 4,67 minuti hanno avuto origine dall'APTS non reagito. Il tempo aleutino della maltoesadose DP 6 etichettato è stato stimato in 8,49 minuti.

I glucani marcati APTS del glicogeno bovino sono stati identificati in base al tempo aleutino di DP 6. Nessuna traccia di maltooligosaccharide libero è stata rilevata nel campione di controllo in cui il glicogeno non è stato incubato con enzimi di deramificazione. Il pannello di incasso mostra una separazione delle catene glucani fino a 44 DP. La distribuzione della lunghezza della catena è mostrata come percentuale di DP per ogni DP. La lunghezza media della catena è stata calcolata sommando ogni percentuale di catena volte il corrispondente grado di polimerizzazione.

L'analisi del viso ha mostrato che i glucani più abbondanti sono il maltosio e il fegato di coniglio, il maltoesaosio nell'ostrica e il maltoeptaosio nel fegato bovino. Le distribuzioni della lunghezza della catena del glicogeno purificato da ceppi batterici cianobatterici selvatici e mutanti sono state determinate utilizzando l'analisi del viso. Le analisi sottrattive sono state eseguite sottraendo la percentuale di ogni DP di tipo selvatico dalla percentuale di ogni DP di mutanti.

Le distribuzioni medie di lunghezza della catena del glicogeno da wild type e mutanti di Synechocystis sono state normalizzate in base al picco massimo osservato per ogni CLD. Questa tecnica consente una migliore comprensione delle malattie umane associate a un difetto nel metabolismo del glicogeno, in particolare la malattia di Andersen, ricchi risultati dall'accumulo di particelle di glicogeno anormali nelle cellule.