Determinazione della distribuzione della lunghezza della catena glucano del glicogeno utilizzando il metodo dell'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE)
31 marzo 2022
Nel presente protocollo, la tecnica di elettroforesi dei carboidrati assistiti da fluorofori (FACE) viene utilizzata per determinare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) e la lunghezza media della catena (ACL) del glicogeno.
Questo metodo fornisce una migliore comprensione delle organizzazioni strutturali delle particelle di glicogeno. È una questione importante perché la popolazione delle catene glucaniche, la cosiddetta distribuzione della lunghezza della catena, determina le proprietà chimiche fisiche delle particelle di glicogeno. Come la solubilità in acqua.
Uno dei principali vantaggi di questa tecnica è che la fluorescenza è costante indipendentemente dalla lunghezza della catena glucano. C'è solo una molecola APTS legata dal glucano. Pertanto, l'intensità della fluorescenza è direttamente proporzionale al numero di catene di glucano.
Il campo per l'elettroforesi capillare assistita è adatto a risolvere il meccanismo medico degli enzimi che metabolizzano il glicogeno. Ad esempio, possiamo determinare il grado di polimerizzazione delle catene di glucano trasferite dagli enzimi ramificati sul glucano accettato. La reazione deve essere eseguita in condizioni.
Pertanto, le regioni devono essere protette dall'umidità. Mescolare 200 microlitri di 0,5-2 milligrammi per millilitro di glicogeno purificato con 200 microlitri di tampone di acetato 100 di pH 4,8. Aggiungere 2 microlitri di isoamilasi e 1,5 microlitri di pullulanasi.
Mescolare delicatamente pipettando su e giù. Quindi incubare a 42 gradi Celsius per 16 ore in un tubo da 1,5 millilitri. Interrompere le reazioni incubando a 95 gradi Celsius per 5 minuti.
Centrifugare a 16, 100 volte G'per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettificare e rimuovere qualsiasi materiale insolubile. Rimuovere la super manutenzione con una pipetta e trasferirli su nuovi tubi annotati. Dopo aver aggiunto perline di resina in un tubo di micro-fuga vuoto, dissalare i supernatanti aggiungendo l'equivalente di 100 microlitri di un perle di resina a scambio cationico anionico e agitare.
Raccogliere i campioni mediante pipettaggio e inserirli in nuovi tubi annotati. Congelare i campioni. Conservare i campioni essiccati a temperatura ambiente o 20 gradi Celsius.
Mescolare i campioni essiccati con 2 microlitri di 1 cianoboroidruro di sodio molare e tetraidrofurano e 2 microlitri di 8 aminoacidi 1-3-6 pirene trisolfonico. Incubare a 42 gradi Celsius per 16 ore al buio. Aggiungere 46 microlitri di acqua ultra pura a ciascun campione.
Per diluire i campioni 50 volte, aggiungere un microlitro del campione a 49 microlitri di acqua ultra pura in 100 microlitri. In vortice per mescolare accuratamente. Posizionare i campioni al buio per 5-10 minuti mentre si imposta il viso.
Per eseguire l'elettroforesi a polarità inversa, impostare il metodo, impostare la pressione di iniezione su una forza di 0,5 libbre per pollice quadrato. Quindi impostare la polarità in modalità inversa per la separazione. Diluire il tampone di separazione dei carboidrati legati all'N a un terzo in acqua ultra pura.
Effettuare la separazione apts labelta Glucans nel tampone diluito a 30 kilovolt in un capillare di silice fusa nuda. Quindi impostare il tempo di iniezione e avviare l'analisi. Esportare i file ASC e CDF contenenti rispettivamente il profilo dell'elettroferogramma e i dati di integrazione.
Aprire il file ASC e disegnare l'unità di fluorescenza relativa in base al grafico temporale. Aprire il file CDF. Procedere con una prima integrazione automatica e regolare i seguenti parametri con integrazione da valle a valle e superficie minima.
Controllare e correggere manualmente qualsiasi evento di integrazione improprio. I segnali di fluorescenza osservati tra 4,13 e 4,67 minuti hanno avuto origine dall'APTS non reagito. Il tempo aleutino della maltoesadose DP 6 etichettato è stato stimato in 8,49 minuti.
I glucani marcati APTS del glicogeno bovino sono stati identificati in base al tempo aleutino di DP 6. Nessuna traccia di maltooligosaccharide libero è stata rilevata nel campione di controllo in cui il glicogeno non è stato incubato con enzimi di deramificazione. Il pannello di incasso mostra una separazione delle catene glucani fino a 44 DP. La distribuzione della lunghezza della catena è mostrata come percentuale di DP per ogni DP. La lunghezza media della catena è stata calcolata sommando ogni percentuale di catena volte il corrispondente grado di polimerizzazione.
L'analisi del viso ha mostrato che i glucani più abbondanti sono il maltosio e il fegato di coniglio, il maltoesaosio nell'ostrica e il maltoeptaosio nel fegato bovino. Le distribuzioni della lunghezza della catena del glicogeno purificato da ceppi batterici cianobatterici selvatici e mutanti sono state determinate utilizzando l'analisi del viso. Le analisi sottrattive sono state eseguite sottraendo la percentuale di ogni DP di tipo selvatico dalla percentuale di ogni DP di mutanti.
Le distribuzioni medie di lunghezza della catena del glicogeno da wild type e mutanti di Synechocystis sono state normalizzate in base al picco massimo osservato per ogni CLD. Questa tecnica consente una migliore comprensione delle malattie umane associate a un difetto nel metabolismo del glicogeno, in particolare la malattia di Andersen, ricchi risultati dall'accumulo di particelle di glicogeno anormali nelle cellule.
Panoramica
Questo protocollo utilizza la tecnica dell'Eletroforesi dei Carboidrati Assistita da Fluorofor (FACE) per analizzare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD) e la lunghezza media della catena (ACL) del glicogeno. Comprendere questi parametri è cruciale per chiarire l'organizzazione strutturale e le proprietà delle particelle di glicogeno.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biochimica
- Metabolismo del glicogeno
- Tecniche di elettroforesi
Sfondo
- La distribuzione della lunghezza della catena delle catene di glucano influenza le proprietà fisiche e chimiche del glicogeno.
- L'intensità della fluorescenza in questo metodo è costante, permettendo una quantificazione accurata delle catene di glucano.
- Comprendere la struttura del glicogeno è essenziale per studiare i disturbi metabolici correlati.
- Gli enzimi che metabolizzano il glicogeno giocano un ruolo chiave nel determinare il grado di polimerizzazione delle catene di glucano.
Obiettivo dello studio
- Determinare la distribuzione della lunghezza della catena e la lunghezza media della catena del glicogeno.
- Migliorare la comprensione dell'organizzazione strutturale del glicogeno.
- Investigare le implicazioni della struttura del glicogeno sulle malattie umane, come la malattia di Andersen.
Metodi utilizzati
- Preparazione di campioni di glicogeno con enzimi specifici in condizioni controllate.
- Etichettatura con fluoroforo dei glucani per l'analisi elettroforetica.
- Elettroforesi a polarità inversa per la separazione dei glucani etichettati.
- Analisi dei dati attraverso l'integrazione dei profili dell'elettroferogram.
Risultati principali
- Identificazione di vari glucani basati sul loro grado di polimerizzazione.
- Determinazione delle distribuzioni di lunghezza della catena per il glicogeno da diverse fonti.
- Analisi sottrattive che rivelano differenze tra ceppi wild type e mutanti.
- Incontri sulla relazione tra struttura del glicogeno e disturbi metabolici.
Conclusioni
- La tecnica FACE fornisce un metodo affidabile per analizzare la struttura del glicogeno.
- I risultati contribuiscono alla comprensione delle malattie associate al metabolismo del glicogeno.
- Ulteriori ricerche potrebbero esplorare le implicazioni terapeutiche per i disturbi legati al glicogeno.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding glycogen chain length distribution provides critical insights into metabolic disease mechanisms and enzyme function, supporting target validation in glycogen storage disorders. The FACE method enables quantitative assessment of glucan chain populations, which directly influences glycogen solubility and bioavailability—key considerations in preclinical model development. This structural parameter aids in mechanistic de-risking by linking enzyme activity to phenotypic outcomes in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Quantifies glucan chain length distribution to interrogate therapeutic hypotheses about glycogen branching enzyme function.
- Operational Value: Enables biological de-risking by establishing structure-function relationships between enzyme activity and glycogen particle properties.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by correlating chain length distributions with disease-associated glycogen phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces validated biological systems with quantified chain length distributions for downstream compound screening.
- Quantitative Output: Generates fluorescence-based readouts proportional to glucan chain count, enabling reliable compound evaluation.
- Reproducibility: Standardized electropherogram integration supports assay scalability and cross-platform consistency.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Links glycogen structure to human metabolic disorders like Andersen's disease through abnormal chain length distributions.
- Translational Continuity: Connects discovery-phase enzyme assays to preclinical validation via measurable structural endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by quantifying structural deviations in disease models.
Pipeline & Workflow Integration
The FACE method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical assessment by providing structural readouts that inform enzyme mechanism and disease relevance.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of glycogen metabolizing enzymes by measuring degree of polymerization changes.
- Screening: Delivers assay-ready samples with standardized chain length distribution profiles for compound library evaluation.
- Analytics: Provides electropherogram integration data and chain length percentage outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Connects enzyme mechanism to preclinical outcomes via disease-relevant glycogen structural alterations.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for glycogen structure analysis across multiple disease models and enzyme targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in glycogen metabolism pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through fluorescence intensity proportionality to glucan chain count.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early go/no-go decisions based on structural biomarkers.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization through quantitative chain length distribution comparisons between wild-type and mutant models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in carbohydrate electrophoresis and fluorophore labeling techniques.
- Depends on capillary electrophoresis instrumentation with reverse polarity capability and detection systems for fluorescent compounds.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, enzyme incubation, and electropherogram integration protocols.
- Involves adaptation considerations for different glycogen sources (e.g., bacterial, mammalian) and enzyme conditions.
- Limited by the need for protected reaction conditions to prevent moisture interference during sample preparation.
