Sviluppo e funzionalizzazione di transistor ad effetto di campo in grafene elettrolitico-gated per il rilevamento di biomarcatori
1 febbraio 2022
Il presente protocollo dimostra lo sviluppo del biosensore EGGFET (Electrolyte-gated Graphene Field-Effect Transistor) e la sua applicazione nel rilevamento di immunoglobuline G (IgG) biomarcatori.
Il metodo rimuove efficacemente i residui di PMMA preservando il reticolo di grafene sottostante. Il dispositivo funzionale mostra risultati coerenti nel rilevamento degli anticorpi IgG nel siero del sangue. Inoltre, il protocollo garantisce l'implementazione del grafene CVD in un dispositivo di biorilevamento in tempo reale e privo di etichette.
I passaggi sono piuttosto semplici e possono essere eseguiti con un allenamento minimo. Il dispositivo offre un'elevata selettività, alta sensibilità e rilevamento in tempo reale rispetto ad altri dispositivi di biorilevamento Inizia tagliando il foglio di grafene su un substrato di rame a metà usando un bisturi. Applicare del nastro resistente al calore per fissare i quattro angoli del quadrato di grafene su una guarnizione di spinner.
Rivestire il foglio quadrato del grafene con uno strato sottile da 100 a 200 nanometri di PMMA 495K A4, ruotando a 500 rotazioni al minuto per 10 secondi e poi 2.000 rotazioni al minuto per 50 secondi. Quindi, cuocere il campione a 150 gradi Celsius per cinque minuti. Rimuovere il retro del grafene con plasma di ossigeno a 30 watt utilizzando un flusso di velocità di 15 centimetri cubici standard al minuto per cinque minuti.
Tagliare il quadrato di grafene trattato al plasma in una dimensione di un centimetro di larghezza e due centimetri di altezza per la fabbricazione del dispositivo. Tagliare il substrato di silice pre-pulito in piccoli pezzi con una larghezza approssimativa di quattro centimetri e un'altezza di due centimetri. Incidere il rame usando il cloruro ferrico grafene etchant senza diluizione.
Far galleggiare il campione con il lato in rame verso il basso e il lato pmMA verso l'alto sull'etchant liquido. Dopo l'incisione del rame, sollevare lentamente il film di grafene utilizzando il substrato trattato al plasma. Asciugare all'aria il film di grafene trasferito per due ore, quindi cuocere su una piastra calda.
Per rimuovere il PMMA, iniziare riscaldando il campione con vapore di acetone a 70 gradi Celsius mantenendo il campione circa due centimetri sopra il vapore di acetone per quattro minuti con il lato PMMA rivolto verso il basso. Quindi, immergere il campione in acetone per cinque minuti. Lavare il campione con acqua deionizzata con cautela.
Infine, asciugare delicatamente il campione con azoto. Lavare il substrato con il grafene trasferito utilizzando acetone, alcool isopropilico e acqua deionizzata. Quindi, cuocere il substrato su una piastra calda a 75 gradi Celsius per 30 minuti.
Utilizzando un evaporatore a fascio di elettroni, depositare nichel e oro di 5 e 45 nanometri di spessore, rispettivamente, sul campione di grafene. Applicare il primo processo di fotolitografia utilizzando la maschera A per la modellazione degli elettrodi. Ruotare az 5214E fotoresiste positivo sul campione a 2.000 rotazioni al minuto per 45 secondi e polimerizzare il campione a 120 gradi Celsius per un minuto.
Posizionare il campione nel sistema di esposizione alle inondazioni ultraviolette ed esporlo per circa 10 secondi sotto i 200 millijoule per centimetro quadrato. Sviluppare il campione con uno sviluppatore fotoresist AZ 300 MIF per circa due minuti e quindi risciacquare con acqua deionizzata. Immergere il campione in un'incisione dorata per incidere lo strato d'oro per 10 secondi, risciacquare con acqua deionizzata e rimuovere lo strato di fotoresist rimanente immergendolo nell'acetone per 10 minuti.
Usando acetone, alcool isopropilico e acqua deionizzata, lavare il campione seguito dalla cottura su una piastra calda a 75 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, applicare il secondo processo di fotolitografia utilizzando la maschera B per modellare i canali del grafene. Immergere il campione in nichel etchant a 60 gradi Celsius per incidere lo strato di nichel per 10 secondi.
Risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con azoto. Posizionare il campione nell'asher al plasma e rimuovere il grafene esposto utilizzando plasma di ossigeno. Successivamente, rimuovere lo strato di fotoresistenza immergendolo nell'acetone per 10 minuti.
Lavare il campione con acetone, IPA e acqua deionizzata e cuocere su una piastra calda a 75 gradi Celsius per 30 minuti. Applicare il terzo processo di fotolitografia utilizzando la maschera C per modellare lo strato di fotoresiste di passivazione per proteggere il grafene sottostante sul substrato. Utilizzare gli stessi parametri di processo menzionati in precedenza, tra cui la rotazione con photoresist positivo, la polimerizzazione del campione e lo sviluppo con lo sviluppatore photoresist.
Successivamente, immergere il campione in etchant di nichel a 60 gradi Celsius per 10 secondi per rimuovere lo strato di nichel rimanente, quindi risciacquare con acqua deionizzata e asciugare con azoto. Infine, cuocere il campione su una piastra calda a 120 gradi Celsius per 30 minuti. I risultati rappresentativi mostrano il grafene CVD trasferito caratterizzato da Microscopia Raman e forza atomica.
Il picco G e i picchi bidimensionali dell'immagine Raman forniscono informazioni complete sull'esistenza e la qualità del grafene monostrato trasferito. La figura mostra il biosensore EEG FET integrato con un elettrodo di riferimento standard di argento in cloruro d'argento e un pozzo di polidimetilsilossano per contenere il campione. Inoltre, la vista ingrandita del canale del grafene dimostra la connessione all'elettrodo sorgente al terreno, allo scarico e agli elettrodi gate alla sorgente.
PBASE, un reagente di funzionalizzazione ampiamente utilizzato per il grafene, può essere assorbito sulla superficie del grafene attraverso un'interazione pi-pi senza danneggiare le proprietà elettriche del grafene. Un aptamero IgG ammino-modificato a 5 primi è coniugato con PBASE dai legami di legame ammidico tra l'estere cinnamide reattivo e idrossi-6 in PBASE e il gruppo amminico sull'estremità a 5 primi dell'aptamero IgG. L'incubazione di albumina sierica bovina è stata utilizzata per bloccare i restanti siti non coniugati dopo il risciacquo del dispositivo con PBS a singola forza La figura mostra il rilevamento di IgG in diverse condizioni elettrolitiche.
La qualità del grafene è la chiave per le migliori prestazioni di questo dispositivo. Quindi, durante l'incisione al plasma, è necessario assicurarsi che il plasma non danneggi le regioni utili del grafene. Inoltre, i residui di PMMA devono essere puliti del tutto per ottenere una superficie di grafene pulita.
Il dispositivo funzionale mostra risultati coerenti nel rilevamento di anticorpi IgG umani, quindi la procedura può essere utilizzata come riferimento per costruire dispositivi con altri nanomateriali per studiare le interazioni di interfaccia e il biorilevamento.
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Panoramica
Questo protocollo dimostra lo sviluppo di un biosensore a transistor a effetto di campo al grafene regolato da elettrolita (EGGFET) per la rilevazione di biomarcatori dell'immunoglobulina G (IgG). Il metodo garantisce alta selettività e sensibilità consentendo al contempo il biosensing in tempo reale senza etichetta.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biotecnologia
- Elettronica
Contesto
- Il grafene è un materiale promettente per applicazioni di biosensing.
- I transistor regolati da elettrolita possono migliorare le prestazioni dei biosensori.
- L'immunoglobulina G (IgG) è un biomarcatore cruciale in varie malattie.
- Il rilevamento in tempo reale è essenziale per una diagnostica efficace.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un biosensore utilizzando la tecnologia EGGFET.
- Dimostrare l'applicazione del biosensore nel rilevamento di IgG.
- Fornire un protocollo semplice da seguire per i ricercatori.
Metodi utilizzati
- Taglio di fogli di grafene su un substrato di rame.
- Applicazione di nastro resistente al calore per fissare il grafene.
- Utilizzo di grafene CVD per la fabbricazione del dispositivo.
- Test del dispositivo con campioni di siero sanguigno per il rilevamento di IgG.
Risultati principali
- Il dispositivo mostra risultati coerenti nel rilevamento di anticorpi IgG.
- Sono state raggiunte alta selettività e sensibilità.
- Sono state confermate le capacità di rilevamento in tempo reale.
- Il metodo rimuove efficacemente i residui di PMMA senza danneggiare il grafene.
Conclusioni
- Il biosensore EGGFET è uno strumento promettente per il rilevamento di biomarcatori.
- Offre vantaggi rispetto ai metodi di biosensing tradizionali.
- L'implementazione semplice lo rende accessibile per i ricercatori.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This protocol enables the development of a label-free, real-time biosensor for detecting immunoglobulin G (IgG) biomarkers using electrolyte-gated graphene field-effect transistors (EGGFETs). The method supports early-stage target validation by providing a sensitive, reproducible platform for monitoring biomolecular interactions in complex biological matrices such as blood serum. By ensuring clean graphene transfer and effective functionalization, the approach enhances predictive confidence in biomarker detection assays, facilitating go/no-go decisions in discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of IgG biomarker interactions with high sensitivity and selectivity in native biological samples.
- Operational Value: Provides a label-free detection method that reduces assay complexity and eliminates the need for fluorescent or enzymatic tags.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by allowing real-time monitoring of binding kinetics and affinity under physiological electrolyte conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers quantitative, real-time electrical readouts that enable dose-response analysis and binding specificity screening.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized graphene transfer and PMMA residue removal, minimizing batch-to-batch variability.
- Scalability: Supports platform reuse across multiple biomarker targets via adaptable surface functionalization with aptamers or antibodies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by enabling IgG detection in disease-relevant sample types like human blood serum.
- Risk-Adjusted Advancement: Generates reliable biomarker signal data that inform preclinical candidate selection and assay qualification.
- Disease-Relevant System: Demonstrates functionality in clinically relevant matrices, supporting extrapolation to diagnostic and therapeutic monitoring applications.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis testing in target validation and enabling scalable assay development for lead identification stages.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven screening of biomolecular interactions by detecting target binding in real time without labels.
- Screening: Produces standardized, quantitative outputs suitable for hit confirmation and selectivity profiling in antibody or aptamer-based assays.
- Analytics: Generates electrical signal measurements (e.g., conductance shifts) that allow comparison of binding responses across conditions and analytes.
- Translational Research: Supports continuity into preclinical work by validating biomarker detection in native biological fluids.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biosensor platform adaptable to various biomarkers through modular surface functionalization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence through sensitive, label-free detection of IgG in complex samples.
- Operational Value: Improves reproducibility via controlled graphene transfer and effective cleaning protocols that preserve lattice integrity.
- Strategic Value: Enables faster, data-driven go/no-go decisions by delivering real-time binding data early in discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of biomarker targets based on quantifiable, reproducible assay performance.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, photolithography, and graphene handling for successful device production.
- Depends on access to electron beam evaporators, plasma etchers, and spin coaters for electrode deposition and patterning.
- Necessitates standardization of functionalization and blocking steps (e.g., PBASE-IgG aptamer conjugation, BSA blocking) across users and labs.
- Involves adaptation considerations when extending the platform to other biomarkers or nanomaterial interfaces.
- Includes practical limitations such as the need for careful plasma etching to avoid damaging graphene and thorough PMMA removal to ensure signal fidelity.
