Efficiente strategia di diagnostica della saliva della PCR quantitativa della trascrittasi inversa SARS-CoV-2 utilizzando robot di pipettaggio open source

Abbiamo sviluppato un test diagnostico COVID 19 a basso costo e basato sulla saliva e un flusso di lavoro che è facile da implementare e scalare per applicazioni di screening della comunità su larga scala. Qui utilizziamo robot open source per la gestione dei liquidi, termociclatori standard e software per eseguire test diretti della saliva senza tamponi di estrazione o stabilizzazione, pur fornendo risultati diagnostici accurati. Grazie ai semplici flussi di lavoro paralleli automatizzati, il sistema può essere scalato per eseguire migliaia di test al giorno con requisiti minimi di attrezzature, spazio e personale.

Oltre a Kylie King, Rachel Ham, il nostro supervisore del laboratorio clinico e Austin Smothers il nostro coordinatore dell'istruzione, aiuteranno a dimostrare la procedura Begin decontaminando l'esterno dei tubi di raccolta della saliva con il 70% di etanolo e trasferendoli in laboratorio per i test. Registrare l'arrivo del campione scansionando ciascun codice a barre campione nel foglio di calcolo dell'assunzione giornaliera. Trattare termicamente i campioni di scansione per 30 minuti in un forno a 95 gradi Celsius e quindi rimuovere i campioni utilizzando guanti resistenti al calore.

Aprire i fogli di calcolo giornalieri di caricamento dei campioni per ogni robot di caricamento dei campioni presso la stazione di assegnazione dei campioni. Quindi assegnare 188 campioni a ciascuna piastra da 384 pozzetti. Vassoi per etichette con nome della targa, data e numero di quarto.

Eseguire la scansione dei campioni in ordine nel foglio di calcolo per il caricamento dei campioni. Nella stazione di carico del campione, allineare due set completi di otto rack stampati in 3D, corrispondenti al posizionamento del ponte nel robot. Scomponi i tubi di un quarto e posizionali in rack stampati in 3D, iniziando con la posizione A1 nel rack uno.

Riempi ogni rack da sinistra a destra e dall'alto verso il basso. Continuare questo schema di caricamento nel rack due, quindi procedere ai rack quattro e cinque. Posizionare i rack di campionamento del quarto di un quarto caricati sui ponti uno, due, quattro, cinque, sette, otto, 10, 11.

Posiziona le punte P20 sui ponti tre e nove. Per semplificare il processo di configurazione, caricare i materiali da dietro a davanti nel robot. Le piastre di miscelazione master sono prodotte su un robot dedicato e conservate a quattro gradi Celsius.

Una piastra viene utilizzata alla volta ed è etichettata con il nome della piastra, e una lama affilata viene utilizzata per tagliare una linea nella lamina attorno ai pozzetti di controllo. Posizionare la piastra di miscelazione principale sul ponte sei e staccare il coperchio della lamina, lasciando dietro di sé il piccolo rettangolo che copre i pozzetti di controllo. Scopri le scatole di punta e chiudi il robot.

Inizializzare il protocollo operativo Python personalizzato facendo clic su Avvia esecuzione tramite l'applicazione desktop robot. Ogni trimestre impiega 24,5 minuti per caricarsi sul piatto. Imposta un timer come promemoria.

Mentre il robot è in funzione, sblocca e carica due provette campione nel secondo set di rack stampati in 3D. Quando il robot si mette in pausa, rimuovere i rack di un quarto e sostituirli con i rack del quarto due, quindi fare clic su Riprendi esecuzione nell'applicazione desktop. Ricapitolare le provette del campione di un quarto e conservarle in un frigorifero a quattro gradi Celsius in attesa dei risultati.

Ripetere questo processo di caricamento per i quarti tre e quattro. Trasferire la piastra caricata in un armadio di sicurezza bio. Per ridurre al minimo la contaminazione, mantenere la piastra coperta durante il trasferimento.

Raccogliere eventuali campioni ripetuti e assegnarli come ultimi campioni nel quarto trimestre. Numera i campioni, scansiona i codici a barre e inserisci la posizione del campione originale e il risultato nel foglio di calcolo del caricamento del campione. Trasferire i campioni ripetuti nell'armadio di sicurezza bio.

Non caricare i tubi di campionamento ripetuti nei rack di carico del robot. Pipettare due microlitri di ogni campione ripetuto ai pozzetti corretti. Utilizzare la pipetta designata per aggiungere campioni di pazienti.

Mantenere i pozzetti di controllo coperti con un foglio mentre si aggiungono campioni per ridurre al minimo la contaminazione. Staccare il coperchio della lamina sui pozzetti di controllo usando una pinza. Pipettare due microlitri di campioni di pazienti positivi confermati nei pozzetti M23 e M24.

Pipettare due microlitri di acqua priva di nucleasi ai pozzi da N23 a N24 e due microlitri di 200 copie per microlitro misto a controllo positivo ai pozzi da O23 a O24. Lasciare vuoti i pozzetti da P23 a P24 per monitorare la qualità del lotto di miscelazione principale. Coprire la piastra con una guarnizione otticamente trasparente e utilizzare il rullo applicatore per aderire a tutti i pozzetti.

Ruotare la piastra a 2.500 giri / min per 30 secondi per miscelare accuratamente, quindi centrifugare la piastra a 500 volte G per un minuto. Selezionare il programma del protocollo nel software del termociclatore e salvare il protocollo per le piastre future. Posizionare la piastra sigillata nel termociclatore ed eseguire il protocollo.

Esportare i valori CT e copiarli nel foglio di calcolo del caricamento del campione. Per il controllo positivo, verificare se almeno un pozzo di controllo positivo produce valori CT compresi tra 22 e 28 per entrambe le sonde P1 e N1. In alternativa, i pozzi campione positivi noti producono valori CT P1 e N1 inferiori a 33 sulle sonde P1 e N1.

Per il controllo negativo, verificare che non vi siano valori CT N1 o P1 in nessuno dei due pozzetti di controllo negativi. Verificare che i valori CT abbiano curve di amplificazione valide prima di invalidare la piastra. Se P1 produce un risultato di CT inferiore a 33, considerare il pozzo come valido e procedere al risultato da N1. Se P1 produce un risultato di CT maggiore o uguale a 33 o nessun valore CT, considerare il pozzo come non valido.

Se N1 produce un risultato di CT inferiore a 33, valutare il bene come sì. Se N1 non produce un valore CT, valutare il bene come no. Se N1 produce un valore CT maggiore o uguale a 33, valutare il pozzo come nessuna stella.

Confermare che tutti i valori ct N1 siano associati a una curva di amplificazione reale. Se un valore CT per N1 non ha curva di amplificazione, il pozzo è no. Identificare i campioni ripetuti, etichettarli con un numero di campione interno e un tipo di campione e restituirli al flusso di lavoro di caricamento.

Le immagini rappresentative mostrano il rilevamento RTQ PCR di N1 o SARS CoV-2 RNA sintetico e P1 o HSRPP30 DNA sintetico. Le curve standard sono state tracciate con deviazioni standard per determinare l'intervallo di rilevamento accurato utilizzando questa combinazione di primer per sonda. I valori medi di TC ottenuti nelle rispettive diluizioni sono stati tracciati rispetto alla quantità stimata di RNA sintetico e DNA sintetico.

In entrambi i casi, le curve lineari hanno mostrato buoni coefficienti di correlazione in una vasta gamma di concentrazioni di copie geniche. I valori N1 CT ottenuti da campioni unici utilizzando sia il robot che il caricamento manuale del campione sono stati trasposti per determinare la variabilità tra il carico manuale e quello robot. La relazione lineare tra i metodi manuali e automatizzati ha prodotto un alto coefficiente di correlazione che indica che entrambi i metodi sono funzionalmente equivalenti.

La variabilità intra-test è stata determinata anche utilizzando valori CT N1 replicativi trasposti ottenuti sia dal robot che dal caricamento manuale del campione. La valutazione dei metodi di trattamento termico per la riduzione della viscosità nella saliva è mostrata qui. La saliva sars CoV-2 negativa è stata raccolta da un'unica fonte e le aliquote sono state trattate termicamente per zero minuti, 30 minuti o 60 minuti a 95 gradi Celsius.

I valori di P1 CT da repliche tecniche di ciascuna condizione sono stati tracciati per determinare la variabilità tra i metodi di trattamento. Entrambi i metodi di trattamento termico di 30 minuti e 60 minuti hanno prodotto una variabilità del campione significativamente ridotta rispetto a nessun controllo del trattamento. Non c'era differenza significativa tra trattamenti di 30 minuti e 60 minuti.

Pertanto è stato implementato il metodo di trattamento termico di 30 minuti per ridurre i tempi di lavorazione. Utilizzare una tecnica asettica adeguata per ridurre al minimo la contaminazione delle piastre di prova, in particolare durante il caricamento di campioni e controlli manuali. Evitare di attraversare il piatto con le mani o le maniche.

Dopo che i risultati clinici sono stati prodotti, i campioni possono essere smaltiti in rifiuti a rischio biologico o possono essere salvati per ulteriori analisi, come il sequenziamento dell'intero genoma per determinare ceppi specifici. Questa tecnica consente test di comunità su larga scala, che ci consentono di indagare gli effetti della copertura dei test e la diffusione non sintomatica di Covid 19.