Name: Isolamento del nucleo a basso ingresso e multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dellRNA a nucleo singolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Impara l'isolamento del nucleo a basso ingresso e il multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo. Questo metodo consente di caratterizzare i neuroni simpatici cardiaci in condizioni fisiologiche e patologiche.

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Ringraziamo Susan L. Kloet (Dipartimento di Genetica Umana, LUMC, Leida, Paesi Bassi) per il suo aiuto nella progettazione sperimentale e nelle discussioni utili. Ringraziamo Emile J. de Meijer (Dipartimento di Genetica Umana, LUMC, Leida, Paesi Bassi) per l'aiuto con l'isolamento dell'RNA a nucleo singolo e la preparazione della libreria per il sequenziamento. Questo lavoro è supportato dall'Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO) [016.196.346 to M.R.M.J.].

Questo protocollo descrive tutti i passaggi necessari per lo snRNA-seq dei gangli murini cervicali e/o cervicotoracici (stellati). Sono stati utilizzati topi C57BL / 6J femminili e maschili (15 settimane, n = 2 per ogni sesso). Un ulteriore mouse Wnt1-Cre;mT/mG è stato utilizzato per visualizzare i gangli per scopi di dissezione17,18. Questo mouse aggiuntivo è stato generato dall'incrocio di un mouse B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J e di un mouse B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal NIH e approvata dal Comitato etico animale dell'Università di Leida (numero di licenza AVD1160020185325, Leida, Paesi Bassi). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature, il software e gli animali utilizzati nel protocollo.
1. Preparativi
NOTA: tutti i passaggi vengono eseguiti in un armadio del flusso di coltura cellulare.
<ol><li>Pulire pinze e forbici immergendo gli strumenti in etanolo al 70% per 20 min.</li>
	<li>Preparare il mezzo gangliare costituito da Neurobasal Medium integrato con B-27 plus (1x), L-glutammina (2 mM) e 1% Antibiotico-Antimicotico. Preriscaldare il mezzo gangliare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare la soluzione di digestione: 0,25% di tripsina-EDTA (1:1) e 1.400 U/mL di collagenasi di tipo 2 disciolta nel mezzo gangliare.</li>
	<li>Preparare tampone di lavaggio cellulare fresco e freddo (4 °C) (0,4% albumina sierica bovina [BSA]) e tampone di lisi (10 mM Tris-HCl, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2 e detergente non ionico allo 0,1%, 40 U/mL RNAsi in acqua priva di nucleasi) per l'isolamento del nucleo.</li>
	<li>Preparare il tampone di lavaggio del nucleo (1x soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] con BSA al 2,0% e inibitore della RNasi 0,2U/μL).</li>
	<li>Preparare il tampone di colorazione ST (ST-SB) (10 mM Tris-HCl, 146 mM NaCl, 21 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 2% BSA, 0,02% Tween-20 in acqua priva di nucleasi).</li>
</ol>2. Dissezione dei gangli cervicali superiori del topo adulto (SCG)
<ol><li>Eutanasia dei topi e tenerli sul ghiaccio. NOTA: Nel presente studio, un totale di 4 topi C57BL6 / J sono stati eutanasizzati dall'asfissia di CO2 . In alternativa, l'isoflurano può essere utilizzato seguito da dissanguamento quando è necessario raccogliere una grande quantità di sangue per altri scopi di studio.</li>
	<li>Fissare il mouse su un pannello di dissezione con perni e bagnarlo con etanolo al 70% per ridurre al minimo la dispersione della pelliccia (la rasatura non è necessaria).</li>
	<li>Sotto uno stereomicroscopio, aprire la pelle della regione del collo facendo un taglio della linea mediana con le forbici, spostare le ghiandole sottomandibolari da parte e rimuovere il muscolo sternomastoideo per esporre e localizzare l'arteria carotide comune e la sua biforcazione (Figura 1A, B, vedi freccia).</li>
	<li>Sezionare la biforcazione dell'arteria carotide destra e sinistra e il tessuto ad essa collegato. Trasferire ogni pezzo di tessuto sezionato in una capsula di Petri separata di 3,5 cm contenente PBS freddo.</li>
	<li>Cerca l'SCG attaccato alla biforcazione carotidea. Pulire ulteriormente l'SCG rimuovendo l'arteria e altro tessuto attaccato nella capsula di Petri (Figura 1E).</li>
</ol>3. Dissezione dei gangli stellati del topo adulto (StG)
<ol><li>Per sezionare lo StG, fai un taglio della linea mediana nell'addome, seguito dall'apertura del diaframma e della parete toracica ventrale.</li>
	<li>Rimuovere il cuore e i polmoni per esporre il torace dorsale. Cerca l'anterolaterale StG sinistro e destro al musculus colli longus (MCL) a livello della prima costola (Figura 1C, D, indicata da linee tratteggiate).</li>
	<li>Sezionare sia l'StG sinistro che quello destro con una pinza e trasferirli separatamente su piastre di Petri da 3,5 cm contenenti PBS freddo (Figura 1F). ​</li>
</ol>4. Isolamento e crioconservazione delle cellule gangliari di topo
I passaggi da 4 a 6 sono riepilogati nella Figura 2.
<ol><li>Trasferire con cura tutti i singoli SCG e StG per separare i tubi microcentrifuga da 1,5 ml con pinza. NOTA: non utilizzare punte di pipette per trasferire i gangli perché i gangli sono inclini ad aderire alla parete delle punte delle pipette di plastica.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% a ciascun tubo di microcentrifuga e incubare in un bagno d'acqua agitato a 37 °C per 40 minuti. NOTA: Questo passaggio ha lo scopo di facilitare la digestione e il rilascio cellulare in seguito nella soluzione di collagenasi di tipo 2.</li>
	<li>Preparare un tubo da 15 ml contenente 5 mL di substrato gangliare per ciascun campione. Lasciare che i gangli si depositino sul fondo dei tubi della microcentrifuga. Raccogliere il surnatante, che contiene pochissime cellule gangliari, trasferire il surnatante ai tubi da 15 ml preparati ed etichettare ogni tubo. In alternativa, per risparmiare un po 'di tempo, aspirare il surnatante tripsina-EDTA senza raccolta poiché pochissime cellule dissociate possono essere rilevate in esso. NOTA: Una piccola quantità di soluzione di tripsina-EDTA (~10-30 μL) può essere lasciata nel tubo microcentrifuga per evitare la rimozione dei gangli. Evitare il pipettaggio in questa fase perché potrebbe danneggiare i gangli e portare a una bassa produzione di cellule gangliari in seguito.</li>
	<li>Aggiungere 500 μL di soluzione di collagenasi di tipo 2 in ogni tubo di microcentrifuga e incubare a bagno d'acqua agitato a 37 °C per 35-40 minuti. Prova a risospendare il ganglio dopo 35 minuti; se il ganglio è ancora intatto e non si dissocia, prolungare il tempo di incubazione o aumentare la concentrazione di collagenasi di tipo 2, se necessario. NOTA: Il tempo di incubazione potrebbe variare a seconda delle dimensioni del ganglio.</li>
	<li>Risospesciare i gangli in soluzione di collagenasi tubando su e giù ~ 10 volte o fino a quando i grumi di tessuto non vengono più rilevati.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare sul tubo da 15 ml precedentemente utilizzato che contiene il terreno di coltura dei gangli e la sospensione di tripsina-EDTA dallo stesso ganglio. Ruotare la sospensione cellulare con una centrifuga a rotore a benna oscillante per 10 minuti, 300 × g a temperatura ambiente. Scartare con attenzione il surnatante cellulare. NOTA: Poiché le cellule gangliari sono dissociate da un singolo ganglio, il pellet cellulare potrebbe essere troppo piccolo per essere rilevato a occhio; una piccola quantità di surnatante può essere lasciata nel tubo per evitare la rimozione accidentale del pellet cellulare.</li>
	<li>Risospese le cellule gangliari in 270 μL di siero bovino fetale (FBS, bassa endotossina) e trasferire ogni sospensione cellulare-FBS in un crioviale da 1 mL.</li>
	<li>Per contare le cellule, mescolare 5 μL della sospensione cellulare gangliare con 5 μL di colorante blu tripano allo 0,4% e caricare la miscela in un emocitometro. Contare il numero totale e di cellule vive al microscopio. NOTA: La vitalità cellulare (conteggio delle cellule vive/conta cellulare totale = vitalità %) è solitamente superiore al 90% con questo protocollo di dissociazione. Il conteggio delle cellule vive di un singolo ganglio (SCG o StG) di solito rientra nell'intervallo di 9.000-60.000 cellule quando il ganglio è isolato da un topo di età compresa tra 12 e 16 settimane.</li>
	<li>Aggiungere 30 μL di dimetilsolfossido (DMSO) a ciascuna sospensione cellulare-FBS nei crioviali, mescolare bene e trasferire i crioviali in un contenitore di congelamento cellulare, che viene mantenuto a temperatura ambiente. Conservare il contenitore crioviale caricato a -80 °C durante la notte e trasferire i crioviali in azoto liquido il giorno successivo per una conservazione a lungo termine prima del sequenziamento.</li>
</ol>5. Isolamento del nucleo
NOTA: L'SCG sinistro e destro isolati da quattro topi (in totale 8 campioni) sono stati utilizzati come esempio nella seguente preparazione all'isolamento del nucleo e al sequenziamento. Tenere tutto sul ghiaccio durante l'intera procedura. A causa dell'invisibilità dei piccoli pellet a nucleo, una centrifuga con secchi oscillanti è altamente raccomandata per facilitare la rimozione del surnatante durante l'intera procedura.
<ol><li>Preparare tubi da 15 mL con un colino (30 μm) sulla parte superiore e prerinsere il colino con 1 mL del mezzo gangliare.</li>
	<li>Estrarre i crioviali dall'azoto liquido e scongelarli immediatamente a bagnomaria a 37 °C. Quando un piccolo pellet di ghiaccio viene lasciato nella crioviale, togliere le crioviali dal bagno d'acqua.</li>
	<li>Recuperare le cellule gangliari facendo cadere 1 mL del mezzo gangliare in ogni crioviale mentre si agita attentamente a mano. Facoltativo: per valutare il recupero cellulare, mescolare la sospensione cellulare dopo il recupero e prelevare 5 μL di sospensione cellulare per il conteggio delle cellule vive, come descritto nel passaggio 4.8.</li>
	<li>Caricare ogni sospensione di cellule gangliari su un filtro separato (preparato nella fase 5.1) e risciacquare ogni colino con 4-5 ml di mezzo gangliare.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare tesa per 5 minuti a 300 × g, rimuovere accuratamente il surnatante e risospesere le cellule in 50 μL di tampone di lavaggio cellulare.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifugale DNA/RNA da 0,5 mL a basso legame.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 500 × g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere 45 μL del surnatante senza toccare il fondo del tubo per evitare di spostare il pellet cellulare.</li>
	<li>Aggiungere 45 μL di Lysis Buffer refrigerato e pipettare delicatamente su e giù utilizzando una punta della pipetta da 200 μL.</li>
	<li>Incubare le cellule per 8 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di tampone di lavaggio a nucleo freddo a ciascun tubo. Non mescolare.
</li>
	<li>Centrifugare la sospensione del nucleo a 600 × g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere 95 μL del surnatante senza interrompere il nucleo del pellet.</li>
	<li>Aggiungere 45 μL di tampone di lavaggio a nucleo refrigerato al pellet. Opzionale: prendere 5 μL di sospensione del nucleo, mescolare con 5 μL di 0,4% di tripano blu per contare e controllare la qualità dei nuclei al microscopio con un emocitometro.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione del nucleo a 600 × g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il surnatante senza toccare il fondo del tubo per evitare di spostare il nucleo pellet.</li>
</ol>6. Nucleus barcoding con hashtag oligos (HTO) e multiplexing
NOTA: le fasi di colorazione HTO sono state modificate e ottimizzate per l'etichettatura nucleare di quantità molto basse di nuclei (gangliari) secondo la precedente applicazione nel tessuto corticale di Gaublomme et al.15.
<ol><li>Aggiungere 50 μL di tampone ST-SB al pellet del nucleo, pipettare delicatamente 8-10 volte fino a quando i nuclei non sono completamente risospesi.</li>
	<li>Aggiungere 5 μL di reagente fc blocking per 50 μL della miscela ST-SB/nuclei e incubare per 10 minuti sul ghiaccio.</li>
	<li>Aggiungere 1 μL (0,5 μg) di anticorpo hashtag a nucleo singolo per tubo del mix ST-SB/nuclei e incubare per 30 minuti sul ghiaccio. NOTA: tempi di incubazione più brevi portano a una minore efficienza dell'etichettatura degli hashtag, come dimostrato nei risultati rappresentativi.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di ST-SB a ciascun tubo. Non mescolare.
</li>
	<li>Centrifugare la sospensione del nucleo per 5 min, 600 × g a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere 145 μL del surnatante senza interrompere il nucleo pellet.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 6.4 e 6.5. Rimuovere il surnatante il più possibile senza toccare il fondo del tubo per evitare di spostare il nucleo pellet.</li>
	<li>Risospendare il nucleo del pellet in 50 μL di ST-SB e mescolare delicatamente i nuclei.</li>
	<li>Prendi 5 μL della sospensione del nucleo e mescolala con 5 μL di 0,4% di tripano blu per contare i nuclei al microscopio. Vedere la Figura 3A per un'immagine rappresentativa di nuclei mescolati con tripano blu e caricati in un emocitometro.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione del nucleo per 5 min a 600 × g a 4 °C.</li>
	<li>Sospendere i nuclei in ST-SB per raggiungere una concentrazione target di nucleo di 1.000-3.000 nuclei/ μL per ciascun campione in base alla corrispondente conta dei nuclei.</li>
	<li>Raggruppare i campioni per ottenere il numero desiderato di celle. NOTA: Ad esempio, in questo esperimento, 8 campioni sono stati ugualmente raggruppati per ottenere un totale di 25.000 nuclei per procedere immediatamente a 10x Genomics Chromium e snRNA-seq in seguito. Il numero di nuclei di solito rientra nell'intervallo di 6.000-40.000 cellule quando il ganglio è isolato da un topo di età compresa tra 12 e 16 settimane. Solo circa la metà dei nuclei caricati totali può essere catturata da snRNA-seq a base di goccioline. Ad esempio, è stata preparata una miscela di 25.000 nuclei per garantire la cattura di 10.000 nuclei, necessaria per un'ulteriore preparazione e sequenziamento della libreria.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Qui, viene descritto un protocollo dettagliato che si concentra su i) la dissezione dei gangli simpatici cervicali e stellati superiori del topo adulto, ii) l'isolamento e la crioconservazione delle cellule gangliari, iii) l'isolamento del nucleo e iv) il nucleo-barcoding con etichettatura HTO per scopi multiplexing e snRNA-seq.
Con questo protocollo, le cellule gangliari simpatiche possono essere facilmente ottenute dissociando i singoli gangli usando tripsina e collagenasi comunemente usate....

Il sistema nervoso autonomo (ANS) è una parte cruciale del sistema nervoso periferico che mantiene l'omeostasi del corpo, compreso l'adattamento alle condizioni ambientali e alla patologia1. È coinvolto nella regolazione di più sistemi di organi in tutto il corpo come i sistemi cardiovascolare, respiratorio, digestivo ed endocrino. L'ANS è diviso in rami simpatici e parasimpatici. Rami spinali della sinapsi del sistema nervoso simpatico nei gangli della catena simpatica, situati bilateralmente in posizione paravertebrale. I gangli cervicali e toracici bilaterali, in particolare l'StG, sono componenti importanti che partecipano all'innervazione simpatica cardiaca. Negli stati patologici, come l'ischemia cardiaca, può verificarsi un rimodellamento neuronale, con conseguente overdrive simpatico2. Il rimodellamento neuronale è stato dimostrato in molteplici studi istologici sull'uomo e su diverse altre specie animali 3,4,5,6. Attualmente manca una caratterizzazione biologica dettagliata del rimodellamento neuronale indotto da ischemia cardiaca nei gangli simpatici cardiaci e le caratteristiche biologiche fondamentali di tipi o sottotipi di cellule neuronali specializzate all'interno del sistema nervoso simpatico cardiaco (SNS) non sono ancora completamente determinate in salute e malattia7.
Nuove tecnologie, come scRNA-seq, hanno aperto porte per la caratterizzazione genetica di piccoli tessuti a livello di singola cellula 8,9. Tuttavia, le dimensioni relativamente grandi dei neuroni possono impedire l'uso ottimizzato di queste tecniche a singola cellula negli esseri umani10. Inoltre, il sequenziamento a singola cellula richiede un elevato rendimento di cellule per recuperare un numero di cellule sufficiente a causa di un'elevata perdita nel processo di sequenziamento. Ciò potrebbe rivelarsi difficile quando si studiano piccoli tessuti che sono difficili da catturare in una sessione e richiedono più campioni per introdurre abbastanza singole cellule per il sequenziamento. La tecnologia snRNA-seq basata su goccioline recentemente sviluppata (cioè la piattaforma 10x Chromium) consente lo studio delle differenze biologiche tra i singoli nuclei 11,12. snRNA-seq detiene un vantaggio rispetto a scRNA-seq per le cellule di grandi dimensioni (>30 μm), che potrebbero non essere catturate in Gel Bead in Emulsions (GEMs), nonché una migliore compatibilità con dissociazione estesa e / o conservazione prolungata 13,14,15.
L'eterogeneità, il numero di cellule neuronali e altre cellule arricchite nel SNS cardiaco sono aspetti importanti per la caratterizzazione dell'ANS negli stati di salute e malattia. Inoltre, l'innervazione specifica dell'organo o della regione da parte di ciascun ganglio simpatico contribuisce alla complessità del SNS. Inoltre, i gangli cervicali, stellati e toracici della catena simpatica hanno dimostrato di innervare diverse regioni del cuore16. Pertanto, è necessario eseguire l'analisi a nucleo singolo di cellule gangliari derivate da singoli gangli per studiare la loro architettura biologica.
Lo snRNA-seq basato su goccioline consente la profilazione dell'espressione a livello di trascrittoma per un pool di migliaia di cellule da più campioni contemporaneamente con costi inferiori rispetto alle piattaforme di sequenziamento basate su piastre. Questo approccio consente a snRNA-seq basato su goccioline di essere più adatto per la classificazione del fenotipo cellulare e l'identificazione di nuove sottopopolazioni di cellule all'interno del SCG e del StG. In particolare, questo protocollo fornisce un approccio graduale conciso per l'identificazione, l'isolamento e il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo dei gangli cardiaci estrinseci simpatici, un metodo che ha il potenziale per un'ampia applicazione negli studi sulla caratterizzazione dei gangli che innervano altri organi e tessuti correlati in salute e malattia.

<table><tbody><tr><td><forte>Sostanze chimiche e reagenti</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>0,4% tripano colorante blu</td><td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotico-Antimicotico</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>A3582801</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td>utilizzare 1.400 U/mL</td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>67685</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo assoluto &ge; 99,5%</td><td>VWR</td><td>VWRC83813.360</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (basso contenuto di endotossine)</td><td>Biowest</td><td>S1810-500</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific 25030024</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Medium Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>Tampone per lavaggio cellulare</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+free)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td><td>Tampone per lavaggio cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di magnesio, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>Tampone per lisi del nucleo</td></tr><tr><td>Nonidet P40 Sostituto (detergente non ionico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td>Tampone per lisi del nucleo</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi (non trattata con DEPC)</td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>Tampone</td></tr> <tr><td>per lisi del nucleoInibitore della RNasi Protector, 40 U/&micro; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Tampone per lisi del nucleo</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di sodio, 5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>Tampone per lisi del nucleo</td></tr><tr><td>Soluzione di cloridrato Trizma, 1 M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>Tampone per lisi del nucleo</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>Lavaggio del nucleo</td></tr><tr><td>DPBS (Ca2+, Mg2+free)</td><td>Gibco</td><td>14190-169</td> Inibitore della RNasi <td>del protettore del lavaggio del nucleo,40</td></tr><tr><td>U/&micro; L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3335399001</td><td>Nucleus wash</td></tr><tr><td>Siero bovino albumina 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1595-50ML</td><td>ST tampone di colorazione (ST-SB)</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di calcio, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115-100ML</td><td>ST tampone di colorazione (ST-SB)</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di magnesio, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td>ST TAMPONE DI COLORAZIONE (ST-SB)</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi (non DEPC </td><td>Invitrogen</td><td>AM9937</td><td>TAMPONE DI COLORAZIONE ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>Soluzione di cloruro di sodio, 5M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td>ST TAMPONE DI COLORAZIONE (ST-SB)Soluzione</td></tr> di <tr><td>cloridrato Trizma, 1M, pH 7,4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td>S.R.L.D.B.S.</td></tr><tr><td>)Tween-20</td><td>Merck Millipore</td><td>822184</td><td>tampone di colorazione ST (ST-SB)</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0451 anti-nucleare Pore Complex Proteins Hashtag 1 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>682205</td><td>Hashtag anticorpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0452 anti-nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>682207</td><td>Hashtag anticorpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0453 anti-nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Anticorpo</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Biolegend 682209 HashtagTotalSeq-A0461 anti-nucleare Pore Complex Proteins Hashtag 11 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>682225</td><td>Hashtag anticorpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0462 anti-nucleare Pore Complex Proteins Hashtag 12 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>682227</td><td>Hashtag anticorpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0463 anti-nucleare Pore Complex Proteins Hashtag 13 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>682229</td><td>Hashtag</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0464 Proteine del complesso dei pori antinucleari Hashtag 14 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>682231</td><td>Hashtag anticorpo</td></tr><tr><td>TotalSeq-A0465 Proteine del complesso dei pori antinucleari Hashtag 15 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>682233</td><td>Hashtag anticorpo</td></tr><tr><td>TruStain FcX (umano)</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Soluzione di blocco del recettore FC</td></tr><tr><td>Attrezzature e materiali di consumo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Linea luminosa&nbsp; Ematocitometro</td><td>Merck</td><td>Z359629-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5702/R A-4-38</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>EP022629905</tr><tr><td>Contenitore per il congelamento delle cellule CoolCell LX</td><td>Corning</td><td>CLS432003-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Scientific</td><td>479-6840</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 0,5 mL Provetta Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>EP0030108035-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Provette Eppendorf Safe-Lock 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121872</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm Piastra Petri non trattata con TC</td><td>Corning</td><td></td><td></td>351008</tr><tr><td>Falcon 15 mL Provette da centrifuga coniche</td><td>Fisher scientific</td><td>10773501</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont #5</td><td>Strumenti per la scienza</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Forbici fini temprate Strumenti per</td><td>la scienza 14091-09</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Ice Pan, rettangolare 4 L Arancione</td><td>Corning</td><td>CLS432106-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Leica MS5</td><td>Leica Microscopio</td><td>Moria</td><td></td></tr><tr><td>MC50 Forbici</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>15370-50</td><td></td></tr><tr><td>Noyes Forbici a molla Strumenti</td><td>per le scienze</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>Olympus CK2 ULWCD</td><td>Microscopio Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P10</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr> Filtri di preseparazione <tr><td>P1000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>(30 &; micro; m)</td><td>Miltenyi biotec</td><td>Miltenyi biotec130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua di agitazione</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr><tr><td>Piastra siliconica</td><td>RubberBV</td><td>3530</td><td>Scheda di dissezione</td></tr><tr><td>Software e pacchetti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell ranger</td><td>V4.0.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programmazione R</td><td>V4.1.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R sudio</td><td>V1.3.1073</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>V4.0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tydiverse</td><td>V1.3.1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>B6. Topo Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J</td><td>Il ceppo JAX del Jackson Laboratory</td><td>#022501</td><td></td></tr><tr><td>B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J topo</td><td>Il</td><td>ceppo JAX</td> del Jackson Laboratory #007576 <td></td></tr><tr><td>C57BL/6J topi</td><td>Charles River</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Codice per l'analisi dei dati</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE</tr></tbody></table>

isolamento del nucleo a basso ingresso e multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dell'rna a nucleo singolo

Low-input Nucleus Isolation and Multiplexing with Barcoded Antibodies of Mouse Sympathetic Ganglia for Single-nucleus RNA Sequencing

Il sistema nervoso autonomo cardiaco è cruciale nel controllo della funzione cardiaca, come la frequenza cardiaca e la contrattilità cardiaca, ed è diviso in rami simpatici e parasimpatici. Normalmente, c'è un equilibrio tra questi due rami per mantenere l'omeostasi. Tuttavia, stati di malattia cardiaca come infarto miocardico, insufficienza cardiaca e ipertensione possono indurre il rimodellamento delle cellule coinvolte nell'innervazione cardiaca, che è associata a un esito clinico avverso.
Sebbene ci siano grandi quantità di dati per la struttura istologica e la funzione del sistema nervoso autonomo cardiaco, la sua architettura biologica molecolare in salute e malattia è ancora enigmatica in molti aspetti. Nuove tecnologie come il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) sono promettenti per la caratterizzazione genetica dei tessuti a risoluzione unicellulare. Tuttavia, le dimensioni relativamente grandi dei neuroni possono impedire l'uso standardizzato di queste tecniche. Qui, questo protocollo sfrutta il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo basato su goccioline (snRNA-seq), un metodo per caratterizzare l'architettura biologica dei neuroni simpatici cardiaci in salute e malattia. È stato dimostrato che un approccio graduale esegue snRNA-seq dei gangli cervicali superiori bilaterali (SCG) e stellati (StG) sezionati da topi adulti.
Questo metodo consente la conservazione del campione a lungo termine, mantenendo un'adeguata qualità dell'RNA quando i campioni di più individui / esperimenti non possono essere raccolti tutti in una volta in un breve periodo di tempo. La codifica a barre dei nuclei con oligo hashtag (HTO) consente il demultiplexing e il trace-back di campioni gangliari distinti dopo il sequenziamento. Analisi successive hanno rivelato la cattura dei nuclei di successo delle cellule neuronali, gliali satelliti ed endoteliali dei gangli simpatici, come convalidato da snRNA-seq. In sintesi, questo protocollo fornisce un approccio graduale per snRNA-seq di gangli cardiaci estrinseci simpatici, un metodo che ha il potenziale per un'applicazione più ampia negli studi sull'innervazione di altri organi e tessuti.

Analisi del controllo qualità della preparazione della libreria di cDNA a nucleo singolo e snRNA-seq I risultati rappresentativi descrivono i risultati del sequenziamento di 10.000 nuclei catturati in un singolo pool con una libreria di espressione genica di 25.000 letture / nucleo e una libreria di hashtag di 5.000 letture / nucleo. La Figura 3B illustra i risultati del controllo di qualità del cDNA del 1° filamento, della libreria di espressione genica (GEX) ...

Questo protocollo descrive la preparazione dettagliata e a basso input del campione per il sequenziamento a nucleo singolo, compresa la dissezione dei gangli cervicali e stellati superiori del topo, la dissociazione cellulare, la crioconservazione, l'isolamento del nucleo e il codice a barre hashtag.

Isolamento del nucleo a basso ingresso e multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo

The cardiac autonomic nervous system is crucial in controlling cardiac function, such as heart rate and cardiac contractility, and is divided into ...

In questo protocollo JoVE, utilizziamo il sequenziamento dell'RNA a singolo nucleo basato su goccioline per caratterizzare l'architettura biologica dei neuroni simpatici cardiaci in salute e malattia. Questo metodo consente il sequenziamento di una vasta collezione di campioni neuronali per un periodo di tempo. Tirando nuclei con codice a barre con hashtag oligos, questo metodo consente il multiplexing dei campioni.Questo metodo ha il potenziale per essere esteso ai neuroni di sequenziamento dei gangli umani, che è stato difficile a causa delle sue grandi dimensioni cellulari e della difficile raccolta simultanea di campioni. A dimostrare la procedura saranno Conny van Munsteren, tecnico di ricerca, e Lieke van Roon, dottorandi del nostro laboratorio Begin raccogliendo tutti i materiali necessari per la dissezione, quindi fissando il mouse sulla scheda di dissezione. Bagnare il mouse con etanolo al 70% per ridurre al minimo la dispersione della pelliccia.Apri la pelle della regione del collo facendo un taglio della linea mediana con le forbici. Sotto uno stereomicroscopio, spostare le ghiandole sotto-mandibolari da parte e rimuovere il muscolo mastoideo sternale per esporre l'arteria carotide comune e la sua biforcazione, così come i gangli cervicali superiori e rimuovere il tessuto attaccato ad esso. Sezionare la biforcazione dell'arteria carotide destra e sinistra e il tessuto ad essa collegato.Trasferire ogni pezzo di tessuto sezionato in una capsula di Petri separata di 3,5 centimetri contenente PBS freddo. Individuare i gangli cervicali superiori attaccati alla biforcazione carotidea. Pulire i gangli cervicali superiori rimuovendo l'arteria e il tessuto attaccato.Per sezionare i gangli stellati, fare un taglio della linea mediana nell'addome, seguito dall'apertura del diaframma e della parete toracica ventrale. Rimuovere i polmoni, seguiti dal cuore, per esporre il torace dorsale. A livello della prima costola, individuare i gangli stellati sinistro e destro anterolaterale al musculus colli longus.Sezionare entrambi i gangli stellati con una pinza rimuovendo il tessuto circostante. Trasferirli in piastre di Petri da 3,5 centimetri contenenti PBS freddo. Usando la pinza, trasferire i gangli cervicali superiori e i gangli stellati in tubi di microcentrazione separati da 1,5 millilitri, quindi aggiungere 500 microlitri di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% a ciascun tubo e incubare in un bagno d'acqua tremante.Lasciare che i gangli si depositino sul fondo dei tubi della microcentrifuga. Trasferire il surnatante in un tubo da 15 millilitri contenente cinque millilitri di mezzo gangliare. Ai tubi della microcentrghiera, aggiungere 500 microlitri di soluzione di collagenasi di tipo 2 e incubare in un bagno d'acqua tremante.Dopo l'incubazione, risospese i gangli in soluzione di collagenasi mediante pipettaggio fino a quando i grumi di tessuto non vengono più rilevati. Trasferire la sospensione cellulare sul tubo da 15 millilitri precedentemente utilizzato contenente il terreno di coltura dei gangli con sospensione di tripsina-EDTA. Centrifugare la sospensione cellulare ed eliminare il surnatante cellulare.Risospesciare il pellet in 270 microlitri di siero bovino fetale e trasferirlo in un crioviale da 1 millilitro. Per contare le cellule, mescolare 5 microlitri della sospensione cellulare gangliare con cinque microlitri di colorante blu tripano allo 0,4%. Caricare la miscela in un emocitometro e contare il numero totale e di cellule vive al microscopio.Quindi, aggiungere 30 microlitri di dimetilsolfossido a ciascun crioviale e mescolare bene. Trasferire i criocerali in un contenitore di congelamento cellulare e posizionarlo a meno 80 gradi Celsius durante la notte. Preparare tubi da 15 millilitri con un filtro da 30 micrometri sulla parte superiore.Pre-risciacquare il colino con 1 millilitro di mezzo ganglio. Estrarre i crioviali dall'azoto liquido e scongelarli immediatamente a bagnomaria a 37 gradi Celsius fino a quando un piccolo pellet di ghiaccio viene lasciato nella crioviale. Aggiungere 1 millilitro del mezzo gangliare in ogni crioviale mentre si agita attentamente il flaconcino per recuperare le cellule gangliari.Caricare la sospensione di cellule gangliari sul filtro e risciacquare con 4-5 millilitri di mezzo gangliare. Centrifugare la sospensione a cellule tese. Rimuovere il surnatante e risospescere le cellule in 50 microlitri di tampone di lavaggio cellulare.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo microcentrifiva a bassa legatura da 0,5 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare. Una centrifuga con rotore a benna oscillante è d'ora in poi essenziale.Dopo la centrifugazione, rimuovere 45 microlitri del surnatante senza spostare il pellet cellulare. Aggiungere 45 microlitri di tampone di lisi refrigerato, delicatamente miscelati mediante pipettaggio, e incubare le cellule per 8 minuti sul ghiaccio, quindi aggiungere 50 microlitri di tampone di lavaggio a nuclei freddi a ciascun tubo. Centrifugare la sospensione dei nuclei e rimuovere 95 microlitri del surnatante senza interrompere il pellet di nuclei.Aggiungere 45 microlitri di tampone di lavaggio a nuclei refrigerati al pellet, ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante. Al nucleo pellet, aggiungere 50 microlitri di ST-SB e pipettare delicatamente fino a quando i nuclei non sono completamente risospesi, quindi aggiungere 5 microlitri di reagente bloccante FC e incubare per 10 minuti sul ghiaccio. Quindi, aggiungere 1 microlitro di anticorpo hashtag a nucleo singolo e incubare per 30 minuti sul ghiaccio.Dopo l'incubazione, aggiungere 100 microlitri di ST-SB a ciascun tubo. Centrifugare la sospensione e rimuovere 145 microlitri del surnatante senza interrompere il pellet di nuclei. Ripetere la centrifugazione e rimuovere il surnatante.Risospesciare il pellet di nuclei in 50 microlitri di ST-SB e mescolare delicatamente. Prendi 5 microlitri della sospensione dei nuclei e mescolali con 5 microlitri di 0,4% di tripano blu per contare i nuclei al microscopio. Ancora una volta, centrifugare la sospensione dei nuclei e risospescere il pellet di nuclei in ST-SB per raggiungere una concentrazione di nuclei target da 1.000 a 3.000 nuclei per microlitro.Estrarre i campioni per ottenere il numero desiderato di celle. L'analisi del controllo di qualità per la preparazione della libreria ha mostrato cDNA oligo-derivati da hashtag inferiori a 180 coppie di basi. Un ampio picco da 300 a 1.000 coppie di basi rappresentava una libreria di espressione genica di alta qualità, mentre un picco specifico di 194 coppie di basi mostrava la libreria di hashtag oligo.L'analisi del sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo ha rivelato che 12 cluster visualizzati da UMAP e gli anticorpi hashtag sono stati distribuiti tra tutti i cluster. L'etichettatura specifica da parte di hashtag oligos è stata confermata dall'espressione di Xist. Gli hashtag da 1 a 4 sono etichettati come femminili, mentre da 5 a 8 sono etichettati come campioni maschili.La qualità e la risoluzione dei dati di sequenziamento sono state verificate da trascrizioni chiave come TH, DBH e SNAP25 nei cluster 5 e 7 per i neuroni simpatici, S100B nei cluster da 0 a 3 per le cellule gliali satelliti, PECAM 1 nel cluster 4 per le cellule endoteliali e ACTA2 nel cluster 8 per le cellule stromali. Quando si tenta questo metodo, è importante ricordare la preparazione adeguata e l'attrezzatura adeguata come forbici a dissezione fine, pinzette affilate e una centrifuga con un rotore a benna oscillante sono essenziali. L'approccio graduale per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo dei gangli cardiaci estrinseci simpatici ha il potenziale per un'ampia applicazione nella caratterizzazione dei gangli che innervano altri organi e tessuti correlati in salute e malattia.

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Isolamento del nucleo a basso ingresso e multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dellRNA a nucleo singolo (Video) | JoVE Journal

Isolamento del nucleo a basso ingresso e multiplexing con anticorpi con codice a barre dei gangli simpatici del topo per il sequenziamento dell'RNA a nucleo singolo

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