Rimozione di un sito di partenza traslazionale interno dall'mRNA pur mantenendo l'espressione della proteina a lunghezza intera
16 marzo 2022
Il presente protocollo descrive una singola mutazione M213L in Gja1 che mantiene la generazione di Connexin43 a lunghezza intera ma impedisce la traduzione della più piccola isoforma GJA1-20k tradotta internamente.
La difficoltà con una sostituzione di un singolo residuo consiste nel genotipizzare gli animali in modo efficiente nonostante la differenza di singolo residuo. L'uso speciale di un enzima di restrizione aggiunge solo un singolo passaggio rapido e a basso costo alla tipica genotipizzazione basata sulla PCR. Questo protocollo può essere applicato a qualsiasi altro modello murino con un punto di mutazione se la sequenza target è riconosciuta da un enzima di restrizione, che di solito è il caso.
Tagliare da uno a tre millimetri della punta della coda con forbici pulite e trasferirlo in un tubo PCR a otto strisce da 0,2 millilitri. Dopo aver contenuto il campione di coda come descritto nel manoscritto, conservarlo a T-meno 20 gradi Celsius fino all'estrazione, fino a circa una settimana. Aggiungere 100 microlitri di soluzione di lisi tissutale per tubo e mescolare bene, seguito da spin-down utilizzando una minicentrifuga da tavolo a 2.200 volte G per 10 secondi a temperatura ambiente.
Assicurarsi che i campioni di coda siano immersi nella soluzione. Impostare i tubi su un set di termociclatori programmando i parametri per la lisi tissutale, l'inattivazione e la tenuta. Conservare il lisato tissutale a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana se la PCR non può essere eseguita immediatamente.
Preparare una soluzione PCR contenente cinque microlitri di acqua priva di nucleasi, 0,75 microlitri di primer 10 micromolari avanti e indietro e 7,5 microlitri di miscela master PCR per campione in un nuovo tubo PCR. Aggiungere un microlitro del lisato tissutale precedentemente preparato alla soluzione PCR. Mescolare bene la soluzione PCR e girare verso il basso con una minicentrifuga da tavolo a 2.200 volte G per 10 secondi a temperatura ambiente.
Impostare i tubi su un termociclatore programmato. Una volta completata la reazione, conservare i prodotti PCR a quattro gradi Celsius per uno o due mesi o circa un anno a meno 20 gradi Celsius. Preparare la soluzione enzimatica contenente sette microlitri di acqua priva di nucleasi, due microlitri di tampone CutSmart con forza 10X e un microlitro di enzima di restrizione NlaIII.
Se ci sono più campioni, moltiplicare ogni contenuto per ottenere la miscela e aliquota 10 microlitri per tubo. Aggiungere 10 microlitri di prodotto PCR precedentemente ottenuti alla soluzione enzimatica per tubo. Mescolare bene e girare verso il basso con la minicentrifuga da tavolo come dimostrato in precedenza.
Impostare i tubi su un termociclatore programmato o su un blocco termico. Conservare il prodotto dopo l'incubazione in condizioni di freddo. Aggiungere 0,75 grammi di agarosio in 50 millilitri di tampone TAE monoreduttore.
Mescolare e riscaldare l'agarosio nel microonde fino a quando non si dissolve completamente. Dopo averlo raffreddato, aggiungere cinque microlitri di macchia di DNA e mescolare delicatamente. Versare 25 millilitri di gel di agarosio nello stampo gel e lasciare che il gel si solidifichi.
Caricare 10 microlitri di prodotto PCR digerito sul pozzo. Eseguire il gel con 100 volt per 35 minuti. Immagine del gel di agarosio sotto la luce ultravioletta.
L'elettroforesi dell'agarosio eseguita utilizzando il prodotto PCR digerito ha portato a diverse bande di dimensioni diverse in ciascun genotipo, con due bande in wild type, tre in eterozigote e una in omozigote, rispettivamente. L'iniezione di prova con analisi della blastocisti ha portato a un tasso di successo del 76,9% sull'iniezione di 50 nanogrammi per microlitro degli oligo donatori e un tasso di successo del 25% sull'iniezione di 25 nanogrammi per microlitro degli stessi oligo donatori, rispettivamente. Infine, l'iniezione di 50 nanogrammi per microlitro di oligo donatori con precipitazione di etanolo ha ottenuto animali fondatori con un tasso di successo del 50%.
La purificazione degli oligo donatori mediante precipitazione di etanolo ha ridotto la tossicità pur mantenendo un'elevata efficienza di editing del genoma. Un'attenta manipolazione e l'aggiunta di una bassa quantità di reagenti è molto importante. Assicurati che siano aggiunti correttamente e siano mescolati bene.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per il genotipaggio di animali con una singola mutazione M213L nel gene Gja1 che porta alla produzione della Connexina43 a lunghezza intera, impedendo al contempo la traduzione dell'isoforma più piccola GJA1-20k. Il metodo sottolinea l'efficienza e il rapporto costo-efficacia dell'uso di enzimi di restrizione abbinati al genotipaggio basato su PCR.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Ricerca
- Genetica
- Biologia Molecolare
- Modelli Animali
Sfondo
- Importanza dell'identificazione delle mutazioni genetiche
- Sfide legate alle sostituzioni di un singolo residuo
- Applicazione degli enzimi di restrizione nel genotipaggio
Metodi Utilizzati
- Genotipizzazione basata sulla PCR
- Modelli murini con mutazioni puntiformi
- Elettroforesi su gel di agarosio per l'analisi del DNA
Risultati principali
- Identificazione con successo di genotipi con profili di bande distinti
- Alti tassi di successo nella generazione di animali fondatori
- Efficacia convalidata dei metodi descritti per l'analisi genetica
Conclusioni
- Lo studio dimostra un protocollo efficiente per il genotipaggio di mutazioni in modelli murini.
- Offre metodologie preziose per la ricerca genetica in biologia dello sviluppo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente un genotipaggio preciso di mutazioni puntiformi in modelli murini, supportando studi di validazione del bersaglio in cui deve essere analizzata l'espressione proteica isoforma-specifica. Eliminando isoforme troncate che potrebbero interferire, pur preservando la funzionalità della proteina a lunghezza intera, migliora la riduzione del rischio meccanicistica nella fase iniziale di scoperta. L'approccio aumenta la fiducia predittiva per ipotesi terapeutiche che coinvolgono la biologia della Connexina 43 e i percorsi correlati dei giunzioni a comunicazione.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi di ipotesi terapeutiche isolando il contributo funzionale della forma completa di Cx43 rispetto agli isoformi troncati a livello del dominio N-terminale.
- Valore operativo: Fornisce un metodo di genotipizzazione scalabile per distinguere gli alleli selvatici, eterozigoti e mutanti omozigoti in coorti di grandi dimensioni.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio progettuale chiarificando se i fenotipi osservati derivino dalla perdita della proteina a lunghezza intera o da meccanismi specifici degli isoformi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Prontezza del saggio: Genera campioni di DNA con profili di frammenti di restrizione adatti a flussi di lavoro di screening ad alto rendimento.
- Output quantitativo: Consente la quantificazione allele-specifica mediante analisi del polimorfismo della lunghezza dei frammenti di restrizione associato alla PCR.
- Riproducibilità: Standardizza il genotipaggio tra laboratori mediante l'aggiunta di un enzima a basso costo ai protocolli PCR esistenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Rilevanza per la malattia: Facilita modelli preclinici in cui il traffico di Cx43 e l'assemblaggio dei giunzioni comunicanti sono implicati in disturbi cardiaci, neurologici o oncologici.
- Continuità traslazionale Collega il genotipo molecolare all'esito fenotipico mantenendo l'espressione completa di Cx43 riducendo al contempo GJA1-20k.
- Decisioni aggiustate per il rischio: Fornisce criteri di accettazione (go/no-go) consentendo la correlazione tra i livelli di espressione delle isoforme e i risultati funzionali in vivo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione iniziale della proteina bersaglio al test di efficacia preclinica, in particolare quando è necessario risolvere le funzioni proteiche specifiche per isoforma.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi consentendo modelli genetici in grado di discriminare tra l'attività della proteina completa e quella di isoforme troncate.
- Screening: Fornisce DNA genomico pronto per saggi per applicazioni successive come la validazione di CRISPR o la gestione di colonie di riproduzione.
- Analisi: Fornisce profili di bande chiari e facilmente interpretabili su gel di agarosio, che permettono un'assegnazione rapida del genotipo senza sequenziamento.
- Ricerca traslazionale: Consente studi preclinici in cui la localizzazione della Cx43 sulla membrana e la comunicazione intercellulare rappresentano punti finali meccanicistici chiave.
- Riutilizzo aziendale: Adattabile a qualsiasi mutazione puntuale in cui un sito di restrizione possa essere introdotto o interrotto, offrendo una piattaforma di genotipizzazione riutilizzabile.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio isolando i contributi specifici degli isoformi.
- Valore operativo: Aumenta la produttività e riduce il costo per campione grazie a un unico passaggio di digestione con enzimi di restrizione successivo alla PCR.
- Valore strategico: Migliora la sicurezza decisionale nell'ottimizzazione dei composti di partenza chiarificando le relazioni genotipo-fenotipo.
- Impatto sul portafoglio: Consente l'avanzamento mirato dei candidati che bersagliano vie dipendenti da Cx43, adeguato al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di biologia molecolare nella progettazione di primer per PCR e nella selezione di enzimi di restrizione.
- Richiede l'accesso a termociclatori, sistemi per elettroforesi su gel di agarosio e apparecchiature per imaging UV.
- Necessita della standardizzazione delle condizioni di lisi dei tessuti e di PCR tra diversi utilizzatori per ottenere risultati costanti.
- L'adattamento a sistemi modello alternativi dipende dal contesto della sequenza e dalla compatibilità con gli enzimi di restrizione.
- Limitato alle mutazioni che alterano o creano un sito di riconoscimento per enzimi di restrizione; le mutazioni silenti potrebbero richiedere strategie alternative.
Domande frequenti sulla biofarmaceutica
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:42
DNA Extraction
1:45
DNA Amplification by PCR
2:42
Incubation with Restriction Enzyme
3:34
Preparation of 1.5% Agarose Gel for Electrophoresis and DNA Band Detection
4:22
Results: Genotype Analysis and Recombination Efficiency
5:21
Conclusion
