Name: Quaglia Membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 43 s
Description: Scopri la preparazione della membrana corioallantoica di quaglia giapponese per diagnosi e terapia fotodinamica del cancro e infezioni microbiche. Questo metodo rispetta i principi 3R e offre rapidi risultati in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il lavoro è stato sostenuto da VEGA 2/0042/21 e APVV 20-0129. Il contributo di V. Huntošová è il risultato dell'implementazione del progetto: Open scientific community for modern interdisciplinary research in medicine (Acronimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 supportato dal Programma Operativo Integrato Infrastruttura, finanziato dal FESR.

La ricerca è stata condotta nel rispetto delle linee guida istituzionali. Tutte le apparecchiature e i reagenti devono essere sterilizzati in autoclave o sterilizzati con etanolo al 70% o luce UV.
1. Incubazione delle uova
<ol><li>Conservare le uova di quaglia fecondate a 10-15 °C per un massimo di 4-5 giorni prima di iniziare l'incubazione. Utilizzare solo uova pulite e non danneggiate.</li>
	<li>Incubare le uova in un'incubatrice a tiraggio forzato per ~ 53-54 h. Deporre le uova orizzontalmente con la rotazione delle uova disattivata, al 50%-60% di umidità e alla temperatura di incubazione di 37,5 °C.</li>
</ol>2. Preparazione della coltura ex ovo
NOTA: Dopo l'incubazione iniziale, le uova sono adatte per iniziare la coltivazione ex ovo .
<ol><li>Disinfettare la superficie dell'uovo con etanolo al 70%, senza ruotare l'uovo.</li>
	<li>In un armadio a flusso laminare sterile, aprire il guscio d'uovo usando piccole forbici chirurgiche sterili e trasferire il contenuto in una piastra di coltura a 6 pozzetti. Se fatto correttamente, l'embrione giacerà sopra un tuorlo non danneggiato. Dopo ogni uovo, disinfettare le forbici con etanolo al 70%.</li>
	<li>Aggiungere circa 5 ml di acqua sterile agli spazi vuoti nella piastra a 6 pozzetti, poiché l'umidità è essenziale per evitare che il CAM si secchi.</li>
	<li>Mettere gli embrioni in un'incubatrice fino a ulteriori esperimenti, mantenendo una temperatura di 37 ° C e 80% -90% di umidità.</li>
	<li>Quando il CAM è completamente sviluppato (da ED7), posizionare un anello di silicone sterilizzato (6 mm di diametro e circa 1,5 mm di spessore) sulla superficie CAM, lungo i piccoli capillari. Evitare i principali vasi sanguigni quando si posiziona l'anello. NOTA: L'anello definisce lo spazio di lavoro, aiuta a contrassegnare il luogo di applicazione della sostanza e impedisce la fuoriuscita del contenuto liquido.</li>
	<li>Terminare la coltivazione degli embrioni secondo la legislazione del paese.</li>
	<li>È importante sottolineare che indossare guanti o tenere le mani disinfettate con etanolo al 70% durante il lavoro. Aspirare embrioni inclinati in modo improprio o uova non fecondate con un aspiratore a vuoto.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig01.jpg"> Figura 1: Preparazione della coltura ex ovo . A) uova di quaglia giapponesi immagazzinate e incubate. (B) Disinfezione della superficie delle uova con etanolo. (C) Il guscio d'uovo viene tagliato con le forbici. (D) Il contenuto dell'uovo viene svuotato nel pozzetto. (E) Embrione di 3 giorni di 3 giorni adeguatamente preparato, con vascolarizzazione CAM in via di sviluppo. (F) Piastre di coltura conservate in un'incubatrice. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig02.jpg"> Figura 2: Piastra di coltura a 6 pozzetti con embrioni e anelli di silicone posizionati sulla parte superiore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
3. Inoculazione di cellule tumorali
NOTA: Tutte le procedure richiedono l'uso di un armadio a flusso laminare sterile.
<ol><li>Coltura di diversi tipi di cellule aderenti in palloni secondo i rispettivi protocolli di coltura.<ol><li>Rimuovere il vecchio mezzo dai palloni e sciacquare lo strato cellulare con soluzione salina tamponata con fosfato sterile (PBS) per rimuovere le tracce del mezzo.</li>
		<li>Dopo la tripsinizzazione, inibire la tripsina aggiungendo il terreno di coltura e raccogliere le cellule in provette da centrifuga. Centrifugare le cellule e risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura fresco. Contare le cellule e risospenderle in un terreno di coltura cellulare alla concentrazione desiderata. NOTA: È anche possibile produrre colture cellulari 3D, cioè sferoidi utilizzando, ad esempio, il metodo della goccia sospesa21.</li>
	</ol></li>
	<li>Impiantare 1 x 10 5-1 x 106 cellule tumorali o5-15 sferoidi (per CAM) in 30 μL di soluzione di mezzo cellulare nell'anello di silicone sulla parte superiore del CAM. NOTA: Il volume dipende dalle dimensioni dell'anello in silicone utilizzato. Se si utilizza un anello in silicone con un diametro maggiore, è necessario un volume maggiore per coprire l'intera area. A seconda del tipo di cellula, o per diversi tipi di esperimenti, possono essere utilizzate varie concentrazioni cellulari. A volte, la raschiatura fine della CAM viene utilizzata per migliorare l'adesione delle cellule incorporate.</li>
	<li>Riportare le CAM con cellule inoculate nell'incubatore (37 °C e 80%-90% di umidità).</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig03.jpg"> Figura 3: Inoculazione di CAM con tumori. (A) Aspirazione di sferoidi con una pipetta e (B) impianto sulla superficie CAM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
4. Applicazione di fotosensibilizzatore
<ol><li>Applicazione di ipericina<ol><li>Sotto luci soffuse, preparare una soluzione madre di 2 mM di ipericina sciogliendola in 100% dimetil solfossido (DMSO). Preparare una soluzione di lavoro 79 μM di ipericina poco prima dell'esperimento con PBS sterile o soluzione salina. Assicurarsi che la concentrazione finale di DMSO in tutte le soluzioni sia sempre inferiore allo 0,2%, il che non influisce sullo sviluppo dell'embrione.</li>
		<li>In condizioni sterili, applicare un volume appropriato di soluzione di ipericina all'anello di silicone. Un volume di 30 μL è sufficiente per riempire un anello con un diametro di 6 mm.</li>
		<li>Conservare gli embrioni in un'incubatrice a 37 °C e 80%-90% di umidità. L'ipericina in una soluzione acquosa è fotoattiva dopo la sua monomerizzazione nel tessuto, circa 3 ore dopo la sua applicazione sulla CAM.</li>
	</ol></li>
	<li>Applicazione di ipericina con LDL, HDL o nanoparticelle come sistemi di trasporto NOTA: Questi sistemi di trasporto sono utilizzati per migliorare la penetrazione dell'ipericina nelle cellule e nelle strutture cellulari.<ol><li>A causa della fotosensibilità, eseguire tutti i passaggi, compresa la preparazione delle soluzioni, in condizioni di scarsa illuminazione e conservare le soluzioni al buio.</li>
		<li>Preparare le formulazioni di ipericina-LDL e ipericina-HDL miscelando volumi appropriati di lipoproteine e soluzioni madre di ipericina in PBS secondo il riferimento15. La concentrazione di LDL o HDL in ipericina è 20:115.</li>
		<li>Sintetizzare nanoparticelle polimeriche mediante polimerizzazione cationica vivente ad apertura di anello secondo i riferimenti12,13. Regolare la concentrazione di ipericina nelle nanoparticelle polimeriche con PBS a 10 μM12,13.</li>
	</ol></li>
</ol>5. PDD e PDT
<ol><li>Condotta PDD<ol><li>In condizioni sterili, applicare fotosensibilizzatore (ipericina, nanoparticelle polimeriche caricate con ipericina o ipericina con vettore lipoproteico) sulla superficie CAM, con o senza cellule tumorali (ED 7-9).</li>
		<li>Illuminare la CAM utilizzando la luce di eccitazione viola (luce LED circolare personalizzata di lunghezza d'onda di 405 nm) e registrare la fluorescenza dell'ipericina nel tessuto CAM e nelle cellule tumorali con una fotocamera digitale a intervalli di tempo di 0, 1, 3, 5, 24 e 48 ore dopo la somministrazione di ipericina.</li>
		<li>Se la ricerca richiede un'immagine della CAM in luce bianca, registrare la CAM prima della somministrazione di ipericina e alla fine dell'esperimento, poco prima della fissazione tissutale, poiché la luce influenza la fotoattivazione dell'ipericina.</li>
		<li>Valutare l'intensità della fluorescenza utilizzando un programma di elaborazione e analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ22).<ol><li>Suddividete i canali immagine RGB in immagini rosse, verdi e blu separate. Analizza l'immagine di intensità rossa in forma a 8 bit. Valutare l'intensità del rosso dall'area all'interno dell'anello e approssimarla come fluorescenza dell'ipericina. Ottenere grafici di profili immagine interi (utilizzando il plugin Profile Plot di ImageJ) a diversi intervalli di tempo dopo la somministrazione di ipericina (cioè da 0 h, subito dopo la somministrazione, fino a 48 h).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Condotta PDT<ol><li>Eseguire la PDT almeno 3 ore dopo l'applicazione dell'ipericina.</li>
		<li>Posizionare la fibra ottica sopra la superficie del CAM affinché il raggio laser copra l'intera area all'interno dell'anello in silicone.</li>
		<li>Eseguire l'irradiazione in vivo (1-2 min) con una luce laser a 405 nm ad una velocità di fluenza di 285 mW/cm2.</li>
		<li>Registrare CAM utilizzando luce bianca e luce fluorescente a 405 nm prima e dopo il trattamento fotodinamico (24 h e 48 h).</li>
		<li>Rileva i danni fotografici 24 ore e 48 ore dopo PDT dalle immagini scattate in luce bianca. Valutare il danno vascolare con un punteggio semiquantitativo16: 1 - nessuna distruzione; 2 - chiusura parziale dei capillari (diametro ≤10 μm) senza distruzione di vasi medi o più grandi (diametro ≥50 μm) e più piccoli (diametro 10-50 μm); 3 - chiusura parziale dei vasi più piccoli con la scomparsa dei capillari; 4 - chiusura parziale di vasi più grandi con vasi più piccoli e capillari che scompaiono; e 5 - trombosi fotografica totale con la maggior parte dei vasi che svaniscono.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig04.jpg"> Figura 4: Trattamento della CAM con luce laser. Questa foto è stata scattata a scopo illustrativo. Per PDD o PDT, la stanza deve essere buia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>
6. Preparazione della CAM per un'ulteriore valutazione
<ol><li>Incorporazione di paraffina<ol><li>Fissare il tessuto CAM in una piastra di coltivazione con paraformaldeide (PFA) al 4% in PBS per un minimo di 2 ore e un massimo di notte.</li>
		<li>Rimuovere il PFA e ritagliare con cura dal CAM una parte del tessuto all'interno dell'anello di silicone.</li>
		<li>Disidratare immediatamente il tessuto CAM in serie alcolica ascendente come segue. Posizionare il tessuto CAM in etanolo al 70% per 3 minuti, soluzione di eosina per 2 minuti (per una più facile localizzazione del tessuto nel blocco di paraffina), etanolo al 96% per 3 x 5 minuti (sempre in una nuova capsula di Petri) e etanolo al 100% per 5 minuti e xilene per 2 x 10 minuti.</li>
		<li>Utilizzando una spatola o una spazzola sottile, trasferire i campioni il più rapidamente possibile nella paraffina disciolta in piastre di Petri (59 °C). Dopo 24 ore, posizionare il tessuto in uno stampo istologico, riempirlo con mezzo di incorporamento della paraffina e lasciarlo solidificare in frigorifero. Tagliare il CAM solidificato dal mezzo di incorporamento, girarlo nel vassoio di 90°, riempirlo nuovamente con il mezzo di incorporamento e lasciarlo solidificare.</li>
		<li>Preparare sezioni da 5-10 μm su un microtomo per l'analisi istopatologica per determinare il danno indotto da PDT.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione di sezioni CAM congelate per istologia NOTA: Per alcune metodologie, tra cui l'istologia, le sezioni congelate preparate su microtomo criostato sono più adatte. Seguire i passaggi seguenti per preparare le sezioni CAM congelate.<ol><li>Montare con cura CAM nativo o fissato con paraformaldeide al 4% sul vetrino.</li>
		<li>Riempire lo stampo incorporato a metà con un composto a temperatura di taglio ottimale (OCT) e congelare in azoto liquido o una miscela di ghiaccio secco ed etanolo.</li>
		<li>Dopo il congelamento, inclinare e far scorrere con attenzione il CAM dal vetrino sulla parte superiore del mezzo OCT congelato. Introdurre nuovamente nello stampo, coprire con il mezzo OCT e congelare come al punto 6.2.2.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi frattale della CAM di quaglia NOTA: Le variazioni vascolari causate dalla PDT possono essere valutate calcolando il coefficiente di dimensione frattale19.<ol><li>Nell'armadio a flusso laminare, trabocco CAM in una piastra di coltivazione con una soluzione di fissazione preriscaldata (37 °C) di paraformaldeide al 4% e glutaraldeide al 2% in PBS.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di fissazione dopo 48 ore. Separare accuratamente la CAM dall'embrione con micro-forbici e una spazzola fine e lavarla in PBS.</li>
		<li>Montare il CAM lavato su un vetrino e lasciarlo asciugare lentamente.</li>
		<li>Fotografa la diapositiva utilizzando una fotocamera digitale e un transilluminatore come fonte di luce bianca omogenea.</li>
		<li>Elaborazione di immagini digitali mediante il software ImageJ22. Per l'analisi, selezionare una regione quadrata (512 × 512 pixel) dall'area con rami arteriosi distali. Binarizzare e scheletrizzare le immagini e calcolare il coefficiente di dimensione frattale (Df) seguendo le procedure descritte nel riferimento31.</li>
	</ol></li>
	<li>Analisi molecolare del tessuto CAM<ol><li>Per l'analisi molecolare, separare accuratamente il CAM nativo, congelare in azoto liquido e conservare a -80 °C.</li>
		<li>Determinare l'espressione genica secondo i protocolli standard per l'isolamento dell'RNA23, la trascrizione inversa in cDNA e la PCR quantitativa24.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63422/63422fig05.jpg"> Figura 5: Tessuto CAM per l'analisi frattale. Dopo PDT, CAM viene fissato, montato su un vetrino e asciugato per l'analisi frattale. La foto è stata scattata in luce bianca utilizzando un transilluminatore. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63422/63422fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<ol><li>Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Grifﬁoen, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+regrowth+following+photodynamic+therapy+in+the+chicken+embryo+chorioallantoic+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane.</a> Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).</li>
<li>van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+photodynamic+effects+of+phthalocyanines+in+a+skin-fold+observation+chamber+model%3A+role+of+central+metal+ion+and+degree+of+sulfonation%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+Photobiology%22%5BJournal%5D)">In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation.</a> Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).</li>
<li>Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stages+of+the+Japanese+quail%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Developmental stages of the Japanese quail.</a> Journal of Anatomy. 216 (1), 3(2010).</li>
<li>De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+microcirculation+in+the+chick+chorioallantoic+membrane+during+normal+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis.</a> Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).</li>
<li>Sandau, K., Kurz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+vascular+growth+processes%3A+a+stochastic+biophysical+approach+to+embryonic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis.</a> Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).</li>
<li>Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferation+pattern+of+capillary+endothelial+cells+in+chorioallantoic+membrane+development+indicates+local+growth+control%2C+which+is+counteracted+by+vascular+endothelial+growth+factor+application%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application.</a> Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).</li>
<li>Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Japanese+quail+%28Coturnix+japonica%29+as+laboratory+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model.</a> Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).</li>
<li>Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+as+an+in-vivo+model+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%2C+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).</li>
<li>Miškovský, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypericin+-+a+new+antiviral+and+antitumor+photosensitizer%3A+mechanism+of+action+and+interaction+with+biological+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Hypericin - a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules.</a> Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).</li>
<li>Čavarga, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+effect+of+hypericin+after+topical+application+in+the+ex+ovo+quail+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Planta+Medica%22%5BJournal%5D)">Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model.</a> Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).</li>
<li>Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypericin+in+the+dark+inhibits+key+steps+of+angiogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Europan+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro.</a> Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).</li>
<li>Datta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+excellent+chemical+stability+and+bioavailability+of+solvent+responsive+curcumin-loaded+2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-%284-dodecyloxyphenyl%29-+2-oxazoline+copolymer+nanoparticles+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery.</a> Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).</li>
<li>Huntošová, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alkyl+Chain+length+in+poly%282-oxazoline%29-based+amphiphilic+gradient+copolymers+regulates+the+delivery+of+hydrophobic+molecules%3A+a+case+of+the+biodistribution+and+the+photodynamic+activity+of+the+photosensitizer+hypericin%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin.</a> Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).</li>
<li>Buríková, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypericin+fluorescence+kinetics+in+the+presence+of+low+density+lipoproteins%3A+study+on+quail+CAM+assay+for+topical+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22General+Physiology+and+Biophysic%22%5BJournal%5D)">Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery.</a> General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).</li>
<li>Lenkavska, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benefits+of+hypericin+transport+and+delivery+by+low-+and+high-density+lipoproteins+to+cancer+cells%3A+From+in+vitro+to+ex+ovo%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).</li>
<li>Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDT+with+TOOKAD+studied+in+the+chorioallantoic+membrane+of+fertilized+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).</li>
<li>Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+damage+to+chorioallantoic+membrane+blood+vessels+by+porphycene-induced+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology%2C+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).</li>
<li>Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+vascular+effect+of+Photodynamic+Therapy+in+chorioallantoic+membrane+using+different+photosensitizers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Photochemistry+and+Photobiology+B%3A+Biology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers.</a> Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).</li>
<li>Dougherty, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Photodynamic therapy.</a> Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).</li>
<li>Xiang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+optoacoustic+monitoring+of+vascular+damage+during+photodynamic+therapy+treatment+of+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Optics%22%5BJournal%5D)">Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor.</a> Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).</li>
<li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), 2720(2011).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).</li>
<li>Chomczynski, P., Sacchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-step+method+of+RNA+isolation+by+acid+guanidium+thiocyanate-phenol-chloroform+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.</a> Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).</li>
<li>Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+angiogenesis+by+topical+application+of+leptin+and+high+and+low+molecular+heparin+using+the+Japanese+quail+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Saudi+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model.</a> Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).</li>
<li>Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Ex+Ovo+chick+chorioallantoic+membrane+%28CAM%29+assay+to+evaluate+the+biocompatibility+and+angiogenic+response+to+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomaterials+Science+Engineering%22%5BJournal%5D)">Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials.</a> ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).</li>
<li>Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolving+applications+of+the+egg%3A+chorioallantoic+membrane+assay+and+ex+vivo+organotypic+culture+of+materials+for+bone+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).</li>
<li>Merlos Rodrigo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+applicability+of+in+ovo+and+ex+ovo+chicken+chorioallantoic+membrane+assays+to+study+cytostatic+activity+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells.</a> Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).</li>
<li>Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+silicone+ring+application+on+CAM+vasculature+in+Japanese+Quail+%28Coturnix+japonica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Student+Scientific+Conference+Faculty+of+Natural+Sciences+of+Comenius+University%2C+Bratislava%2C+Slovakia%22%5BJournal%5D)">The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica).</a> Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).</li>
<li>Kohli, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-screening+the+intrinsic+angiogenic+capacity+of+biomaterials+in+an+optimised+ex+ovo+chorioallantoic+membrane+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model.</a> Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).</li>
<li>Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chorioallantoic+membrane+models+of+various+avian+species+differences+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biology-Basel%22%5BJournal%5D)">Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications.</a> Biology-Basel. 10 (4), 301(2021).</li>
<li>Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor-2+selectively+stimulates+angiogenesis+of+small+vessels+in+arterial+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).</li>
<li>Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+analysis+of+a+tumor+model+in+the+chorioallantoic+membrane+used+for+the+evaluation+of+different+photosensitizers+for+photodynamic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Photodiagnosis+and+Photodynamic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy.</a> Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Per una coltivazione ex ovo di successo, è importante seguire il protocollo di cui sopra. Inoltre, se le uova non vengono aperte con sufficiente attenzione o c'è umidità insufficiente durante la coltivazione, il sacco del tuorlo si attacca al guscio e spesso si rompe. L'inizio di una coltivazione ex ovo al momento di circa 60 ore di incubazione dell'uovo garantisce l'alto tasso di sopravvivenza degli embrioni, poiché sono già abbastanza grandi da sopravvivere alla manipolazione. Nelle fasi successive de...

Il modello della membrana corioallantoica (CAM) del pollo è ben noto e ampiamente utilizzato in varie aree di ricerca. È un organo extraembrionale riccamente vascolarizzato che fornisce lo scambio di gas e il trasporto di minerali1. Grazie alla trasparenza e all'accessibilità di questa membrana, i singoli vasi sanguigni e i loro cambiamenti strutturali possono essere osservati in tempo reale2. Nonostante i vantaggi, il pulcino CAM ha anche alcune limitazioni (ad esempio, strutture di allevamento più grandi, produzione di uova e consumo di mangime) che potrebbero essere evitate utilizzando altre specie aviarie. In questo protocollo, viene descritto un modello alternativo di CAM ex ovo utilizzando embrioni di quaglia giapponese (Coturnix japonica). A causa delle sue piccole dimensioni, consente l'uso di un numero molto maggiore di individui sperimentali rispetto al pollo CAM. Inoltre, lo sviluppo embrionale più breve di 16 giorni degli embrioni di quaglia è un altro vantaggio. I primi vasi più grandi su quaglia CAM compaiono il giorno embrionale (ED) 7. Questo può essere direttamente confrontato con lo sviluppo dell'embrione di pulcino (fasi 4-35); Tuttavia, le fasi successive dello sviluppo non sono più comparabili e richiedono meno tempo per l'embrione di quaglia3. Di interesse è la regolare comparsa di ramificazioni microvascolari simili a quelle delle CAM di pollo 4,5,6. La rapida maturazione sessuale, l'alta produzione di uova e l'allevamento a basso costo sono altri esempi che favoriscono l'uso di questo modello sperimentale7.
Un modello CAM aviario è spesso utilizzato negli studi di terapia fotodinamica (PDT)8. PDT è usato per trattare diverse forme di cancro (piccoli tumori localizzati) e altre malattie non oncologiche. Il suo principio è nella consegna di un farmaco fluorescente, un fotosensibilizzatore (PS), al tessuto danneggiato e la sua attivazione con la luce della lunghezza d'onda appropriata. Una PS prospettica utilizzata nella ricerca è l'ipericina, originariamente isolata dalla pianta medicinale erba di San Giovanni (Hypericum perforatum)9. I forti effetti fotosensibilizzanti di questo composto si basano sulle sue proprietà fotochimiche e fotofisiche. Questi sono caratterizzati da picchi di eccitazione di fluorescenza multipli nell'intervallo 400-600 nm, che inducono l'emissione di fluorescenza a circa 600 nm. I massimi di assorbimento dell'ipericina all'interno della banda spettrale sono nell'intervallo 540-590 nm e i massimi di fluorescenza sono nell'intervallo 590-640 nm9. Per ottenere questi effetti fotosensibilizzanti, l'ipericina viene eccitata dalla luce laser ad una lunghezza d'onda di 405 nm dopo somministrazione locale10. In presenza di luce, l'ipericina può mostrare effetti virucidi, antiproliferativi e citotossici11, mentre non vi è tossicità sistemica e viene rapidamente rilasciata dall'organismo. L'ipericina è una sostanza lipofila che forma aggregati non fluorescenti insolubili in acqua, motivo per cui diversi tipi di nanocarrier, come le nanoparticelle polimeriche 12,13 o le lipoproteine ad alta e bassa densità (HDL, LDL)14,15, vengono utilizzati per aiutare la sua consegna e penetrazione nelle cellule. Poiché la CAM è un sistema naturalmente immunodeficiente, le cellule tumorali possono essere impiantate direttamente sulla superficie della membrana. Il modello è anche adatto per registrare l'entità del danno vascolare indotto da PDT secondo un punteggio definito16,17. La luce di intensità inferiore rispetto alla PDT può essere utilizzata per la diagnosi fotodinamica (PDD). Il monitoraggio del tessuto sotto eccitazione viola La luce LED porta anche alla fotoattivazione dei fotosensibilizzatori18,19,20 che si traduce in un'emissione di luce fluorescente, ma non fornisce energia sufficiente per avviare una reazione PDT e danneggiare le cellule. Lo rende un buon strumento per la visualizzazione e la diagnosi del tumore o il monitoraggio della farmacocinetica dei PSs14,15 usati.
Questo articolo descrive la preparazione del test CAM di quaglia ex ovo con tassi di sopravvivenza superiori all'80%. Questa coltura ex ovo è stata applicata con successo in un gran numero di esperimenti.

<table><tbody><tr><td>Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti</td><td>Sarstedt</td><td>83.392</td><td>Polistirene trasparente, sterile</td></tr><tr><td>CO2 Incubatore ESCO CCL-0508</td><td>ESCO, Singapore</td><td>CCL-050B-8</td><td>CO2 incubatore per colture cellulari</td></tr><tr><td>cryocut Leica CM 1800</td><td>Reichert-Jung, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fotocamera digitale Canon EOS 6D II</td><td>Canon, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laser a diodi 405 nm</td><td>Ocean Optics, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-68-5</td><td>dimetilsolfossido</td></tr><tr><td>eosina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15086-94-9</td><td></td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>pennello fine misura 2</td><td>Faber-Castell</td><td>281802</td><td>pennello per la separazione e la manipolazione CAM</td></tr><tr><td>glutaraldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>111-30-8</td><td></td></tr><tr><td>ematossilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>517-28-2</td><td></td></tr><tr><td>ipericina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84082-80-4</td><td></td></tr><tr><td>incubatore Bios Midi</td><td>Bios Sedl<img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/63422/63422eq01.jpg" style="margine: auto; ">any, Repubblica</td><td></td> Ceca <td>Incubatore a tiraggio forzato per incubatore a incubazione iniziale</td></tr><tr><td>Memmert IF160</td><td>Memmert, Germania</td><td></td><td>Incubatore a circolazione d'aria forzata per incubazione CAM</td></tr><tr><td>Kaiser slimlite plano, scatola luminosa a LED</td><td>Kaiser, Germania</td><td>2453</td><td>Transilluminatore</td></tr><tr><td>Luce LED 405 nm</td><td></td><td></td><td>luce circolare su misura</td></tr><tr><td>lente macro Canon MP- E 65 mm f/ 2.8</td><td>Canon, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscopio Kapa 2000</td><td>Kvant, Slovacchia</td><td></td><td>microscopio ottico</td></tr><tr><td>microtomo Auxilab 508</td><td>Auxilab, Spagna</td><td></td><td>manuale rotativo microtomo</td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Plus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3683</td><td>terreno parafina per l'inclusione di tessuti</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td>Forbici tampone salino fosfato</td></tr><tr><td>Castroviejo</td><td>Orimed</td><td>  OR66-108</td><td>micro forbici per software di separazione CAM</td></tr><tr><td>ImageJ 1.53</td><td>programma di elaborazione e analisi delle immagini</td><td>di pubblico dominio</td><td></td></tr><tr><td>soluzione stock HDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437641-10MG</td><td>lipoproteine ad alta densità</td></tr><tr><td>soluzione stock LDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>437644-10MG</td><td>lipoproteine a bassa densità</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Temperatura di taglio ottimale Composto Flaconi da 118 ml</td></tr></tbody></table>

quaglia membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia

Quail Chorioallantoic Membrane - A Tool for Photodynamic Diagnosis and Therapy

La membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario è una sottile membrana extraembrionale che funziona come organo respiratorio primario. Le sue proprietà lo rendono un eccellente modello sperimentale in vivo per studiare l'angiogenesi, la crescita tumorale, i sistemi di somministrazione di farmaci o la diagnosi fotodinamica (PDD) e la terapia fotodinamica (PDT). Allo stesso tempo, questo modello affronta il requisito della sostituzione degli animali da esperimento con un'alternativa adeguata. L'embrione coltivato ex ovo consente una facile applicazione, accesso, monitoraggio e documentazione della sostanza. Il più frequentemente usato è pulcino CAM; tuttavia, questo articolo descrive i vantaggi del CAM di quaglia giapponese come modello a basso costo e ad alta produttività. Un altro vantaggio è lo sviluppo embrionale più breve, che consente un maggiore turnover sperimentale. L'idoneità della CAM di quaglia per PDD e PDT del cancro e delle infezioni microbiche è esplorata qui. Ad esempio, viene descritto l'uso del fotosensibilizzatore ipericina in combinazione con lipoproteine o nanoparticelle come sistema di consegna. È stato determinato il punteggio di danno dalle immagini in luce bianca e le variazioni dell'intensità di fluorescenza del tessuto CAM sotto luce violetta (405 nm), insieme all'analisi delle sezioni istologiche. La CAM di quaglia ha mostrato chiaramente l'effetto della PDT sulla vascolarizzazione e sul tessuto. Inoltre, si potrebbero osservare cambiamenti come emorragia capillare, trombosi, lisi di piccoli vasi e sanguinamento di vasi più grandi. La CAM di quaglia giapponese è un promettente modello in vivo per la diagnosi fotodinamica e la ricerca terapeutica, con applicazioni negli studi sull'angiogenesi tumorale e sulla terapia antivascolare e antimicrobica.

La localizzazione del tumore sulla superficie CAM è difficile in luce bianca. Il fotosensibilizzatore (qui, l'ipericina) utilizzato nella PDD dovrebbe essere assorbito selettivamente dal tumore e aiuta a visualizzare il tumore. L'aggiunta di ipericina e l'uso di luce fluorescente (ad esempio, 405 nm) hanno mostrato molto bene la posizione del tumore (carcinoma a cellule squamose TE1) (Figura 6A). L'analisi istologica ha mostrato cellule tumorali vitali che invadono i tessuti sani. Strutture ...

La membrana corioallantoica (CAM) dell'embrione aviario è uno strumento molto utile e applicabile per varie aree di ricerca. Uno speciale modello ex ovo di quaglia giapponese CAM è adatto per l'indagine del trattamento fotodinamico.

Quaglia Membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia

The chorioallantoic membrane (CAM) of an avian embryo is a thin, extraembryonic membrane that functions as a primary respiratory organ. Its properties ...

Vi mostreremo come preparare la cultura giapponese di quaglie ex ovo e come utilizzare la membrana corioallantoica o CAM in breve per la diagnosi fotodinamica e la terapia del cancro o delle infezioni microbiche. I vantaggi di questo metodo sono una rapida crescita dello sviluppo, piccole dimensioni, un buon accesso al tessuto e una facile manipolazione. Inoltre, rispetta i principi della regola delle 3R per condurre ricerche sugli animali.Grazie alla sua somiglianza strutturale con le mucose come la vescica, i polmoni o la placenta, è adatto per test in vivo di potenziali farmaci, test di tossicità o studi di trapianto. A dimostrare la procedura saranno Barbora Kundekova e Majlinda Meta, dottorandi del mio laboratorio. Per iniziare, utilizzare uova di quaglia fecondate, fresche o conservate a 10-15 gradi Celsius per un massimo di 4-5 giorni prima dell'inizio dell'incubazione.Utilizzare solo uova pulite e non danneggiate, quindi incubare le uova in un'incubatrice a tiraggio forzato al 50-60% di umidità e 37,5 gradi Celsius per circa 54 ore posizionate orizzontalmente con le rotazioni delle uova disattivate. Disinfettare la superficie dell'uovo con etanolo al 70% senza ruotare l'uovo. Successivamente, in un armadio a flusso laminare sterile mentre si indossano i guanti, aprire il guscio d'uovo usando piccole forbici chirurgiche sterili e trasferire il contenuto in una piastra di coltura a 6 pozzetti.Dopo ogni uovo, disinfettare le forbici con etanolo al 70%. Aggiungere circa 5 millilitri di acqua sterile agli spazi vuoti nella piastra a 6 pozzetti poiché l'umidità è essenziale per evitare che il CAM si secchi. Successivamente, aspirare embrioni con punta impropria o uova non fecondate con un aspiratore a vuoto, quindi posizionare gli embrioni in un'incubatrice fino a ulteriori esperimenti mantenendo una temperatura di 37 gradi Celsius nell'80-90% di umidità.Quando la CAM è abbastanza sviluppata, di solito dal giorno 7 embrionale, posizionare un anello di silicone sterilizzato sulla superficie CAM lungo i piccoli capillari evitando i principali vasi sanguigni. In condizioni sterili, applicare un volume appropriato di soluzione di ipericina 30 microlitri all'anello di silicone e mantenere gli embrioni in un'incubatrice a 37 gradi Celsius con un'umidità compresa tra l'80 e il 90%. Per condurre la diagnosi fotodinamica, illuminare la CAM utilizzando la luce di eccitazione viola e registrare la fluorescenza dell'ipericina e del tessuto CAM e delle cellule tumorali con una fotocamera digitale a diversi intervalli di tempo dopo la somministrazione di ipericina.Se la ricerca richiede un'immagine della CAM in luce bianca, registrare la CAM prima della somministrazione di ipericina e alla fine dell'esperimento poco prima della fissazione del tessuto, poiché la luce innesca l'attivazione fotografica dell'ipericina. Per eseguire la terapia fotodinamica dopo l'applicazione dell'ipericina, posizionare il CAM sotto la fibra ottica affinché il raggio laser copra l'intera area all'interno dell'anello in silicone. Dopo aver eseguito l'irradiazione in vivo, in questo caso particolare con una luce laser a 405 nanometri ad una velocità di fluenza di 285 milliwatt per centimetro quadrato, registrare CAM utilizzando luce bianca e/o luce fluorescente prima e dopo il trattamento fotodinamico.Fissare il tessuto CAM in una piastra di coltivazione con paraformaldeide al 4% in PBS per un minimo di 2 ore e un massimo di notte, quindi rimuovere la paraformaldeide e ritagliare accuratamente dalla CAM una parte del tessuto all'interno dell'anello di silicone. Tutti questi passaggi dovrebbero essere eseguiti in una cappa aspirante. Lavare la parte tagliata dal tessuto CAM in acqua per 10 minuti e successivamente disidratare in serie di alcol ascendente ponendo il tessuto CAM in etanolo al 70% per 3 minuti, soluzione di eosina per 2 minuti, throcin 96% etanolo per 5 minuti, 100% etanolo per 5 minuti e due volte in xilene per 10 minuti in una nuova capsula di Petri.Successivamente, trasferire i campioni il più rapidamente possibile alla paraffina sciolta in piastre di Petri usando una spatola o un pennello sottile. Dopo 24 ore, posizionare il tessuto nello stampo istologico, riempirlo con un mezzo di incorporamento della paraffina e lasciarlo solidificare in frigorifero, quindi tagliare il CAM solidificato dal mezzo di incorporazione, girarlo nel vassoio di 90 gradi, riempirlo nuovamente con il mezzo di incorporazione e lasciarlo solidificare. Preparare sezioni da 5 a 10 micrometri su un microtomo per l'analisi istopatologica per determinare il danno indotto da PDT.Per preparare le sezioni CAM congelate per l'istologia, montare con cura CAM nativo o paraformaldeide fissa al 4% sul vetrino, riempire lo stampo incorporato a metà con OCT e congelare in azoto liquido o una miscela di ghiaccio secco ed etanolo. Dopo il congelamento, inclinare e far scorrere con attenzione il CAM dal vetrino sulla parte superiore del mezzo OCT congelato. Riporre nello stampo, coprirlo con il mezzo OCT e congelare come descritto in precedenza.Per l'analisi della vascolarizzazione CAM, sono necessari campioni CAM interi. Nell'armadio a flusso laminare, trabocco CAM con una soluzione di fissazione preriscaldata di 4% aldeide paraforme e 2% glutaraldeide in PBS, quindi rimuovere la soluzione di fissazione dopo 48 ore. Quindi, separare accuratamente la CAM dall'embrione con micro forbici e una spazzola fine e lavarla in PBS, quindi montare la CAM lavata su un vetrino e lasciarla asciugare lentamente.Successivamente, fotografa la diapositiva utilizzando una fotocamera digitale in un transilluminatore come fonte di luce bianca omogenea. La posizione del tumore sulla superficie CAM è stata visualizzata sotto luce bianca e luce fluorescente dopo l'aggiunta di ipericina. L'analisi istologica ha mostrato strutture concentriche di cellule squamose anomale che invadono i tessuti sani accompagnate da edema e ispessimento della membrana.Dopo il trattamento con PDT, è stata osservata una chiara differenza nella densità dei vasi all'interno dell'anello e dell'area circostante. La radiazione laser senza la presenza di fotosensibilizzatore non ha causato alcun danno paragonabile al controllo senza alcun trattamento. Dopo 3 ore di incubazione con ipericina, l'irradiazione laser ha provocato fluorescenza causata dalla monomerizzazione dell'ipericina aggregata con danni estesi alla vascolarizzazione.L'analisi istologica ha rivelato che la CAM di controllo non trattata aveva uno spessore relativamente uniforme. Tuttavia, il trattamento PDT ha fatto sì che la CAM diventasse più sottile e più fragile. Abbiamo appena dimostrato come preparare il test CAM di quaglia ex ovo e come usarlo.Pur mantenendo le linee guida, questa metodologia è facile da padroneggiare e può rivelarsi risultati rapidi.

quail-chorioallantoic-membrane-tool-for-photodynamic-diagnosis

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

In questo video, descriviamo il metodo per co-coltivare i gangli della radice dorsale e le cellule tumorali sulla membrana corioallantoica del pulcino o CAM per studiare l'invasione perineurale.

Modello di membrana corioallantoidea di pollo o tumore CAM: un metodo in ovo per simulare l'invasione perineurale delle cellule tumorali

Questo video dimostra l'isolamento della membrana corioallantoidea tumorale dall'embrione di pollo. Il CAM raccolto può essere utilizzato per ulteriori applicazioni a valle.

Raccolta della membrana corioallantoica di pulcino: un metodo per isolare la membrana corioallantoidea portatrice di innesto tumorale dall'uovo di gallina

Il protocollo qui riportato permette di valutare l'efficacia della terapia fotodinamica (PDT) in linee cellulari e l'ottimizzazione delle impostazioni PDT prima di applicare la terapia in modelli animali.

Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

Questo manoscritto descrive l'installazione di romanzo e procedura di una microscopia fotoacustico e il sistema di doppia modalità di tomografia ottica di coerenza per l'imaging non invasivo, privo di etichetta corioretinica di animali più grandi, come i conigli operativa.

Romanzo fotoacustico microscopia e tomografia a coerenza ottica doppia modalità coroidoretinica Imaging in vita gli occhi dei conigli

Terapia fotodinamica (PDT) è una procedura medica che coinvolge l'incubazione di un fotosensibilizzatore esogenicamente applicata (PS) seguita dalla fotoattivazione di luce visibile di indurre apoptosi. Vi presentiamo un protocollo in vitro PDT progettato per simulare PDT che possono essere utilizzate per studiare le differenze nei parametri di trattamento con la luce e incubazione di PS.

Un approccio In Vitro alla terapia fotodinamica

L'invasione perialinale è un fenotipo aggressivo per carcinomi a cellule squamose testa e collo e altri tumori. Il modello di membrana corioalltoica del pulcino è stato utilizzato per studiare angiogenesi, invasione del cancro e metastasi. Qui dimostriamo come questo modello può essere utilizzato per valutare l'invasione perineurale in vivo.

Il modello Chick Chorioallantoic Membrane In Vivo per valutare l'invasione perineurale nel cancro alla testa e al collo

È stato dimostrato un sistema di tomografia fotoacustica a diodi laser pulsato compatto (PLD-PAT) per l'imaging dinamico in vivo ad alta velocità di piccoli vascolarizzazione corticale animale.

Tomografia fotoacustica basata su diodo laser pulsata per il monitoraggio del lavaggio e del lavaggio del colorante nella Vasculatura corticale del ratto

Vi presentiamo il modello di membrana corioallantoica del pollo come modello alternativo, trapiantabile, in vivo per l'innesto di linee cellulari del cancro ginecologico e urologico e tumori derivati dal paziente.

Utilizzo del modello di membrana coroallantoica di pollo in vivo per studiare i tumori ginecologici e urologici

Questo è un metodo efficace per lo screening di soppressori o driver di metastasi del cancro. Le cellule, trasdotte con una libreria di espressione, vengono iniettate nella vascolarizzazione della membrana corioallantoica di pollo per formare colonie metastatiche. Le colonie con ridotta o aumentata invasività vengono asportato, espanse, reiniettate per confermare il loro fenotipo e, infine, analizzate utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento.

Scoperta di regolatori metastatici utilizzando un modello di membrana corioallantoica di pulcino intravitale rapido e quantitativo

Il presente protocollo descrive l'impianto e la valutazione del melanoma nella coroide murina utilizzando la tomografia a coerenza ottica.

Impianto e valutazione del melanoma nella coroide murina mediante tomografia a coerenza ottica

Qui, descriviamo un protocollo per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto di membrana corioallantoica (CAM) di pulcino per il tessuto ovarico umano e dimostriamo l'efficacia della tecnica, il tempo di rivascolarizzazione dell'innesto e la vitalità del tessuto in un periodo di innesto di 6 giorni.

Il modello di membrana corioallantoica del pulcino (CAM) come strumento per lo studio del trapianto di tessuto ovarico

Scopri la preparazione della membrana corioallantoica di quaglia giapponese per diagnosi e terapia fotodinamica del cancro e infezioni microbiche. Questo metodo rispetta i principi 3R e offre rapidi risultati in vivo.

Quaglia Membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia

Esplora altri video