Name: Metodo a doppia colorazione per rilevare la pectina nellinterazione pianta-fungo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Impara un metodo di doppia colorazione per rilevare la pectina nelle interazioni pianta-fungo usando microscopia a luce. Questa tecnica permette di identificare strutture fungine e difetti nei polimeri della parete cellulare patogena.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Hudson W. P. de Carvalho per il supporto allo sviluppo di questo lavoro. Gli autori sono anche grati al Laboratorio di Microscopia Elettronica ''Prof. Elliot Watanabe Kitajima'' per aver fornito la struttura di microscopia ottica. Gli autori ringraziano la dottoressa Flávia Rodrigues Alves Patrício per aver fornito lesioni al materiale vegetale.

1. Preparazione della soluzione tampone e dei reagenti
<ol><li>Preparare il tampone di cacodilato da 2 M aggiungendo 4,28 g di cacodilato di sodio a 100 ml di acqua distillata e regolare il pH a 7,25 con 0,2 N HCl.</li>
	<li>Preparare 100 mL della soluzione fissativa Karnovsky mescolando 10 mL di glutaraldeide acquosa al 25%, 10 mL di formaldeide acquosa al 10%, 25 mL di tampone cacodilato 2 M e 0,5 mL di CaCl2 26. Portare il volume a 100 ml con acqua distillata. NOTA: La soluzione può essere conservata in frigorifero per 6 mesi. ATTENZIONE: La soluzione tampone di cacodilato è tossica; pertanto, maneggiare la soluzione fissativa in una cappa aspirante o in un'area aperta. Evitare di inalare i vapori della soluzione e indossare guanti durante la manipolazione.</li>
	<li>Preparare la soluzione nutritiva acquosa di Hoagland mescolando quanto segue: 3 mM Ca(NO3)2.4H 2O, 2 mM NH4H2PO4, 5 mM KH2PO4, 2 mM MgSO4.7H 2O, 9.07 mM MnSO4, 0.765 mM ZnSO4.7H 2O, 46.4 mM H3BO3, 0,09 mM Na2MoO4. H2O, 0,01 mM CuSO4 e 36 mM FeSO 4,7H2O come ferro-EDTA (acido tetraacetico etilendiammina)27.</li>
</ol>2. Campioni di piante e inoculazione di funghi
NOTA: Per esperimenti su foglie affette da ruggine di caffè, cinque piantine di caffè arabica cv di 2 mesi. I Catuaí sono stati coltivati e tenuti in una serra presso il Centro di Energia Nucleare in Agricoltura (CENA) dell'Università di San Paolo, Piracicaba, Stato di San Paolo, Brasile.
<ol><li>Coltiva piante di caffè in vasi di plastica da 500 ml riempiti con soluzione nutritiva acquosa di Hoagland (pH di ~ 5,5) per 4 mesi in una camera di crescita mantenuta a 27 ± 3 ° C con un fotoperiodo di 12 ore creato da lampade a LED al flusso fotonico di 250 μmol fotoni s-1 m-2. Sostituire la soluzione nutritiva Hoagland ogni settimana per 4 mesi.</li>
	<li>Inoculare quattro foglie espanse di cinque piante sulle loro superfici abassiali con 1 x 103 H. vastatrix uredospore seguendo il metodo descritto al riferimento28. Dopo l'inoculazione, tenere le piante per 48 ore al buio coprendole con un sacchetto di plastica nero. Raccogli le lesioni 30 giorni dopo l'inoculazione.</li>
	<li>Lesioni caratteristiche della raccolta causate da Cercospora coffeicola da Coffea arabica cv. Impianti di Obatã situati (coordinate: -22.906506126269942, -47.015075902025266) presso l'Istituto Biologico, Campinas, Stato di San Paolo, Brasile. Prima di elaborare il campione, analizzare le lesioni in uno stereomicroscopio per verificare la presenza di caffè C. coffeicola conidia. Quindi, montare alcuni vetrini con i conidi per confermare l'eziologia della malattia22.</li>
</ol>3. Raccolta, fissazione e disidratazione del campione
<ol><li>Usando un bisturi e una pinzetta, raccogliere un campione di foglie ~ 10 mm2 nella regione centrale della lesione (macchie gialle; Figura 1) e immergerlo in 30 ml di soluzione fissativa di Karnovsky (Figura 1 e Figura 2A). La fase di fissaggio può avvenire in frigorifero per 48 ore.</li>
	<li>Per almeno quattro volte, sottoporre il campione fogliare a un basso vuoto (500-600 mBar) utilizzando una pompa dell'olio per 15 minuti ciascuna per aumentare la permeabilità della soluzione fissativa nel tessuto fogliare. Eseguire questo passaggio con la rotazione del campione (Figura 1).</li>
	<li>Dopo la fissazione, lavare il campione di foglie tre volte in un tampone cacodilato da 0,5 M (pH 7,2) diluito in acqua distillata per 5 minuti ciascuno e quindi trasferirlo in una serie etanolica graduata (30%, 50%, 70%, 90% (2x) e 100% (2x)) per 15 minuti a ciascuna concentrazione di etanolo (Figura 1 e Figura 2B).</li>
</ol>4. Procedura di incorporamento dell'istoresina
<ol><li>Trasferire gradualmente i campioni al glicole metacrilato (GMA) in tre passaggi, seguendo le istruzioni del produttore. Per prima cosa, preparare la Soluzione A mescolando la polvere GMA (1 g) con 100 ml di resina basica (kit istoresina; Tabella dei materiali) sotto agitazione magnetica, quindi seguire i passaggi seguenti.<ol>
<li>Immergere i campioni in Soluzione A: 100% etanolo per 3 ore.</li>
		<li>Immergere i campioni in Soluzione A: 100% etanolo per 3 ore.</li>
		<li>Immergere i campioni in una resina basica pura per 2-4 giorni. Durante questa fase, sottoporre i campioni a un basso vuoto almeno quattro volte al giorno per 15 minuti seguiti dalla rotazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Polimerizzazione
NOTA: Il processo di polimerizzazione richiede stampi in plastica da 1,2 ml, resina di base e indurente (vedere Tabella dei materiali per i dettagli del kit commerciale).
<ol><li>Miscelare 15 mL di soluzione A (fase 4.1) con 1 mL di indurente in un becher con rotazione per 2 minuti per produrre la soluzione di polimerizzazione (soluzione B).</li>
	<li>Mettere 1,2 ml della soluzione di polimerizzazione (soluzione B) in stampi di plastica. Utilizzando un plettro di legno, trasferire i campioni di foglie lesionate dalla resina basica pura alla soluzione B (Figura 2C). Evitare l'uso di pinzette in quanto possono causare lo schiacciamento dei tessuti.</li>
	<li>Assicurarsi di orientare rapidamente i campioni di foglie perpendicolari agli stampi in plastica poiché la soluzione B diventa rapidamente viscosa entro 5 minuti. Più di un campione di foglie lesionate può essere collocato in un singolo stampo. NOTA: Si consiglia di praticare il passaggio precedente più volte prima di applicare molti campioni. Quando ci sono molti campioni, il tempo di polimerizzazione è diverso tra gli stampi e l'orientamento perpendicolare dei campioni fogliari può essere difficile da raggiungere.</li>
	<li>Quando si ottiene l'orientamento perpendicolare dei campioni di foglie, attendere 30 minuti, quindi trasferire lo stampo di plastica in una camera di plastica o vetro contenente gel di silice per evitare l'umidità. Attendere 2-3 ore per la polimerizzazione.</li>
	<li>Una volta che la resina e il campione di foglie sono polimerizzati dopo il periodo di 2-3 ore, staccare il blocco risultante dallo stampo di plastica levigando la base del blocco con una lima di levigatura. Quindi, incollare il blocco su un pezzo di legno (Figura 2D).</li>
</ol>6. Sezionamento
<ol><li>Utilizzando un microtomo rotativo dotato di lame in acciaio da 8 cm (Figura 2E), tagliare il blocco in sezioni spesse 5 μm. Posizionare le sezioni su vetrini ricoperti di acqua distillata. Trasferire i vetrini con le sezioni galleggianti sull'acqua su una piastra calda a 40 °C per asciugare e favorire l'adesione delle sezioni alle guide di vetro.</li>
	<li>Dopo l'essiccazione (Figura 2F), etichettare i vetrini con il nome di riferimento del blocco e il numero della diapositiva.</li>
</ol>7. Doppio processo di colorazione
<ol><li>Coprire le sezioni con 2 mL di blu cotone al 5% in lattofenolo (40% glicerolo, 20% fenolo e 20% acido lattico in acqua) e riscaldarle su una piastra calda a 45 °C per 5 minuti (Figura 3A).</li>
	<li>Rimuovere il colorante in eccesso lavando il vetrino tre volte in un becher riempito con acqua distillata (Figura 3B-D).</li>
	<li>Macchiare con 2 mL di rosso rutenio allo 0,01% in acqua per 1 minuto (Figura 3E).</li>
	<li>Rimuovere il colorante in eccesso lavando il vetrino tre volte in un becher riempito con acqua distillata (Figura 3F,G).</li>
	<li>Mettere una goccia di acqua distillata sopra le sezioni e coprire le sezioni con un coverslip di 24 mm x 60 mm per eseguire l'analisi al microscopio ottico.</li>
</ol>

<ol><li>deBary, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+development+of+some+parasitic+fungi%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Natural+Sciences.+Botany+and+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Research on the development of some parasitic fungi.</a> Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5(1863).</li>
<li>Mangin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+the+Peronospores%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+Natural+History+Society+of+Autun%22%5BJournal%5D)">Research on the Peronospores.</a> Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).</li>
<li>Underwood, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plant+cell+wall%3A+a+dynamic+barrier+against+pathogen+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion.</a> Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).</li>
<li>Hückelhoven, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+wall-associated+mechanisms+of+disease+resistance+and+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility.</a> Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).</li>
<li>Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Callose-mediated+resistance+to+pathogenic+intruders+in+plant+defense-related+papillae%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).</li>
<li>Chowdhury, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+accumulation+of+callose%2C+arabinoxylan+and+cellulose+in+nonpenetrated+versus+penetrated+papillae+on+leaves+of+barley+infected+with+Blumeria+graminis+f.+sp.+Hordei%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei.</a> New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+cell+wall-associated+defense+responses+to+infection+by+Sporisorium+scitamineum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum.</a> Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).</li>
<li>Caffall, K. H., Mohnen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure%2C+function%2C+and+biosynthesis+of+plant+cell+wall+pectic+polysaccharides%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Research%22%5BJournal%5D)">The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).</li>
<li>Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarpita%2C+NC+%22Biochemistry+and+Molecular+Biology+of+Plants.%2C+2nd+Edition%22">Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition</a>. , Wiley Blackwell. New York. 45(2015).</li>
<li>Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methyl+esterification+of+pectin+plays+a+role+during+plant-pathogen+interactions+and+affects+plant+resistance+to+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases.</a> Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).</li>
<li>Lionetti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectoplate%3A+the+simultaneous+phenotyping+of+pectin+methylesterases%2C+pectinases%2C+and+oligogalacturonides+in+plants+during+biotic+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses.</a> Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).</li>
<li>Lionetti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+pectin+methylesterase+inhibitors+protect+cell+wall+integrity+for+Arabidopsis+immunity+to+Botrytis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis.</a> Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).</li>
<li>Heath, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haustorium+sheath+formation+in+cowpea+leaves+immune+to+rust+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection.</a> Phytopathology. 61, 383-388 (1971).</li>
<li>Silva, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+resistance+to+the+main+diseases%3A+leaf+rust+and+coffee+berry+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brazilian+Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease.</a> Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).</li>
<li>An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+effects+on+root+cell+wall+composition+and+ion+contents+in+two+soybean+cultivars+under+salinity+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress.</a> Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).</li>
<li>Marques, J. P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugarcane+smut%3A+shedding+light+on+the+development+of+the+whip-shaped+sorus%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus.</a> Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).</li>
<li>Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endophytes+versus+biotrophic+and+necrotrophic+pathogens-are+fungal+lifestyles+evolutionarily+stable+traits%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits.</a> Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).</li>
<li>Avelino, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coffee+rust+crises+in+Colombia+and+Central+America+%282008-2013%29%3A+impacts%2C+plausible+causes+and+proposed+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Security%22%5BJournal%5D)">The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions.</a> Food Security. 7, 303-321 (2015).</li>
<li>Zambolim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+management+of+coffee+leaf+rust+in+Brazil%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Current status and management of coffee leaf rust in Brazil.</a> Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).</li>
<li>Swiderska-Burek, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytopathogenic+Cercosporoidfungi-from+taxonomy+to+modern+biochemistry+and+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555(2020).</li>
<li>Andrade, C. C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+process+and+defense+response+of+two+distinct+symptoms+of+Cercospora+leaf+spot+in+coffee+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytoparasitica%22%5BJournal%5D)">Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves.</a> Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).</li>
<li>Zambolim, L. Coffee tree diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZambolim%2C+L+%22Handbook+of+Phytopathology%3A+Diseases+of+cultivated+plants.+5th+ed%22">Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed</a>. , Agronômica Ceres Santana (in Portuguese). São Paulo. 810(2016).</li>
<li>Castaño, A. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+rust%5BTitle%5D)+AND+%22Informative+report+Cenicaf%C3%A9%22%5BJournal%5D)">Coffee rust.</a> Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).</li>
<li>Echandi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coffee+rust%2C+caused+by+the+fungus+Cercospora+coffeicola%5BTitle%5D)+AND+%22Turrialba%22%5BJournal%5D)">Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola.</a> Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).</li>
<li>Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+process+of+Cercospora+coffeicola+on+coffee+leaf%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf.</a> Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolality+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).</li>
<li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil%5BTitle%5D)+AND+%22College+of+Agriculture%2C+Agricultural+Experiment+Station%22%5BJournal%5D)">The water-culture method for growing plants without soil.</a> College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , University of California. Berkeley, California. 347(1950).</li>
<li>Eskes, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Coffee+rust%3A+epidemiology%2C+resistance+and+management%22%5BJournal%5D)">Resistance.</a> Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, Boca Raton. 171(1989).</li>
<li>Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+aspects+of+the+plant-rust+fungus+interface+during+the+compatible+interaction+Coffea+arabica+%28cv.+Caturra%29-Hemileia+vastatrix+%28race+III%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Plant+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III).</a> International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).</li>
<li>Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Process+of+infection+and+colonization+of+Pseudocercospora+kaki+in+persimmon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves.</a> Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).</li>
<li>Hayat, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHayat%2C+MA+%22Principles+and+Techniques+of+Electron+Microscopy%3A+Biological+Applications%2C+Vol.+1%22">Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1</a>. , International Publishing. Berkeley Heights. 564(1981).</li>
<li>Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T. Large plant samples: how to process for GMA embedding. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaiva%2C+EAS+%22Light+microscopy%3A+methods+and+protocols%22">Light microscopy: methods and protocols</a>. Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. 689, Humana Press. 37-49 (2011).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+staining+technique+for+fungal-infected+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Turkish+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">New staining technique for fungal-infected plant tissues.</a> Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).</li>
<li>Schuller, A., Ludwig-Müller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histological+methods+to+detect+the+clubroot+pathogen+Plasmodiophora+brassicae+during+its+complex+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle.</a> Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).</li>
<li>Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathological+evidence+of+concomitant+sexual+and+asexual+reproduction+of+Elsino%C3%AB+ampelina+in+grapevine+under+subtropical+climate%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+and+Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate.</a> Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517(2020).</li>
<li>Marques, J. P. R., Soares, M. K. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarques%2C+JPR+%22Manual+of+Techniques+Applied+to+Plant+Histopathology%22">Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology</a>. Piracicaba, F. E. A. L. Q. , Santana. in Portuguese 140(2021).</li>
<li>Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+Phakopsora+euvitis+on+Vitis+vinifera%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera.</a> European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).</li>
<li>Chesters, C. G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+methods+of+using+cotton+blue+as+a+mycological+stain%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Three methods of using cotton blue as a mycological stain.</a> Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).</li>
<li>Macedo, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+of+Techniques+in+Plant+Histology%5BTitle%5D)+AND+%22Feira+de+Santana%3A+State+University+of+Feira+de+Santana%22%5BJournal%5D)">Manual of Techniques in Plant Histology.</a> Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , in Portuguese 68(1997).</li>
<li>Lecker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+lactophenol+cotton+blue+slide+mounts%5BTitle%5D)+AND+%22Community+Eye+Health+Journal%22%5BJournal%5D)">Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts.</a> Community Eye Health Journal. 12 (30), 24(1999).</li>
<li>Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactic+acid+in+wool+dyeing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Society+of+Dyers+and+Colourists%22%5BJournal%5D)">Lactic acid in wool dyeing.</a> Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103(1895).</li>
<li>Chamberlain, C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChamberlain%2C+CJ+%22Methods+in+Plant+Histology%22">Methods in Plant Histology</a>. , The University of Chicago Press. Chicago. 349(1932).</li>
<li>Sterling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal-structure+of+ruthenium+red+and+stereochemistry+of+its+pectin+stain%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Botany%22%5BJournal%5D)">Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain.</a> American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).</li>
<li>Luft, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ruthenium+red+and+violet.+1.+Chemistry%2C+purification%2C+methods+of+use+for+electron+microscopy+and+mechanism+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action.</a> The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).</li>
<li>Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A. Cell Wall. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuckeridge%2C+MS+%22Plant+Physiology%22">Plant Physiology</a>. Kerbauy, G. B. , Guanabara Koogan. Rio de Janeiro. in Portuguese 165-181 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Il presente lavoro introduce un test istochimico alternativo a doppia colorazione per studiare la composizione della pectina delle pareti cellulari che incapsula haustoria in un patosistema biotrofico. L'obiettivo è anche quello di dimostrare l'efficacia del metodo per rilevare i funghi necrotrofici e i cambiamenti della parete cellulare da esso indotti. Qui, la pectina delle pareti cellulari del parenchima del caffè può incapsulare sia il collo che l'haustorium del fungo ruggine Hemileia vastatrix. Silva et al....

I meccanismi di difesa della parete cellulare nelle piante sono cruciali per frenare l'infezione fungina. Gli studi hanno riportato cambiamenti nello spessore e nella composizione della parete cellulare dal 19° secolo 1,2. Questi cambiamenti possono essere indotti da un agente patogeno fungino che stimola la formazione di una papilla, che impedisce ai funghi di entrare nella cellula o potrebbe essere utilizzato per incapsulare le ife per isolare il protoplasto della cellula ospite dalla haustoria fungina. La produzione di una barriera dinamica della parete cellulare (cioè papille e un haustorio completamente incassato) è importante per promuovere la resistenza delle piante3. Studi istopatologici sulle malattie fungine hanno indagato l'insorgenza di questi meccanismi e hanno descritto i polimeri della parete cellulare, la cellulosa, l'emicellulosa (arabinoxilani) e la callosio come meccanismi di resistenza all'attacco fungino 4,5,6,7.
La parete cellulare è la prima barriera contro l'attacco di microrganismi, compromettendo l'interazione pianta-fungo. I polisaccaridi pectici compongono la parete cellulare e rappresentano circa il 30% della composizione della parete cellulare nelle cellule primarie delle piante di eudico in cui gli omogalacturonani sono il polimero più abbondante (circa il 60%)8. Il Golgi secerne composti complessi di pectina che compongono le catene di acido galatturonico, che possono o meno essere metilate 8,9. Dal 2012, la letteratura ha sottolineato che il grado di esterificazione della pectina metile è fondamentale per determinare la compatibilità durante l'infezione da enzimi pectici microbici 10,11,12. Pertanto, sono necessari protocolli per verificare la presenza e la distribuzione di composti pectici nei patosistemi pianta-fungina.
Varie tecniche sono state utilizzate per rilevare l'incapsulamento di papille o haustoria. I metodi di riferimento utilizzati sono la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) di tessuti fissi e la microscopia ottica di tessuti viventi e fissi. Per quanto riguarda il TEM, diversi studi hanno dimostrato il ruolo strutturale delle apposizioni della parete cellulare nella resistenza fungina 13,14,15,16 e che l'uso di lectine e anticorpi è un metodo complesso per localizzare i polimeri di carboidrati16. Tuttavia, gli studi dimostrano che la microscopia ottica è un approccio importante e che gli strumenti istochimici e immunoistochimici consentono una migliore comprensione della composizione delle papille e dell'involucro dell'haustorium 6,7.
I funghi patogeni mostrano due tipi principali di stili di vita: biotrofico e necrotrofico. I funghi biotrofici dipendono dalle cellule viventi per la loro nutrizione, mentre i funghi necrotrofici uccidono le cellule ospiti e quindi vivono nei tessuti morti17. In America Latina, la ruggine delle foglie di caffè, causata dal fungo Hemileia vastatrix, è una malattia importante nelle colture di caffè18,19. Hemileia vastatrix presenta un comportamento biotrofico e, tra i cambiamenti strutturali osservati in specie o cultivar di caffè resistenti, sono stati riportati una risposta di ipersensibilità, deposizione di callosio, cellulosa e lignina sulle pareti cellulari, nonché ipertrofia cellulare14. Per quanto a conoscenza degli autori, la letteratura non riporta informazioni sull'importanza della pectina nella resistenza alla ruggine del caffè. D'altra parte, i funghi necrotrofici che causano la cercosporiosi prendono di mira la pectina attraverso una serie di enzimi associati alla degradazione della parete cellulare, come le pectinasi e la poligalatturonasi20. La cercosporiosi nel caffè, causata dal fungo Cercospora coffeicola è anche una grave minaccia per le colture di caffè21,22. Questo fungo provoca lesioni necrotiche sia nelle foglie che nelle bacche. Dopo la penetrazione, C. coffeicola colonizza i tessuti vegetali attraverso percorsi intracellulari e intercellulari 23,24,25.
Il presente protocollo indaga la presenza di strutture fungine e pectina sulle pareti cellulari. Questo protocollo è utile per identificare la risposta vegetale associata alla pectina (colorata con colorante rosso rutenio, che è specifico per i gruppi acidi degli acidi poliuronici della pectina), indotta dall'ospite in un'interazione biotrofica con il fungo. Aiuta anche a verificare l'effetto dei funghi necrotrofici sulla degradazione delle pareti cellulari pectiche. I risultati attuali indicano che il metodo della doppia colorazione è efficace per discriminare le strutture e la fase riproduttiva dei funghi.

<table><tbody><tr><td>Lame DB80 HS</td><td>Leica</td><td>14035838383</td><td>Sezionamento</td></tr><tr><td>tampone di cacodilato</td><td>EMS</td><td># 11652</td><td>Fissazione</td></tr><tr><td>Cotone Blu Lattofenolo</td><td>Metaqu&iacute; mica</td><td>70SOLSIG024629</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>EMS</td><td>#15712</td><td>Fissazione</td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>EMS</td><td>#16216</td><td>Kit</td></tr><tr><td>istoresina</td> di fissazione <td>Technovit /EMS</td><td>#14653</td><td>Istoresina per inclusione</td></tr><tr><td>Piastra riscaldante</td><td>Dubesser</td><td>SSCD25X30-110V</td><td>Microscopia colorante</td></tr><tr><td></td><td>Zeiss#</td><td>490040-0030-000</td><td>Acquisizione di immagini</td></tr><tr><td>Microtomo (Leica RM 2540)</td><td>Leica</td><td>149BIO000C1 14050238005</td><td>Sezionamento</td></tr><tr><td>Vassoio per tazze di stampaggio in plastica</td><td>EMS</td><td>10176-30</td><td>Colorazione</td></tr><tr><td>rosso rutenio</td><td>LABHouse</td><td>#</td><td>006004 Software di colorazione</td></tr><tr><td>Axion Vision</td><td>Zeiss</td><td>#410130-0909-000</td><td>Acquisizione immagini</td></tr><tr><td>Pompa a vuoto</td><td>Prismatec</td><td>131 TIPO 2 V.C.</td><td>fissazione</td></tr></tbody></table>

metodo a doppia colorazione per rilevare la pectina nell'interazione pianta-fungo

Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction

Le cellule vegetali utilizzano diversi meccanismi strutturali, sia costitutivi che inducibili, per difendersi dalle infezioni fungine. L'incapsulamento è un meccanismo inducibile efficiente per isolare la haustoria fungina dal protoplasto cellulare vegetale. Al contrario, la pectina, uno dei componenti polimerici della parete cellulare, è un bersaglio di diversi enzimi pectolitici nelle interazioni necrotrofiche. Qui viene presentato un protocollo per rilevare la pectina e le ife fungine attraverso la microscopia ottica. Vengono studiati l'incapsulamento ricco di pectina nelle cellule delle foglie di caffè infettate dal fungo ruggine Hemileia vastatrix e la modificazione della parete cellulare mesofilla indotta da Cercospora coffeicola . I campioni di foglie lesionate sono stati fissati con la soluzione di Karnovsky, disidratati e incorporati nel glicole metacrilato per 2-4 giorni. Tutte le fasi sono state seguite dal pompaggio del vuoto per rimuovere l'aria negli spazi intercellulari e migliorare il processo di incorporamento. I blocchi incorporati sono stati sezionati in sezioni spesse 5-7 μm, che sono state depositate su un vetrino coperto d'acqua e successivamente riscaldate a 40 °C per 30 min. Successivamente, i vetrini sono stati doppiamente colorati con il 5% di blu di cotone in lattofenolo per rilevare il fungo e lo 0,05% di rosso rutenio in acqua per rilevare la pectina (gruppi acidi di acidi poliuronici della pectina). Le haustoria fungine di Hemileia vastatrix sono risultate incapsulate dalla pectina. Nella cercosporiosi del caffè, le cellule mesofille hanno mostrato la dissoluzione delle pareti cellulari e sono state osservate ife e conidiofori intercellulari. Il metodo qui presentato è efficace per rilevare una risposta associata alla pectina nell'interazione pianta-funghi.

La colorazione di lattofenolo blu cotone sulla sezione incorporata in GMA ha rivelato la presenza di diverse strutture fungine tra e all'interno delle cellule mesofille del caffè in entrambe le interazioni fungine biotrofiche e necrotrofiche.
Nel patosistema biotrofico, quando colorato con il metodo della doppia colorazione, Hemileia vastatrix hyphae contenente pareti cellulari e il denso contenuto di protoplasti appaiono in blu scuro sia nel parenchima spugnoso che in quello palizzat...

Questo protocollo descrive un metodo microscopico per rilevare la pectina nell'interazione caffè-fungo.

Metodo a doppia colorazione per rilevare la pectina nell'interazione pianta-fungo

Plant cells use different structural mechanisms, either constitutive or inducible, to defend themselves from fungal infection. Encapsulation is an ...

Questo protocollo è significativo in quanto consente di identificare l'interazione pianta-fungo. Oltre a colorare la pectina, dimostra anche difetti sul polimero della parete cellulare patogena e consente l'identificazione delle strutture fungine. Questa tecnica semplice e senza complicazioni può essere eseguita utilizzando la microscopia ottica e non richiede alcuna attrezzatura costosa come il microscopio elettronico a scansione.Inoltre, è una tecnica veloce che ottiene un'eccellente distinzione di strutture vegetali per studi istopatologici. La tecnica identifica l'interazione pianta-fungo. Quindi, collabora per diagnosticare le malattie causate da funghi biotrofici e necrotrofici come la ruggine del caffè e la cercosporiosi.Per iniziare, raccogliere e circa 10 millimetri quadrati di campione di foglie nella regione centrale della lesione usando un bisturi e una pinzetta e immergerlo in 30 millilitri di soluzione fissativa Karnovsky. Sottoporre il campione di foglie a un basso vuoto da 500 a 600 millibar per 15 minuti utilizzando una pompa dell'olio, almeno quattro volte per aumentare la permeabilità della soluzione fissativa nel tessuto fogliare. Dopo la fissazione, lavare il campione di foglie tre volte in un tampone cacodilato da 0,5 M diluito in acqua distillata per cinque minuti ciascuno, quindi trasferirlo in una serie etanolica graduata per 15 minuti a ciascuna concentrazione di etanolo.Per trasferire gradualmente i campioni al glicole metacrilato, creare la soluzione A mescolando un grammo di polvere di glicole metacrilato con 100 millilitri di resina basica sotto agitazione magnetica. Quindi, immergere i campioni in rapporto uno a due della soluzione A e al 100% di etanolo per tre ore. Immergere i campioni in rapporto uno a uno per la soluzione A: 100% di etanolo per tre ore, quindi immergerli in una resina basica pura per due o quattro giorni.Sottoporre il campione a un basso vuoto almeno quattro volte al giorno per 15 minuti, seguito dalla rotazione. Mescolare 15 millilitri di soluzione A con un millilitro dell'indurente in un becher con rotazione per due minuti per produrre la soluzione di polimerizzazione B.Put 1,2 millilitri di questa soluzione di polimerizzazione B in stampi di plastica. Utilizzando un plettro di legno, trasferire i campioni di foglie lesionate dalla resina basica pura alla soluzione B ed evitare l'uso di pinzette in quanto possono causare lo schiacciamento dei tessuti.Assicurarsi di orientare rapidamente i campioni di foglie perpendicolarmente agli stampi in plastica poiché la soluzione B diventa rapidamente viscosa. Quando si ottiene l'orientamento perpendicolare dei campioni di foglie, attendere 30 minuti e quindi trasferire lo stampo di plastica in una camera di plastica o vetro contenente gel di silice per evitare l'umidità. Una volta che la resina e il campione di foglie sono polimerizzati dopo due o tre ore, staccare il blocco risultante dallo stampo di plastica levigando la base del blocco con una lima di levigatura.Quindi, incollare il blocco su un pezzo di legno. Tagliare il blocco in sezioni spesse cinque micrometri utilizzando un microtomo rotante dotato di lame in acciaio di otto centimetri. Posizionare le sezioni su vetrini ricoperti di acqua distillata.Quindi, trasferire le diapositive su una piastra calda per asciugare a 40 gradi Celsius e favorire l'adesione delle sezioni alle diapositive di vetro. Dopo l'essiccazione, etichettare i vetrini con il nome di riferimento del blocco e il numero della diapositiva. Coprire le sezioni con due millilitri di blu cotone al 5% in lattofenolo e riscaldarle su una piastra calda a 45 gradi Celsius per cinque minuti.Rimuovere il colorante in eccesso lavando la diapositiva tre volte in un becher pieno di acqua distillata. Macchialo con due millilitri di rosso rutenio allo 0,01% in acqua per un minuto. Rimuovere il colorante in eccesso lavando la diapositiva tre volte in un becher pieno di acqua distillata.Mettere una goccia di acqua distillata sopra le sezioni e coprire le sezioni con un coperchio per eseguire l'analisi al microscopio ottico. Nel metodo della doppia colorazione, Hemileia vastatrix hyphae contenente pareti cellulari e il denso contenuto di protoplasti apparivano blu scuro sia nel parenchima spugnoso che in quello palizzata. Anche la cellula madre dell'haustorium e l'haustoria mostravano un colore blu scuro.La controcolorazione con rutenio rosso chiaramente definito distribuzione fungina negli spazi intercellulari. Durante l'interazione, la cellula madre di Hemileia vastatrix haustorium ha rotto la parete cellulare ospite e ha sviluppato un collo haustoriale circondato da composti pectici. L'incapsulamento di colore rosa-rosso ricco di pectina del collo haustoriale non può impedire la formazione haustoriale.In alcuni casi, l'incapsulamento ricco di pectina ha racchiuso l'haustorium in modo incompleto. E in alcuni casi, l'haustorium è completamente incapsulato. La parete cellulare ricca di pectina mantiene l'integrità al bordo della lesione, dove il fungo non è presente.Il metodo della doppia colorazione ha dimostrato la presenza di ife intercellulari. Nelle zone di interazione, le pareti cellulari della pectina sembravano perdere la loro integrità a causa della dissoluzione. Strutture riproduttive come i conidi sono state trovate nell'epidermide adassiale.Cercospora coffeicola hyphae sono state trovate nella camera substomatica come strutture di curling, e il parenchima palizzata nella regione della lesione sembra subire la lisi della parete cellulare. Evitare l'uso di pinzette in quanto possono causare lo schiacciamento dei tessuti. Ulteriori studi istopatologici su ruggini, antracnosi, cercosporiosi, smut e altre interazioni biotrofiche, emibiotrofiche e necrotrofiche pianta-fungine dovrebbero essere condotti per studiare il potenziale uso di questa tecnica in diversi patosistemi.

double-staining-method-to-detect-pectin-in-plant-fungus-interaction

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Questo video mostra un metodo di doppia colorazione utilizzando il rosso rutenio e il blu di cotone lattofenolo per visualizzare pectine e chitine durante le interazioni pianta-fungo in una pianta di ruggine del caffè. La procedura aiuta a comprendere i meccanismi di difesa delle piante durante le infezioni fungine.

Metodo di doppia colorazione: una tecnica per visualizzare le interazioni pianta-fungo utilizzando il rosso rutenio e il blu di cotone lattofenolo

Questo video descrive un metodo per far crescere e analizzare qualitativamente i biofilm batterici su ife fungine utilizzando la microscopia. I biofilm batterici si formano frequentemente sulle superfici fungine e coinvolgono numerosi processi di interazione batterico-fungina, come la cooperazione metabolica, la competizione o la predazione.

Un metodo per la preparazione del campione per visualizzare i batteri che formano biofilm sulle ife fungine

Questo video dimostra una tecnica di immunocolorazione per localizzare le proteine arabinogalattano (AGP) e le pectine nei tessuti vegetali. Le sezioni di tessuto vegetale fissate e incorporate in resina vengono colorate con anticorpi primari e secondari fluorescenti specifici per AGP e pectina e un colorante fluorescente legante la cellulosa per rivelare la loro colocalizzazione tessuto-specifica nella parete cellulare.

Immunolocalizzazione delle proteine dell'arabinogalattano e delle pectine nei tessuti vegetali

La composizione della parete cellulare vegetale varia tra i tipi di tessuto e può includere lignina, cellulosa, emicellulosa e pectina. Sono state sviluppate varie tecniche di colorazione per visualizzare le differenze a livello di tipo cellulare. Questo articolo è una raccolta di tecniche di colorazione della parete cellulare comunemente usate.

Colorazione istochimica di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Cellula secondaria Elementi da parete

I coloranti fluorescenti vitali sono strumenti essenziali per l'analisi dell'imaging a cellule vive nella moderna biologia delle cellule fungine. Questo documento descrive in dettaglio l'applicazione di coloranti fluorescenti affermati e meno noti per il monitoraggio della dinamica della membrana plasmatica, dell'endo/esocitosi e della morfogenesi delle pareti cellulari nei funghi filamentosi.

Applicazione di coloranti fluorescenti selettivi a membrana e a parete cellulare per l'imaging a celle vive di Filamentous Fungi

Questo protocollo descrive in dettaglio come viene fissato il materiale vegetale per l'immunolocalizzazione delle proteine arabinogalactane e delle pectine, incorporato in una resina acrilica idrofila, sezionale e montato su vetrini. Mostriamo che gli epitopi correlati alla parete cellulare verranno rilevati con anticorpi specifici.

Immunolocalizzazione fluorescente delle proteine arabinogalactane e delle pectine nella parete cellulare dei tessuti vegetali

Il protocollo qui descrive i metodi per la valutazione dei modelli di colonizzazione micorrizica arbuscolare e la strategia nelle radici per due specie: Zea mays e Festuca rubra. L'uso del metodo MycoPatt consente il calcolo dei parametri, la conversione delle strutture micorriziche in dati digitali e la mappatura della loro posizione reale nelle radici.

Mappe micorriziche come strumento per esplorare i modelli di colonizzazione e le strategie fungine nelle radici di Festuca rubra e Zea mays

Questo protocollo mira a fornire procedure dettagliate per la raccolta, la fissazione e il mantenimento di campioni di piante micoeterotrofiche, applicando diverse tecniche di microscopia come la microscopia elettronica a scansione e trasmissione, la microscopia ottica, confocale e a fluorescenza per studiare la colonizzazione fungina nei tessuti delle piante e nei semi germinati con funghi micorrizici.

Tecniche di microscopia per l'interpretazione della colonizzazione fungina nei tessuti delle piante micoeterotrofiche e della germinazione simbiotica dei semi

A causa dell'opacità del suolo, le interazioni tra i suoi microbi costituenti non possono essere facilmente visualizzate con risoluzione cellulare. Qui vengono presentati due strumenti microfluidici, che offrono nuove opportunità per studiare le interazioni fungo-microbiche. I dispositivi sono versatili e semplici da usare, consentendo un elevato controllo spaziotemporale e immagini ad alta risoluzione a livello cellulare.

Strumenti microfluidici per sondare le interazioni fungine-microbiche a livello cellulare

Il presente articolo si propone di fornire protocolli dettagliati e adeguati per l'isolamento di funghi endofiti associati alle piante, la conservazione a lungo termine degli isolati, la caratterizzazione morfologica e l'estrazione del DNA totale per la successiva identificazione molecolare e analisi metagenomica.

Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Questo rapporto descrive i metodi fondamentali utilizzati per coltivare e manipolare sperimentalmente l'alga streptofita unicellulare, Penium margaritaceum. Fornisce inoltre protocolli fondamentali di imaging basato sulla microscopia, tra cui la marcatura di cellule vive con anticorpi monoclonali e altre sonde fluorescenti e la microscopia elettronica a scansione.

Protocolli di Screening Sperimentale, Tecniche di Immunocitochimica e Imaging Microscopico per Penium margaritaceum

Impara un metodo di doppia colorazione per rilevare la pectina nelle interazioni pianta-fungo usando microscopia a luce. Questa tecnica permette di identificare strutture fungine e difetti nei polimeri della parete cellulare patogena.

Metodo a doppia colorazione per rilevare la pectina nell'interazione pianta-fungo

Esplora altri video