Name: Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Scopri un modello di glaucoma indotto mediante cauterizzazione a 360° del plesso vascolare limbare nei ratti. Questo metodo non invasivo e riproducibile consente di studiare la neurodegenerazione retinica e del nervo ottico in vivo.

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Ringraziamo i nostri tecnici di laboratorio José; Nilson dos Santos, Daianne Mandarino Torres, José Francisco Tibúrcio, Gildo Brito de Souza e Luciano Cavalcante Ferreira. Questa ricerca è stata finanziata da FAPERJ, CNPq e CAPES.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La cauterizzazione del plesso limbare (LPC) è un nuovo modello post-trabecolare con il vantaggio di colpire strutture vascolari facilmente accessibili che non richiedono la dissezione congiuntivale o tenone17,28. A differenza del modello di cauterizzazione delle vene a vortice, un rinomato modello OHT basato sulla compromissione chirurgica del drenaggio venoso coroideo, non si prevede che la congestione venosa influenzi l'aumento della IOP nel modello LPC, poiché...

La letteratura medica comprende il glaucoma come un gruppo eterogeneo di neuropatie ottiche caratterizzate da una progressiva degenerazione delle cellule gangliari retiniche (RGC), dendriti, soma e assoni, con conseguente coppettazione strutturale (scavo) del disco ottico e deterioramento funzionale del nervo ottico, che porta all'amaurosi nei casi non controllati interrompendo la trasmissione delle informazioni visive dall'occhio al cervello1. Il glaucoma è attualmente la causa più comune di cecità irreversibile in tutto il mondo, e si prevede che raggiungerà circa 111,8 milioni di persone nel 20402, influenzando così profondamente la qualità della vita dei pazienti (QoL) e portando a significative preoccupazioni socioeconomiche3.
L'elevata pressione intraoculare (IOP) è uno dei più importanti e l'unico fattore di rischio modificabile per lo sviluppo e la progressione del glaucoma. Tra i molteplici tipi di glaucoma, tutti, ad eccezione del glaucoma tensivo normale (NTG), sono associati a IOP elevata in qualche momento della storia clinica della malattia. Nonostante i notevoli progressi clinici e chirurgici per indirizzare la IOP e rallentare o arrestare la progressione della malattia, i pazienti perdono ancora la vista a causa del glaucoma 4,5. Pertanto, una comprensione approfondita della fisiopatologia complessa e multifattoriale di questa malattia è indispensabile per lo sviluppo di trattamenti più efficaci, in particolare per fornire neuroprotezione alle RGC.
Tra una varietà di approcci sperimentali per la comprensione dei meccanismi della malattia, i modelli animali basati sull'ipertensione oculare (OHT) assomigliano più da vicino al glaucoma umano. I modelli di roditori sono particolarmente utili in quanto sono a basso costo, sono facili da maneggiare, possono essere manipolati geneticamente, hanno una breve durata di vita e presentano caratteristiche anatomiche e fisiologiche oculari paragonabili a quelle umane, come la produzione di umore acqueo e il drenaggio 6,7,8,9,10,11,12,13 . I modelli attualmente utilizzati includono la sclerosi del trabecolato a seguito di iniezione di soluzione salina ipertonica nelle vene episclerali 14, l'iniezione intracamerale di microsfere15 o sostanze viscoelastiche 16, la cauterizzazione delle vene a vortice17, la fotocoagulazione del trabecolato con laser ad argon 18, la sutura circumlimbale 19 e l'uso di un modello transgenico di OHT legato all'età (topi DBA/2J)8. Tuttavia, l'invasività, l'opacizzazione post-operatoria della cornea, l'interruzione del segmento anteriore, le ampie curve di apprendimento, le attrezzature costose e le IOP postoperatorie altamente variabili, sono tra le insidie segnalate associate ai modelli attuali, rendendo lo sviluppo di un modello alternativo di OHT una richiesta per superare questi problemi20,21,22.
Il presente protocollo formalizza una nuova procedura chirurgica per indurre l'OHT come proxy del glaucoma, basata sulla cauterizzazione del plesso limbare (LPC) nei roditori23. Si tratta di un modello facile, riproducibile, accessibile e non invasivo che fornisce un'elevata efficienza e una bassa variabilità dell'aumento della IOP, associata a un tasso eccezionalmente elevato di recupero clinico completo, fornendo quindi una valutazione funzionale in vivo in un numero ridotto di animali utilizzati in ciascun esperimento. La tecnica chirurgica induce OHT subacuta con un graduale ritorno ai livelli basali in pochi giorni, che modella l'attacco ipertensivo osservato nel glaucoma acuto ad angolo chiuso. Inoltre, il recupero della IOP nel modello è seguito da una continua neurodegenerazione glaucomatosa, utile per futuri studi meccanicistici sulla degenerazione secondaria delle RGC, che si verifica in diversi casi di glaucoma umano nonostante un adeguato controllo della IOP.

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>Isofar</td><td>201</td><td>Utilizzato per la preparazione di tessuti per microscopia elettronica (fase 5)</td></tr><tr><td>Elettrodo attivo per elettroretinografia</td><td>Hansol Medical</td> <td>Co-Ago</td> <td>in acciaio inossidabile 0,25 mm & volte; 15 mm</td></tr><tr><td>Anestalcon</td><td>Novartis Bioci&ecirc; ncias S/A</td><td>MS-1.0068.1087</td><td>Proxymetacaine cloridrato 0,5%</td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>Vetec</td><td>560</td><td>Utilizzato per la preparazione di tessuti per microscopia elettronica (fase 5)</td></tr><tr><td>Cauteria Punta fine a bassa temperatura 10/bx</td><td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td>Cauterio oftalmico a bassa temperatura</td></tr><tr><td>Cetamin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>000200-3-000003</td><td>Ketamina cloridrato 10%</td></tr><tr><td>DAKO</td><td>Dako North America</td><td>S3023</td><td>Mezzo di montaggio antisbiadimento</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>28718-90-3</td><td>diamidino-2-fenilindo; controcolorante nucleare fluorescente blu; emissione a 452&plusmn; 3 nm</td></tr><tr><td>Ecofilm</td><td>Crist&aacute; lia Produtos Qu&iacute; micos Farmac&ecirc; uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0487</td><td>Carmellosa sodica 0,5%</td></tr> <tr><td>EPON Resina</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>-</td><td>Resina epossidica utilizzata per microscopia elettronica, composta da una miscela di quattro reagenti: Resina Poly/Bed 812 (CAT#08791); DDSA - Anidride dodecenilsuccinica (CAT#00563); NMA - Anidride metilica nadica (CAT#00886); DMP-30 - 2,4,6-tris(dimetilamminometil)fenolo (CAT#00553)</td></tr><tr>Scienze di <td>microscopia elettronica</td> <td>glutaraldeide</td><td>16110</td><td>Utilizzato per la preparazione di tessuti per microscopia elettronica (fase 5)</td></tr><tr><td>Hyabak</td><td>Uni&atilde; o Qu&iacute; mica Farmac&ecirc; utica Nacional S/A</td><td>MS-8042140002</td><td>Sodio ialuronato 0,15%</td></tr><tr><td>Icare Tonolab</td><td>Icare Finland Oy</td><td>TV02 (numero di modello)</td><td>Rimbalzo portatile tonometro</td></tr><tr><td>IgG asino anticorpo anti-topo + Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31570</td><td>Soluzione anticorpale secondaria</td></tr><tr><td>Monitor LCD 23 pollici</td><td>Samsung Electronics Co. Ltd.</td><td>S23B550</td><td>Modello LS23B550, per la registrazione dell'elettroretinogramma</td></tr><tr><td>LSM 510 Meta</td><td>Carl Zeiss-Microscopio</td><td></td> <td>confocale per epifluorescenza</td></tr><tr><td>Maxiflox</td><td>Crist&aacute; lia Produtos Qu&iacute; micos Farmac&ecirc; uticos Ltda</td><td>MS-1.0298.0489</td><td>Ciprofloxacina 3,5 mg/g</td></tr><tr><td>MEB-9400K</td><td>Nihon Kohden</td> <td>Corporation-Sistema</td> <td>per la registrazione dell'elettroretinogramma</td></tr><tr><td>monoclonale IgG1 di topo anti-Brn3a</td><td>MilliporeSigma</td><td>MAB-1585</td><td>Brn3a soluzione di anticorpi primari</td></tr><tr><td>Neuropack Manager v08.33</td><td>Nihon Kohden</td> <td>Corporation-Software</td> <td>per l'elaborazione del segnale dell'elettroretinogramma</td></tr><tr><td>Optomotry</td><td>CerebralMeccanica-Sistema</td><td></td> <td>per l'analisi della risposta optomotoria</td></tr><tr><td>Microscopia elettronica Tetrossido di osmio</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>19100</td><td>Utilizzato per la preparazione dei tessuti al microscopio elettronico (fase 5)</td></tr><tr><td>Ferrocianuro di potassio</td><td>Scienze della microscopia elettronica</td><td>20150</td><td>Utilizzato per la preparazione dei tessuti per microscopia elettronica (fase 5)</td></tr><tr><td>Elettrodi di riferimento e di terra per elettroretinografia</td><td>Chalgren Enterprises</td><td>110-63</td><td>Aghi in acciaio inossidabile 0,4 mm e volte; 37 mm Tampone</td></tr><tr><td>di cacodilato di sodio</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>12300</td><td>Utilizzato per la preparazione di tessuti per microscopia elettronica (fase 5)</td></tr><tr><td>Ster MD</td><td>Uni&atilde; o Qu&iacute; mica Farmac&ecirc; utica Nacional S/A</td><td>MS-1.0497.1287</td><td>Acetato di prednisolone 0,12%</td></tr><tr><td>Terolac</td><td>Crist&aacute; lia Produtos Qu&iacute; micos Farmac&ecirc; uticos Ltda</td><td>MS-1.0497.1286</td><td>Ketorolac trometamolo 0,5%</td></tr><tr><td>Terramicina</td><td>Laborat&oacute; rios Pfizer Ltda</td><td>MS-1.0216.0024</td><td>Ossitetraciclina cloridrato 30 mg/g + polimixina B 10.000 U/g</td></tr><tr><td>Tono-Pen XL</td><td>Reichert Technologies</td><td>230635</td><td>Tonometro portatile ad applanazione digitale</td></tr><tr><td>TO-PRO-3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T3605</td><td>Controcolorante nucleare fluorescente rosso lontano; emissione a 661 nm</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9036-19-5</td><td>Tensioattivo non ionico</td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>22400</td><td>Utilizzato per la preparazione di tessuti per microscopia elettronica (fase 5)</td></tr><tr><td>Xilazin</td><td>Syntec do Brasil Ltda</td><td>7899</td><td>Xilazina cloridrato 2%</td></tr><tr><td></td><td>Carl Zeiss-Stereomicroscopio</td><td></td> <td>per chirurgia e dissezione retinica</td></tr></tbody></table>

cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Full-Circle Cauterization of Limbal Vascular Plexus for Surgically Induced Glaucoma in Rodents

Il glaucoma, la seconda causa di cecità in tutto il mondo, è un gruppo eterogeneo di disturbi oculari caratterizzati da danni strutturali al nervo ottico e degenerazione delle cellule gangliari retiniche (RGC), con conseguente disfunzione visiva interrompendo la trasmissione delle informazioni visive dall'occhio al cervello. L'elevata pressione intraoculare è il fattore di rischio più importante; Pertanto, diversi modelli di ipertensione oculare sono stati sviluppati nei roditori con approcci genetici o sperimentali per indagare le cause e gli effetti della malattia. Tra questi, sono stati segnalati alcuni limiti come l'invasività chirurgica, l'inadeguata valutazione funzionale, la necessità di una formazione approfondita e l'estensione altamente variabile del danno retinico. Il presente lavoro caratterizza un metodo semplice, a basso costo ed efficiente per indurre l'ipertensione oculare nei roditori, basato sulla cauterizzazione a bassa temperatura e a cerchio completo del plesso vascolare limbare, una componente importante del drenaggio dell'umore acqueo. Il nuovo modello fornisce un'ipertensione oculare subacuta tecnicamente facile, non invasiva e riproducibile, associata a RGC progressiva e degenerazione del nervo ottico, e un tasso di recupero clinico post-operatorio unico che consente studi funzionali in vivo con metodi sia elettrofisiologici che comportamentali.

Le variabili quantitative sono espresse come media ± errore standard della media (SEM). Fatta eccezione per il confronto delle dinamiche IOP tra OHT e gruppi di controllo (Figura 1F), l'analisi statistica è stata eseguita utilizzando l'ANOVA a due vie seguita dal test di confronto multiplo di Sidak. Un valore p &lt; 0,05 è stato considerato statisticamente significativo.
La Figura 1 illustra le fasi chirurgiche del modello di cauteriz...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di caratterizzare un nuovo modello di neurodegenerazione glaucomatosa basato sulla cauterizzazione termica a 360° del plesso vascolare limbare, inducendo ipertensione oculare subacuta.

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

Glaucoma, the second leading cause of blindness worldwide, is a heterogeneous group of ocular disorders characterized by structural damage to the optic ...

Abbiamo sviluppato un metodo semplice per indurre una degenerazione robusta e progressiva del glaucoma basata sull'aumento temporaneo della pressione intraoculare. Ciò rappresenta un'opportunità unica per studiare i punti chiave della fisiopatologia del glaucoma. Si tratta di un modello di facile apprendimento, non invasivo, a basso costo e altamente riproducibile che consente l'analisi funzionale in vivo e disegni sperimentali a breve termine utilizzando un numero ridotto di animali per ogni esperimento.La retina e il nervo ottico sono parti valutabili del sistema nervoso centrale, quindi modellare la progressiva compromissione di queste strutture può fornire preziose informazioni su altri disturbi neurodegenerativi. Per misurare la pressione intraoculare basale, o IOP, sia degli occhi di controllo sperimentali che controlaterali, posizionare il ratto anestetizzato in una posizione di decubito ventrale sul banco, in modo tale che la superficie corneale sia facilmente accessibile alla punta del tonometro. Posizionare la punta del tonometro in modo che tocchi leggermente perpendicolarmente la zona corneale centrale.Quindi, acquisire la misurazione premendo il pulsante di misurazione

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Il glaucoma è una delle principali cause di cecità nel mondo. Pressione intraoculare elevata è un importante fattore di rischio. Fotocoagulazione laser ipertensione oculare indotta è uno dei modelli animali ben stabilita. Questo video mostra come indurre ipertensione oculare fotocoagulazione con Argon laser nel ratto.

Laser-Induced cronica ipertensione oculare su Ratti modello SD

Fonte: Lani-Louzada, R., et al., Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori. J. Vis. Exp. (2022)Questo video dimostra l'induzione e il monitoraggio di un'elevata pressione intraoculare (IOP) in un modello di ratto. Il processo prevede la cauterizzazione dei vasi sanguigni limbari, con conseguente occlusione dei vasi e IOP elevata. Il ratto viene quindi lasciato riprendersi e la IOP viene regolarmente monitorata sia...

 Induzione di un'elevata pressione intraoculare in un modello di ratto

Fonte: Lani-Louzada, R., et al. Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori. J. Vis. Exp. (2022). Questo video dimostra la quantificazione delle cellule gangliari retiniche da retine di ratto fissate chimicamente e sottoposte a cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare. Il processo include la permeabilizzazione, la colorazione degli anticorpi e la controcolorazione nucleare, seguita dalla visualizzazione...

Quantificazione dei somi a cellule gangliari retiniche a seguito di ipertensione oculare indotta da cauterizzazione 

Ipertensione oculare cronica è indotta mediante fotocoagulazione laser del trabecolato negli occhi del mouse. La pressione intraoculare (IOP) è elevato per diversi mesi dopo il trattamento laser. La diminuzione di acuità visiva e la sensibilità al contrasto di animali da esperimento sono monitorati utilizzando il test optomotor.

Un modello di topo indotta da laser di cronica ipertensione oculare per caratterizzare difetti visivi

Il glaucoma è caratterizzato da danni alle cellule gangliari retiniche. L'induzione del glaucoma in modelli animali può fornire informazioni sullo studio di questa malattia. Qui, descriviamo una procedura che induce la perdita di RGC in un modello di ratto in vivo e dimostra la preparazione di retine a montaggio intero per l'analisi.

Glaucoma inducono Procedura in un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modello di ratto e tutto il montaggio Retina Preparazione

Il seguente articolo fornisce un facile, tecnica riproducibile per creare efficacemente un modello sostenibile del mouse di carenza di cellule staminali limbari (LSCD). Questo modello animale è utile in fase di test e confrontando l'efficacia dei trattamenti per le malattie di cellule staminali del limbus.

Una semplice procedura meccanica per creare Limbal carenza Stem Cell in mouse

Ipertensione oculare cronica è indotta applicando una sutura circumlimbal in ratti e topi, che conduce al deterioramento strutturale e funzionale delle cellule ganglionari retiniche coerente con il glaucoma.

Un modello del Glaucoma indotto da sutura Circumlimbal nei ratti e nei topi

Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per l'occlusione venosa retinica utilizzando il bengala rosa e un sistema di microscopio di imaging retinico guidato dal laser con raccomandazioni per massimizzare la sua riproducibilità in ceppi geneticamente modificati.

Ottimizzazione del modello murino di occlusione venosa retinica per limitare la variabilità

Questo protocollo descrive un metodo per indurre una lesione alcalina corneale e limbare accurata e riproducibile in un modello murino. Il protocollo è vantaggioso in quanto consente una lesione uniformemente distribuita alla cornea e al limbus del topo altamente curvi.

Induzione di lesioni alcaline corneali e limbari utilizzando una tecnica punch-trephine in un modello murino

Questo protocollo descrive la Trabeculoplastica di Tunneling (3T)—un intervento chirurgico per il glaucoma minimamente invasivo che include incisione trabecolare, dilatazione del canale di Schlemm (SC) e impianto di suture a tensione per ripristinare il flusso acquoso fisiologico—accompagnato da una serie di casi non comparativa.

Trabeculoplastica per tunneling (3T): Un protocollo chirurgico passo dopo passo per il glaucoma primario ad angolo aperto

Scopri un modello di glaucoma indotto mediante cauterizzazione a 360° del plesso vascolare limbare nei ratti. Questo metodo non invasivo e riproducibile consente di studiare la neurodegenerazione retinica e del nervo ottico in vivo.

Cauterizzazione a cerchio completo del plesso vascolare limbare per il glaucoma indotto chirurgicamente nei roditori

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