Name: Isolamento e screening dalla biodiversità del suolo per i funghi coinvolti nella degradazione dei materiali recalcitranti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Scopri un protocollo per isolare funghi dal suolo in grado di degradare idrocarburi e plastiche. Questo metodo di screening a basso costo identifica ceppi con potenziale biorimedio per la bonifica ambientale.

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Riconosciamo la Scuola di Alta Formazione Dottorale (SAFD) dell'Università di Pavia e il professor Solveig Tosi per aver fornito l'opportunità di questo lavoro.

1. Selezione di ceppi fungini in grado di degradare materiali recalcitranti dal suolo
<ol><li>Preparazione della soluzione antibiotica.<ol>
<li>Mettere penicillina (50 mg / L), streptomicina (40 mg / L), clorttraciclina (40 mg / L), neomicina (100 mg / L) e cloramfenicolo (100 mg / L) in 250 ml di acqua sterile deionizzata.</li>
		<li>Prima di aggiungere cloramfenicolo alla soluzione antibiotica, scioglierlo in 3 ml di etanolo ≥99%.</li>
		<li>Posizionare la soluzione antibiotica su un agitatore magnetico (senza calore) con una barra di agitazione magnetica all'interno della soluzione per 10 minuti. Conservare a 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione dei mezzi di crescita.<ol>
<li>Mettere 1 g di acido umico commerciale, 3,26 g di brodo Bushnell-Haas (BH) e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclave per 20 minuti a 121 °C (agar acido umico).</li>
		<li>Placcare l'acido umico agar in piastre di Petri sotto un armadio a flusso laminare.</li>
		<li>Mettere 4 g di lignocellulosa, 3,26 g di BH e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e metterlo in autoclave per 20 minuti a 121 °C (lignocellulosa agar).</li>
		<li>Impiattare l'agar lignocellulosa in piastre di Petri sotto un armadio a flusso laminare.</li>
		<li>Sotto un armadio a flusso laminare, dopo che i fluidi si sono solidificati nelle piastre di Petri, trasferire 1 mL della soluzione antibiotica sulle piastre preparate utilizzando una siringa sterile con un filtro da 0,2 μm per sterilizzarla.</li>
		<li>Distribuire uniformemente la soluzione antibiotica sulle superfici della piastra utilizzando uno spandicellulare sterile monouso a forma di L e lasciarla asciugare all'aria sotto l'armadio a flusso laminare.</li>
		<li>Mettere 20 g di brodo di estratto di malto e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclave per 20 minuti a 121 °C (estratto di malto agar - MEA).</li>
		<li>Placcare il MEA in piastre di Petri sotto un armadio a flusso laminare.</li>
	</ol></li>
	<li>Campionamento del suolo e diluizioni del suolo.<ol>
<li>Campionare il terreno di interesse a una profondità di 10 cm, rimuovendo eventuali piante, erba e foglie morte dallo strato superiore e metterlo in sacchetti di polietilene sterili.</li>
		<li>Dopo aver raggiunto il laboratorio, setacciare il terreno utilizzando una rete di 2 mm, rimuovendo eventuali radici e detriti vegetali.</li>
		<li>Se non è possibile procedere immediatamente con l'analisi a valle, conservare i campioni di terreno setacciati a 4 °C.</li>
		<li>Lavorando sotto un armadio a flusso laminare, mettere 1 g di terreno setacciato in un tubo sterile da 15 ml con 10 ml di acqua deionizzata sterile (1 x 10-1 diluizione). Agitare il tubo orizzontalmente per 30 minuti.</li>
		<li>Sotto un armadio a flusso laminare, prima che la sospensione si depositi, prendere 1 mL della diluizione 1 x 10-1 con una pipetta sterile e trasferirla in un bianco di acqua deionizzata da 9 ml (1 x 10-2 diluizione). Vortice a fondo.</li>
		<li>Prima che la sospensione si depositi, prendere 1 mL della diluizione 1 x 10-2 con una pipetta sterile e trasferirla in un bianco di 9 mL di acqua deionizzata (1 x 10-3 diluizione). Vortice a fondo.</li>
	</ol></li>
	<li>Diluizioni del terreno di placcatura su mezzi selettivi.<ol>
<li>Lavorando sotto un armadio a flusso laminare, raccogliere 100 μL della diluizione 1 x 10-3 usando una micropipetta con un punto sterile e trasferirla su una capsula di Petri di agar umico. Fallo per almeno 4 o 5 piastre di Petri.</li>
		<li>Distribuire uniformemente la diluizione sulla superficie della capsula di Petri utilizzando uno spandicellulare sterile monouso a forma di L.</li>
		<li>Lasciare asciugare all'aria per 10-15 minuti sotto l'armadio a flusso laminare.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 1.4.1.-1.4.3. utilizzando piastre di Petri di lignocellulosa.</li>
		<li>Incubare a 25 °C al buio per un massimo di 15 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolamento di colonie fungine cresciute da mezzi selettivi a mezzi di crescita.<ol>
<li>A partire da 3 giorni dopo la preparazione, controllare quotidianamente le piastre di Petri selettive preparate per qualsiasi crescita di colonie fungine per un massimo di 15 giorni.</li>
		<li>Controlla tutte le colonie fungine presenti per somiglianze. Se necessario, preparare un vetrino da osservare al microscopio ottico. NOTA: L'obiettivo è quello di isolare il maggior numero di colonie fungine, ma è necessario evitare di isolare sempre lo stesso ceppo fungino da piastre diverse, quindi questo controllo è molto importante. Cerca colonie con diverse macro e micromorfologiche.</li>
		<li>Sotto un armadio a flusso laminare o in un bruciatore Bunsen, isolare ogni ceppo fungino scelto rimuovendo delicatamente una piccola parte del micelio dalla colonia con un ago di inoculazione sterile e trasferendolo in una nuova capsula di Petri MEA. NOTA: In questa fase, è molto importante essere delicati e precisi perché c'è un alto rischio di contaminazione dalle altre colonie fungine presenti nella capsula di Petri originale. Se sulla piastra MEA inoculata cresce più di un ceppo fungino, ripetere il passaggio 1.5.3.</li>
		<li>Incubare a 25 °C al buio per 7 giorni. Questi sono i ceppi fungini da testare ulteriormente su specifiche sostanze recalcitranti.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Test di crescita su sostanze recalcitranti
<ol><li>Test di crescita sul petrolato.<ol>
<li>Trasferire 20 mL di BH liquido (3,26 g/L di BH) in flaconcini da 50 mL e sterilizzarli in autoclave a 121 °C per 20 min.</li>
		<li>Trasferire 7 mL di acqua deionizzata in flaconcini di vetro da 15 mL e aggiungere alcuni pezzi di coperchi di vetro rotti in ogni flaconcino.</li>
		<li>Sterilizzarli in autoclave a 121 °C per 20 min.</li>
		<li>Sotto l'armadio a flusso laminare, aggiungere 1 mL di petrolato a ogni flaconcino da 50 mL bh utilizzando una pipetta sterile. Conservare alcuni flaconcini con solo BH come controllo negativo.</li>
		<li>Sotto l'armadio a flusso laminare, rimuovere il micelio sulla superficie del mezzo dalle piastre MEA con i ceppi fungini scelti (preparati al punto 1.5.3.) utilizzando un ago sterile e trasferirlo in flaconcini di vetro da 15 ml con le coperture rotte.</li>
		<li>Agitare ogni fiala su un miscelatore a vortice per 2 minuti, consentendo alle coperture rotte di tagliare il cubo della colonia fungina, creando una sospensione fungina.</li>
		<li>Inoculare ogni flaconcino di petrolato con 200 μL di sospensione fungina. Fai due repliche per ogni ceppo fungino.</li>
		<li>Per il controllo negativo, mettere 200 μL di sospensione fungina in flaconcini con solo BH liquido. Inoltre, tenere un paio di flaconcini con petrolato senza alcuna inoculazione fungina per verificare la contaminazione nel mezzo.</li>
		<li>Incubare i flaconcini a 25 °C al buio e controllarli dopo 15 giorni e 30 giorni dall'inoculo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test di crescita su olio motore usato.<ol>
<li>Mettere 3,26 g di BH e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclave per 20 minuti a 121 °C (BHA).</li>
		<li>Placcare il BHA in piastre di Petri sotto un armadio a flusso laminare.</li>
		<li>Una volta solidificato, trasferire 500 μL di olio motore usato sulle piastre di Bha Petri e distribuirlo uniformemente sulle superfici delle piastre utilizzando uno spandicellulare sterile monouso a forma di L.</li>
		<li>Inoculare ogni piastra BHA dell'olio motore usata con ogni ceppo fungino, raccogliendo il micelio dalle piastre preparate al punto 1.5.3. Lavora su un bruciatore Bunsen o sotto una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni. Fai due repliche per ogni ceppo fungino.</li>
		<li>Per il controllo negativo, inoculare le piastre di Petri solo con BHA. Inoltre, tenere un paio di piastre BHA Petri di olio motore usate senza alcuna inoculazione fungina per verificare la contaminazione nel mezzo.</li>
		<li>Incubare le piastre di Petri a 25 °C al buio e controllarle dopo 15 giorni e 30 giorni dall'inoculo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Test di crescita su materie plastiche.<ol>
<li>Trasferire 200 μL di sospensione fungina (fasi 2.1.5.-2.1.6.) in una piastra a 96 micro pozzetti. Fai tre repliche della combinazione ceppo-plastica fungina.</li>
		<li>A ciascun pozzetto con la sospensione fungina, aggiungere 10 mg di un diverso tipo di polvere plastica (polietilene tereftalato - PET, cloruro di polivinile - PVC, polietilene ad alta densità - HDPE, polistirene - PS, poliuretano - PUR).</li>
		<li>Per il controllo negativo, invece di aggiungere la polvere di plastica, aggiungere 200 μL di soluzione di BH sterilizzata al pozzo con la sospensione fungina. Inoltre, per ogni tipo di polvere plastica, riempire un pozzetto con 200 μL di soluzione di BH sterilizzata e 10 mg di ogni polvere di plastica per verificare la contaminazione del mezzo.</li>
		<li>Incubare le piastre del microwell a 25 °C al buio e controllarle dopo 15 giorni e 30 giorni dall'inoculo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Test enzimatici qualitativi
<ol><li>Test colorimetrico qualitativo degli enzimi ligninolitici.<ol>
<li>Mettere 27 g di brodo di destrosio di patate (PD) e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclavelo per 20 minuti a 121 °C (PDA).</li>
		<li>Quando il mezzo si è raffreddato un po' ma è ancora liquido, aggiungere acido gallico (5 g/L) sotto una cappa a flusso laminare e placcare il mezzo in piastre di Petri.</li>
		<li>Inoculare le piastre di acido gallico PDA + con ogni ceppo fungino, raccogliendo il micelio dalle piastre preparate al punto 1.5.3. Lavora su un bruciatore Bunsen o sotto una cappa a flusso laminare per evitare contaminazioni.</li>
		<li>Come controlli negativi, preparare le piastre di Petri con solo PDA (senza acido gallico) e inocularle con i ceppi fungini (uno per ogni ceppo fungino), così come una capsula di Petri con PDA + acido gallico e nessuna inoculazione fungina.</li>
		<li>Incubare le piastre di Petri a 25 °C al buio e controllarle dopo 7 giorni dall'inoculo.</li>
	</ol></li>
	<li>Test colorimetrico qualitativo delle laccasi.<ol>
<li>Mettere 27 g di PD e 15 g di agar in 1 L di acqua deionizzata e autoclave per 20 minuti a 121 °C (PDA).</li>
		<li>Quando il mezzo si è raffreddato un po'ma è ancora liquido, aggiungere guaiacolo (400 μL/L) sotto una cappa a flusso laminare e inserirlo in piastre di Petri.</li>
		<li>Inoculare le piastre PDA + guaiacolo con ogni ceppo fungino, raccogliendo il micelio dalle piastre preparate al punto 1.5.3. Lavora in un bruciatore Bunsen o sotto una cappa a flusso laminare per evitare qualsiasi contaminazione.</li>
		<li>Come controlli negativi, preparare le piastre di Petri con solo PDA (senza guaiacolo) E inocularle con i ceppi fungini (uno per ogni ceppo fungino), così come una capsula di Petri con PDA + guaiacolo e nessuna inoculazione fungina.</li>
		<li>Incubare le piastre di Petri a 25 °C al buio e controllarle dopo 7 giorni dall'inoculo.</li>
	</ol></li>
	<li>Test qualitativo delle proteasi.<ol>
<li>Preparare il mezzo YES aggiungendo K2HPO4 (1 g/L) , KH2PO4 (0,5 g/L), MgSO4·7H2O (0,5 g/L), MnCl2·4H2O (0,001 g/L), CuCl2·2H2O (1,4 x 10-5 g/L), ZnCl2 (1,1 x 10-5 g/L), CoCl2·6H2O (2 x 10-5 g/L), Na2MoO4·2H2O (1,3 x 10-5 g/L), FeCl3·6H2O (7,5 x 10-5 g/L) e gelatina/peptone (0,02 g/L) in acqua deionizzata.</li>
		<li>Posizionare il mezzo YES su un agitatore magnetico (senza calore) con una barra di agitazione magnetica all'interno del mezzo per 10 minuti.</li>
		<li>Quando tutti i sali si sono sciolti nel mezzo, trasferire 5 mL della soluzione in flaconcini di vetro sterili da 20 mL e metterli in autoclave per 20 minuti a 121 °C.</li>
		<li>Per il controllo negativo, preparare circa 20 mL di flaconcini di vetro sterile con 5 mL di soluzione di BH e metterli in autoclave per 20 minuti a 121 °C.</li>
		<li>Sotto un armadio a flusso laminare, trasferire 200 μL di sospensione fungina (Fasi 2.1.5.-2.1.6.) per ciascun ceppo ai flaconcini sterilizzati del mezzo YES (effettuare almeno 2 repliche per ceppo fungino). Per ogni ceppo fungino, aggiungere 200 μL della stessa sospensione fungina ai flaconcini sterilizzati BH per avere un controllo negativo.</li>
		<li>Incubare i flaconcini a 25 °C al buio per 21 giorni e controllarli ogni 7 giorni.</li>
	</ol></li>
	<li>Test qualitativo delle esterasi.<ol>
<li>Preparare il mezzo Tween 80 aggiungendo peptone (10 g/L), NaCl (5 g/L), CaCl2 (0,1 g/L) e 10 ml di Tween 80 a 1 L di acqua deionizzata.</li>
		<li>Posizionare il mezzo Tween 80 su un agitatore magnetico (senza calore) con una barra di agitazione magnetica all'interno del mezzo per 10 minuti.</li>
		<li>Quando tutto è fuso all'interno del mezzo, trasferire 5 mL della soluzione in flaconcini di vetro sterili da 20 mL e metterli in autoclave per 20 minuti a 121 °C.</li>
		<li>Per il controllo negativo, preparare circa 20 mL di flaconcini di vetro sterile con 5 mL di soluzione di BH e metterli in autoclave per 20 minuti a 121 °C.</li>
		<li>Sotto un armadio a flusso laminare, trasferire 200 μL di sospensione fungina (Fasi 2.1.5.-2.1.6.) per ogni ceppo ai flaconcini sterilizzati medi Tween 80 (effettuare almeno 2 repliche per ceppo fungino). Per ogni ceppo fungino, aggiungere 200 μL della stessa sospensione fungina ai flaconcini sterilizzati BH per il controllo negativo.</li>
		<li>Incubare i flaconcini a 25 °C al buio per 21 giorni e controllarli ogni 7 giorni.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La ricca biodiversità del suolo è una fonte abbondante di funghi che possiedono numerose capacità metaboliche, alcune delle quali potrebbero essere potenziali candidati per il biorisanamento. I test selettivi sui fluidi (Sezione 1 del protocollo) sono metodi facili da eseguire ed efficaci per isolare funghi in grado di crescere su polimeri complessi naturali come unica fonte di carbonio. I funghi possono produrre idrolasi extracellulari, non specifiche e ossidoreduttasi30 come gli enzimi ligninoli...

Il suolo è una componente fondamentale della vita sulla Terra ed è alla base di molti ecosistemi. I minerali, la materia organica e i microrganismi nel suolo possono essere considerati come un unico sistema, con strette associazioni e interazioni che si verificano tra di loro. Le interazioni di questi composti hanno un impatto importante sui processi terrestri, sulla qualità ambientale e sulla salute dell'ecosistema1. L'inquinamento del suolo pone seri problemi ambientali in tutto il mondo. L'applicazione indiscriminata, a lungo termine ed eccessiva di sostanze recalcitranti e tossiche, come pesticidi, prodotti petroliferi, plastica e altre sostanze chimiche, ha gravi effetti sull'ecologia del suolo e, di conseguenza, può alterare il microbiota del suolo. Le comunità microbiche nei suoli sono composte da una vasta gamma di organismi in diversi stati fisiologici, la maggior parte dei quali sono batteri e funghi. Molti dei contaminanti nei suoli hanno stabilità a medio-lungo termine e la loro persistenza può portare allo sviluppo di meccanismi adattivi che consentono ai microrganismi di utilizzare sostanze recalcitranti come nutrienti 2,3. Questi microrganismi possono, quindi, essere considerati per le tecniche di biorisanamento.
Il biorisanamento cerca di mitigare gli effetti dell'inquinamento utilizzando microrganismi e i loro enzimi per la degradazione o la trasformazione dei rifiuti in composti meno tossici o non tossici. Varie specie di archaea, batteri, alghe e funghi possiedono questa capacità di biorisanamento4. Come risultato delle loro particolari azioni biodegradative, i funghi sono organismi particolarmente promettenti per il biorisanamento. Possono attaccare diversi substrati usando la loro rete ifale, consentendo loro di penetrare nella matrice del suolo in modo più efficiente rispetto ad altri microrganismi. Inoltre, possono raggiungere interstizi inaccessibili in cui i contaminanti sono difficili da rimuovere5 e possono anche sopravvivere a bassi livelli di umidità6. Inoltre, i funghi sintetizzano diverse cassette di enzimi non specifici, di solito per degradare sostanze recalcitranti naturali come cellulosa, lignina e acidi umici. Quelli che mancano del substrato bersaglio possono essere coinvolti nella degradazione di una vasta gamma di inquinanti recalcitranti, come idrocarburi, plastica e pesticidi 7,8,9,10. Pertanto, sebbene molte specie fungine siano già state segnalate come agenti di biorisanamento, vi è un crescente interesse nell'esplorazione di specie che non sono ancora state studiate per selezionare candidati per il biorisanamento di sostanze contaminanti recalcitranti. Le specie già note per avere proprietà di biorisanamento appartengono ai phyla Ascomycota 11,12,13, Basidiomycota14,15 e Mucoromycota. Ad esempio, i generi Penicillium e Aspergillus sono ben noti per essere coinvolti nella degradazione degli idrocarburi alifatici13, diversi polimeri plastici 16,17,18, metalli pesanti 19 e coloranti20. Allo stesso modo, studi condotti su funghi basidiomiceti, come Phanerochaete chrysosporium e Trametes versicolor, hanno rivelato il loro coinvolgimento nell'ossidazione di materiali recalcitranti come gli idrocarburi aromatici13 e le plastiche21. Un altro esempio di funghi coinvolti nei processi di biodegradazione sono gli zigomiceti Rhizopus spp., Mucor spp. e Cunninghamella spp.22,23. In particolare, Cunninghamella è in grado di ossidare idrocarburi aromatici ed è considerata un organismo modello per lo studio della disintossicazione di prodotti da una vasta gamma di xenobiotici13.
Ci sono diversi enzimi fungini coinvolti nei principali processi degradativi dei materiali recalcitranti 24,25, come esterasi, laccasi, perossidasi e proteasi. Le laccasi sono ossidasi contenenti rame prodotte nella cellula e successivamente secrete, che permettono l'ossidazione di una varietà di composti fenolici e aromatici. Possono degradare orto e parafenoli, i fenoli contenenti gruppi amminici, la lignina e le diammine contenenti il gruppo arilico26. Le perossidasi utilizzano il perossido di idrogeno come mediatore per degradare la lignina e altri composti aromatici. Ci sono molte perossidasi diverse, ma quelle con il maggior potenziale di degradare le sostanze tossiche sono la lignina perossidasi e la perossidasi di manganese27.
Le esterasi e le proteasi appartengono al gruppo degli enzimi extra- o ecto-cellulari, che agiscono al di fuori delle loro cellule di origine ma sono ancora legati ad esse. Questi enzimi possono catalizzare l'idrolisi di grandi molecole recalcitranti in quelle più piccole. A causa della loro bassa specificità del substrato, questi enzimi possono svolgere un ruolo chiave nel biorisanamento di vari inquinanti, come coloranti tessili, effluenti rilasciati dalle industrie della cellulosa e della carta e concia della pelle, prodotti petroliferi, materie plastiche e pesticidi 28,29,30.
Sono già stati pubblicati numerosi metodi di screening per selezionare ceppi fungini biorisanativi. Ad esempio, il mezzo di agar a base di paglia è stato utilizzato per lo screening di funghi di marciume bianco ad alto potenziale nella degradazione degli idrocarburi policiclici aromatici (IPA)31; e piccoli pezzi di legno in decomposizione sono stati posti su agar estratto di malto (MEA) per isolare i funghi in decomposizionedel legno 32. Tuttavia, la maggior parte dei metodi che sono già stati proposti selezionano funghi molto specifici per la loro attività di interesse. Questa ricerca propone un approccio più ampio per la selezione dei funghi del suolo con un più ampio raggio d'azione. Il metodo si basa sulla placcatura iniziale di diluizioni seriali di campioni di terreno su un mezzo modificato con acidi umici o lignocellulosa mescolati con antibiotici per selezionare funghi con la capacità di degradare queste sostanze recalcitranti naturali. Gli acidi umici e la lignocellulosa, infatti, sono sostanze estremamente resistenti alla biodegradazione poiché hanno strutture molecolari molto complesse, e questo permette loro di essere ottimi indicatori della capacità degradativa dei funghi testati33,34. Successivamente, i funghi selezionati nei primi test vengono sottoposti a screening per identificare quelli con il potenziale di degradare inquinanti specifici come petrolato, olio motore usato e plastica. Infine, vengono eseguiti test enzimatici qualitativi per rilevare ceppi fungini in grado di produrre enzimi coinvolti nei processi di biodegradazione di sostanze recalcitranti. A tale scopo vengono condotti test di proteasi e esterasi, mentre l'acido gallico e il guaiacolo sono utilizzati come indicatori della produzione di laccasi e di altri enzimi ligninolitici35,36. Questi substrati sono utilizzati perché è stata trovata una forte correlazione tra la capacità dei funghi di ossidarli alla loro forma di colore marrone e il possesso di capacità ligninolitica 37,38,39.
Attraverso questi protocolli, è possibile isolare ceppi fungini ad alto potenziale degradativo e un ampio spettro di azione direttamente da campioni di suolo. L'isolamento di questi ceppi fungini potrebbe aiutare a trovare nuovi candidati per scopi di biorisanamento.

<table><tbody><tr><td>Piastra a 96 micropozzetti</td><td>Greiner bio-one</td><td>650185</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>VWR</td><td>84609.05</td><td></td></tr><tr><td>Brodo Bushnell-Haas</td><td>Fluka</td><td>B5051</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Cloroamfenicolo</td><td>Eurobio</td><td>GABCRL006Z</td><td></td></tr><tr><td>Clortetraciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>Y0001451</tr><tr><td>CoCl2&middot; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8661</td><td></td></tr><tr><td>CuCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3279</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>VWR Chemicals</td><td>20821.296</td><td></td></tr><tr><td>FeCl3&middot; 6H2O Filtro</td><td>236489</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td></tr><tr><td>0,2 &micro; m</td><td>Whatman</td><td>10462200</td><td></td></tr><tr><td>acido gallico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7384</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetto</td><td>Biosigma</td><td>VBS634</td><td></td></tr><tr><td>Fiale di vetro 15 mL</td><td>SciLabware</td><td>P35467</td><td></td></tr><tr><td>guaiacolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5502</td><td></td></tr><tr><td>Polietilene ad alta densità (HDPE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>434272</td><td></td></tr><tr><td>Acidi umici</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>53680</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Lignocellulosa</td><td>/</td><td>/</td><td>Scarto di produzione di bioetanolo sterilizzato</td></tr><tr><td>Spandiconcime cellulare a forma di L</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21133</td><td></td></tr><tr><td>agitatore magnetico</td><td>A.C.E.F</td><td>8235</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di estratto di malto</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70146</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta 1000 &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>Micropipetta 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>MnCl2&middot; 4H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5005</td><td></td></tr><tr><td>Na2MoO4&middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1651</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>Neomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0401000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1504489</td><td></td></tr><tr><td>peptone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83059</td><td></td></tr><tr><td>Polietilene tereftalato (PET)</td><td>Goodfellow</td><td>ES306031</td><td></td></tr><tr><td>Piastre Petri</td><td>Laboindustria S.p.a</td><td>21050</td><td></td></tr><tr><td>Petrolato (Paraffina liquida)</td><td>A.C.E.F</td><td></td><td></td></tr> 009661 <tr><td>Brodo di Destrosio di Patate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6685</td><td></td></tr><tr><td>Polistirene (PS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>331651</td><td></td></tr><tr><td>Poliuretano (PUR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GF20677923</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di polivinile ( PVC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81388</td><td></td></tr><tr><td>Provetta sterile per falco</td><td>Greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>Fiale sterili in vetro 20 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SU860051</td><td></td></tr><tr><td>Punto sterile 1000&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172511</td><td></td></tr><tr><td>Punto sterile 200&nbsp; &mu; L</td><td>Gilson</td><td>F172311</td><td></td></tr><tr><td>Sacchetti sterili in polietilene</td><td>WHIRL-PAK</td><td>B01018</td><td></td></tr><tr><td>siringa sterile</td><td>Raggi</td><td>5523CM25</td><td></td></tr><tr><td>Streptomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-6501</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Olio motore usato</td><td>/</td><td>/</td><td>miscela complessa di idrocarburi, additivi per motori e metalli, fornita da una società privata italiana</td></tr><tr><td>Fiale 50 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33108-U</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z0152</td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e screening dalla biodiversità del suolo per i funghi coinvolti nella degradazione dei materiali recalcitranti

Isolation and Screening from Soil Biodiversity for Fungi Involved in the Degradation of Recalcitrant Materials

L'inquinamento ambientale è un problema crescente e l'identificazione dei funghi coinvolti nel processo di biorisanamento è un compito essenziale. Il suolo ospita un'incredibile diversità di vita microbica e può essere una buona fonte di questi funghi biorisanativi. Questo lavoro mira a cercare funghi del suolo con potenziale di biorisanamento utilizzando diversi test di screening. I terreni di coltura minerale integrati con sostanze recalcitranti come unica fonte di carbonio sono stati utilizzati come test di crescita. In primo luogo, le diluizioni del suolo sono state placcate su piastre di Petri con mezzo minerale modificato con acidi umici o lignocellulosa. Le colonie fungine in crescita sono state isolate e testate su diversi substrati, come miscele complesse di idrocarburi (petrolato e olio motore usato) e polveri di diversi polimeri plastici (PET, PP, PS, PUR, PVC). Test enzimatici qualitativi sono stati associati ai test di crescita per studiare la produzione di esterasi, laccasi, perossidasi e proteasi. Questi enzimi sono coinvolti nei principali processi di degradazione del materiale recalcitrante e la loro secrezione costitutiva da parte dei ceppi fungini esaminati potrebbe avere il potenziale per essere sfruttata per il biorisanamento. Più di 100 ceppi sono stati isolati e testati e sono stati trovati diversi isolati con un buon potenziale di biorisanamento. In conclusione, i test di screening descritti sono un metodo semplice e a basso costo per identificare ceppi fungini con potenziale di biorisanamento dal suolo. Inoltre, è possibile personalizzare i test di screening per diversi inquinanti, in base alle esigenze, aggiungendo altre sostanze recalcitranti a terreni di coltura minimi.

I metodi di media selettivi (Sezione 1 del protocollo) hanno permesso di vagliare la ricca biodiversità del suolo e di selezionare i funghi con un elevato potenziale di biorisanamento. Con l'acido umico e la lignocellulosa, sono stati isolati più di 100 ceppi fungini. Questi funghi hanno prodotto enzimi coinvolti nella biodegradazione di materiali recalcitranti naturali, che hanno una struttura chimica simile a molti inquinanti. Tuttavia, i ceppi fungini isolati con i mezzi selettivi necessitavano di un ulteriore screeni...

Qui, presentiamo un protocollo per lo screening della biodiversità del suolo per cercare ceppi fungini coinvolti nella degradazione di materiali recalcitranti. In primo luogo, i ceppi fungini in grado di crescere su acidi umici o lignocellulosa sono isolati. La loro attività viene poi testata sia in saggi enzimatici che su inquinanti come idrocarburi e plastiche.

Isolamento e screening dalla biodiversità del suolo per i funghi coinvolti nella degradazione dei materiali recalcitranti

Environmental pollution is an increasing problem, and identifying fungi involved in the bioremediation process is an essential task. Soil hosts an ...

Questo protocollo è significativo perché isola ceppi fungini ad alto potenziale degradativo direttamente da campioni di suolo da considerare come candidati a fini di biorisanamento. Questo protocollo è uno screening a basso costo per trovare funghi con potenziale di biorisanamento. Inoltre, dà risultati facili da interpretare.Poiché questa tecnica prevede la manipolazione di microrganismi, è molto importante lavorare in sterilità utilizzando un armadio a flusso laminare o un bruciatore Bunsen per evitare la contaminazione. Per iniziare, campionare il terreno di interesse e setacciare il terreno utilizzando una rete di due millimetri per rimuovere eventuali radici e detriti vegetali. Sotto un armadio a flusso laminare, aggiungere un grammo di terreno setacciato in un tubo sterile da 15 millilitri.Quindi, aggiungere 10 millilitri di acqua deionizzata sterile per fare una diluizione da 10 a meno uno. Agitare il tubo orizzontalmente per 30 minuti. Prima che la sospensione si stabilizzi, prendere un millilitro di 10 alla diluizione meno uno con una pipetta sterile e trasferirlo in un bianco di nove millilitri di acqua deionizzata per fare 10 alla diluizione meno due.Vortice la sospensione a fondo. Allo stesso modo, fai una diluizione da 10 a meno tre da un tubo di diluizione 10 a meno due. Per la placcatura delle diluizioni del terreno su mezzi selettivi, raccogliere 100 microlitri della diluizione da 10 a meno tre usando una micropipetta con un punto sterile e trasferirla su una capsula di Petri di agar umico.Distribuire uniformemente la diluizione sulla superficie del piatto utilizzando uno spandicellulare sterile, monouso, a forma di L. Prepara da quattro a cinque di questi piatti. Allo stesso modo, preparare piatti di lignocellulosa da un tubo di diluizione 10 a meno tre.Lasciare asciugare i piatti all'aria per 10-15 minuti prima di incubare a 25 gradi Celsius al buio per 15 giorni. Controlla tutte le colonie fungine presenti per somiglianze. Se necessario, preparare un vetrino da osservare al microscopio ottico.Sotto un armadio a flusso laminare o in un bruciatore Bunsen, isolare ogni ceppo fungino scelto rimuovendo delicatamente una piccola parte del micelio dalla colonia con un ago di inoculazione sterile. Trasferire la colonia isolata in un nuovo piatto di estratto di malto agar o MEA. Trasferire 20 millilitri di Bushnell Haas, o mezzo BH, in flaconcini di vetro da 50 millilitri.Trasferire sette millilitri di acqua deionizzata in flaconcini da 15 millilitri e aggiungere pezzi di coperchio di vetro rotto in ogni flaconcino. Sterilizzare i flaconcini in autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti. Per testare la crescita sul petrolato, aggiungere un millilitro di petrolato a ogni flaconcino bh da 50 millilitri utilizzando una pipetta sterile sotto l'armadio a flusso laminare.Conservare alcuni flaconcini con solo BH come controllo negativo. Rimuovere il micelio sulla superficie del mezzo dalla piastra MEA con il ceppo fungino scelto utilizzando un ago sterile e trasferirlo in un flaconcino di vetro da 15 millilitri con il coperchio rotto scivola. Agitare la fiala su un miscelatore a vortice per due minuti, lasciando scivolare il coperchio rotto per tagliare il cubo della colonia fungina, facendo una sospensione.Inoculare ogni flaconcino di petrolato con sospensione da 200 microlitri. Fai due repliche per ogni ceppo fungino. Per il controllo negativo, aggiungere 200 microlitri di sospensione fungina nel flaconcino contenente solo il mezzo BH.Inoltre, tenere il flaconcino con petrolato senza alcuna inoculazione fungina per verificare la presenza di contaminazione nel mezzo. Incubare le fiale a 25 gradi Celsius al buio e osservarle dopo 15 e 30 giorni dall'inoculo. Per testare la crescita sull'olio motore usato, trasferire 500 microlitri di olio motore usato sulla capsula di Petri BHA e distribuire l'olio in modo uniforme.Quindi, inoculare la piastra con ceppo fungino raccogliendo il micelio dalle piastre MEA. Per testare la crescita sulle materie plastiche, trasferire 200 microlitri di sospensione fungina in una piastra a 96 micro pozzetti. Fai tre repliche della combinazione ceppo-plastica fungina.Aggiungere 10 milligrammi di una polvere di plastica diversa a ciascun pozzetto con la sospensione fungina. Per il controllo negativo, aggiungere 200 microlitri di mezzo BH al pozzo con la sospensione fungina. Inoltre, per ogni polvere di plastica, riempire un pozzo con 200 microlitri di soluzione bh e 10 milligrammi di ogni polvere di plastica per verificare la contaminazione.Incubare le piastre a 25 gradi Celsius al buio e osservarle dopo 15 e 30 giorni. Per il test calorimetrico qualitativo delle laccasi, preparare un litro di agar destrosio di patate, o PDA, e l'autoclave per 20 minuti. Dopo l'autoclave, quando il mezzo si è raffreddato ma è ancora liquido, aggiungere 400 microlitri di guaiacolo sotto una cappa a flusso laminare e inserirlo in piastre di Petri.Inoculare la piastra di guaiacolo PDA con ceppo fungino raccogliendo il micelio dalla piastra MEA. Per i controlli negativi, preparare piastre PDA con ogni ceppo fungino e una piastra con PDA e guaiacolo. Incubare le piastre a 25 gradi Celsius al buio e osservarle dopo sette giorni.Per il test qualitativo delle esterasi, preparare un litro di Tween 80 medium. Quindi, posizionare il mezzo su un agitatore magnetico senza riscaldare con una barra di agitazione all'interno del mezzo. Dopo 10 minuti, quando tutto è fuso, trasferire cinque millilitri del mezzo in fiale sterili da 20 millilitri e autoclave.Aggiungere 200 microlitri di sospensione fungina al flaconcino sterilizzato medio Tween 80. Per il controllo negativo, aggiungere cinque millilitri di mezzo BH autoclavato in un flaconcino da 20 millilitri. Quindi, aggiungere 200 microlitri di sospensione fungina alla fiala.Incubare le fiale a 25 gradi Celsius al buio per 21 giorni e osservarle ogni sette giorni. È stata valutata la percentuale di ceppi fungini in grado di crescere su petrolato, olio motore usato e polveri di plastica come unica fonte di carbonio con diversi gradi di successo. La capacità dei funghi di sfruttare il petrolato è stata valutata come la differenza nella crescita della colonia tra BH controllato e contenente petrolato.Quasi il 75% dei ceppi testati è stato in grado di utilizzare il petrolato come unica fonte di carbonio e il 21% ha mostrato la massima crescita. È stata monitorata anche la crescita per le piastre contenenti solo BHA e in presenza di olio motore. Quasi il 90% dei ceppi è cresciuto con olio motore usato, con il 39% che ha mostrato la massima crescita.La formazione di un alone rosso-brunastro intorno alla colonia fungina ha indicato una maggiore produzione di laccasi e altri enzimi ligninolitici. Circa il 60% dei funghi era in grado di produrre laccasi. Inoltre, il 17% dei ceppi ha prodotto un intenso alone scuro intorno alla colonia nel mezzo guaiacolo.L'attività delle esterasi è stata valutata mediante la formazione di un precipitato bianco nel mezzo Tween 80. Quasi il 60% dei ceppi ha mostrato attività esterasi e il 13% ha dimostrato una maggiore formazione di precipitati. Questo protocollo può essere adattato per lo screening di funghi in grado di degradare qualsiasi inquinante aggiungendo la sostanza recalcitrante di interesse a un terreno di coltura minimo.

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Biologia

Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospezione di ceppi microbici per la biorimediazione e lo sviluppo di probiotici per la ricerca e la conservazione dei metaorganismi. J. Vis. Esp. (2019).Questo video dimostra l'isolamento dei batteri marini che degradano gli inquinanti tramite diluizione seriale, selezione delle colonie e crescita in un mezzo contenente EE2. Utilizzando EE2 come unica fonte di carbonio, il protocollo identifica ceppi batterici in grado di metabolizzare questo inquinante...

Screening dei batteri marini per l'isolamento di ceppi degradanti di inquinanti

Pellicole in plastica etichettati "biodegradabili" sono disponibili in commercio per uso agricolo come pacciamatura. Lavorazione del terreno rappresenta un metodo di smaltimento attraente, ma la degradazione in condizioni di campo è poco conosciuta. Lo scopo di questo studio è stato quello di sviluppare metodi per isolare funghi del suolo nativo e batteri che colonizzano i film di pacciamatura plastica dopo il campo di inumazione.

Isolamento dei nativi microrganismi del suolo con un potenziale di Breaking Down biodegradabili di pacciamatura film plastici utilizzati in agricoltura

Qui presentiamo un protocollo basato sul sistema di esca del verme della farina (Tenebrio molitor) che è stato utilizzato per isolare e selezionare funghi entomopatogeni (EPF) da campioni di suolo. Una formula efficace del numero di conidi (ECN) viene utilizzata per selezionare EPF ad alta tolleranza allo stress in base alle caratteristiche fisiologiche per il controllo microbico dei parassiti sul campo.

Isolamento e selezione di funghi entomopatogeni da campioni di suolo e valutazione della virulenza fungina contro gli insetti nocivi

Le colonie fungine entomopatogene sono isolate da campioni di terreno tropicale utilizzando l'esca Tenebrio , l'esca Galleria e il mezzo artificiale selettivo, cioè l'agar destrosio di patate arricchito con estratto di lievito integrato con cloramfenicolo, tiabendazolo e cicloeximide (mezzo CTC).

Confronto dei metodi per isolare i funghi entomopatogeni da campioni di suolo

Questo protocollo è un metodo efficace e veloce per coltivare lieviti e la muffa Aspergillus fumigatus da grandi serie di campioni di terreno in appena 7 giorni. I metodi possono essere facilmente modificati per adattarsi a una gamma di mezzi di incubazione e temperature necessarie per gli esperimenti.

Isolamento di lieviti e muffe coltivabili dai terreni per studiare la struttura della popolazione fungina

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Bioprospezione dei microrganismi estremofili per affrontare l'inquinamento ambientale

Il presente articolo si propone di fornire protocolli dettagliati e adeguati per l'isolamento di funghi endofiti associati alle piante, la conservazione a lungo termine degli isolati, la caratterizzazione morfologica e l'estrazione del DNA totale per la successiva identificazione molecolare e analisi metagenomica.

Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

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Una ricerca fondamentale in biologia cellulare è quello di definire i meccanismi che sono alla base l'identità degli organelli che rendono le cellule eucariotiche. Qui vi proponiamo un metodo per identificare i geni responsabili per l'integrità morfologica e funzionale degli organelli vegetali usando la microscopia a fluorescenza e di nuova generazione strumenti di sequenziamento.

Microscopia a fluorescenza-Screening e sequenziamento di prossima generazione: Strumenti utili per l&#39;identificazione di geni coinvolti in organelli Integrity

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