Utilizzo di uno spettrometro ciclico per la mobilità ionica per esperimenti di mobilità ionica tandem
20 gennaio 2022
La spettrometria di mobilità ionica (IMS) è un interessante complemento alla spettrometria di massa per la caratterizzazione delle biomolecole, in particolare perché è sensibile all'isomeria. Questo protocollo descrive un esperimento IMS (IMS/IMS) in tandem, che permette l'isolamento di una molecola e la generazione dei profili di mobilità dei suoi frammenti.
Il protocollo descrive come registrare un profilo di mobilità ionica per i frammenti prodotti dall'attivazione di una molecola nello spettrometro di massa e come discriminare tra strutture isomeriche. Il protocollo consente di classificare i glicani in 11 gruppi per quanto riguarda alcune delle loro caratteristiche strutturali chiave, e quindi fornire un'informazione altrimenti difficile da ottenere. Può servire a costruire reti molecolari estremamente generiche e adatte a molte famiglie molecolari, come metaboliti o farmaci di interesse in molte aree di ricerca.
L'approccio sfrutta al meglio un nuovo concetto di spettrometria di mobilità ionica e sarà utile laddove la spettrometria di massa da sola non riuscirà a discriminare tra due strutture. L'esperimento richiede una buona padronanza della spettrometria di massa e della mobilità ionica. Tuttavia, lo sperimentatore dovrebbe avere successo nell'implementazione del metodo se si segue attentamente ciascuno dei passaggi.
A dimostrare la procedura sarà Simon Ollivier, uno studente di dottorato del mio laboratorio. Per iniziare, impostare una sequenza IMS a passaggio singolo dalla pagina Tune, mettere lo strumento in modalità Mobility e aprire la finestra Cyclic Sequence Control. Selezionare Modalità avanzata dalla scheda Funzioni cicliche di questa nuova finestra, selezionare Aggiungi bundle, quindi Single/Multipass.
Attendere che una sequenza di eventi per dispositivi mobili venga visualizzata nella scheda Sequenza della stessa finestra. Adattare la sequenza in modo che tutti gli ioni calibranti facciano un singolo passaggio intorno alla pista IMS ciclica. Non modificare il tempo di iniezione o il tempo di espulsione e acquisizione, tuttavia, abbassare il tempo separato a un millisecondo.
Se alcuni ioni della miscela di calibrazione non rientrano nella finestra temporale di arrivo visualizzata, modificare la sincronizzazione dell'IMS con il pusher dell'analizzatore TOF di accelerazione ortogonale aumentando il numero di spinte per contenitore nella scheda Impostazioni ADC. Per registrare un'acquisizione di due minuti nella finestra Controllo sequenza ciclica, fare clic su Acquisisci per aprire la finestra popup Impostazioni acquisizione, immettere il nome file, la descrizione e la durata dell'acquisizione, minuti e fare clic su Salva. Passare lo strumento alla modalità TOF dalla pagina MS Tune per verificare la stabilità del segnale.
Registrare un'acquisizione completa del campione per un minuto, che sarà utile per verificare il pattern isotopico e la presenza di potenziali contaminanti. Metti lo strumento in modalità MSMS dalla scheda Profilo Quad/MS della pagina principale Tune. Selezionare la massa del ferro bersaglio nel campo di massa MSMS per l'isolamento nel quadrupolo.
Registrare un'acquisizione di un minuto per verificare l'isolamento del precursore durante l'elaborazione dei dati. Per eseguire una selezione basata sulla mobilità dell'isomero di interesse, passare lo strumento alla modalità Mobilità nella finestra Controllo sequenza ciclica, dalla scheda Funzioni cicliche selezionare Aggiungi bundle e quindi Slicing. Attendere che nella scheda Sequenza venga visualizzata una sequenza complessa di eventi per dispositivi mobili.
Posizionare l'evento Eject and Acquire subito dopo il primo evento Separato, quindi fare clic su Esegui. Cerca i risultati della separazione iniziale da visualizzare in tempo reale. Aumentare la durata del primo evento separato per una separazione multipass modificando il valore temporale per questo evento nella sequenza fino a quando la risoluzione dei picchi IMS non è soddisfacente.
Registrare un'acquisizione di un minuto come riferimento. Fate clic su Pausa (Pause), posizionate l'evento Eject and Acquire sotto gli eventi Eject, Eject to Pre-Store e Hold and Eject. Regolare la durata degli eventi in modo che il picco di destinazione si trovi nell'area Espelli in pre-archiviazione e qualsiasi altro ione si trovi nell'area Espelli o Blocca ed espelli.
Posizionate l'evento Eject and Acquire alla fine della sequenza sotto gli eventi Reinject from Pre-Store e i secondi eventi Separate. Fare clic su Esegui per visualizzare la popolazione selezionata. Controllare la qualità dell'isolamento.
Registrare un'acquisizione di un minuto come riferimento. Nella scheda Sequenza, nella colonna accanto agli orari degli eventi definiti dall'utente, cercare i tempi riepilogati di tutti gli eventi. Prendi nota del Time Abs trovato sulla linea dell'evento Reinject from Pre-Store per eseguire la calibrazione CCS.
Impostate la durata dell'evento Separate procedendo direttamente su Eject and Acquire su un millisecondo. Nella riga Reinject from Pre-Store selezionare la casella Abilita attivazione e ottimizzare la frammentazione con il controllo incorporato. Se la frammentazione non è soddisfacente con il controllo incorporato, deselezionare la casella Abilita attivazione e procedere all'ottimizzazione manuale delle tensioni di reiniezione, aumentare il gradiente pre-array e abbassare la tensione di offset dell'array fino a quando i risultati non sono soddisfacenti.
Per registrare un'acquisizione di due minuti nella finestra popup Acquisizione, selezionare l'opzione Mantieni tempo di deriva per generare un file contenente solo i tempi di arrivo, rispetto a M su Z etichettato come _dt.raw. Dopo aver eseguito l'analisi MS della miscela di pentasaccaride arabinoxilano, lo spettro ha mostrato un modello isotopico con un singolo picco a M su Z 685,24 suggerendo che i due composti sono di natura isomerica. Gli addotti dei pentasaccaridi sono stati separati attraverso la cella IMS ciclica e tre picchi sono stati separati con tempi di arrivo diversi.
L'XA3XX puro mostra i picchi a 83 e 90 millisecondi, mentre l'XA2XX mostra un picco a 94 millisecondi. Dopo il primo stadio di separazione IMS, gli ioni appartenenti a XA3XX sono stati espulsi e il picco a 94 millisecondi è stato selezionato per l'analisi IMS-IMS. Una separazione a tre passaggi è stata eseguita dopo aver reiniettato lo ione senza attivazione e un picco per XA2XX è stato ottenuto a 199 millisecondi.
I dati IMS-IMS MS generati sono stati de-convoluti utilizzando l'ora di arrivo e le dimensioni M su Z, generando gli spettri IMS-IMS. I picchi superiori allo 0,2% di intensità relativa sono stati esportati per la calibrazione CCS, risultando in uno spettro IMS-IMS calibrato CCS centroidato. È sempre importante controllare l'isolamento dello ione precursore, altrimenti lo spettro potrebbe provenire da una miscela del composto di interesse e dei contaminanti.
In precedenza abbiamo utilizzato spettri IMS-IMS per costruire reti e classificare composti, ma potrebbero anche essere utilizzati per cercare nei database le identificazioni dei composti. Questa tecnica è molto recente, ma ci aspettiamo che sarà estremamente utile in glicomica così come in qualsiasi contesto in cui gli analisti si confrontano con molecole isomeriche.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un esperimento di spettrometria di mobilità ionica in tandem (IMS/IMS) per la caratterizzazione di biomolecole, con particolare attenzione alla discriminazione di isomeri. Permette la classificazione dei glicani in gruppi strutturali distinti, facilitando la costruzione di reti molecolari.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Caratterizzazione biomolecolare
- Spettrometria di mobilità ionica
- Spettrometria di massa
Sfondo
- La spettrometria di mobilità ionica integra la spettrometria di massa.
- È sensibile all'isomeria, favorendo l'analisi strutturale.
- Il metodo è applicabile a diverse famiglie molecolari.
- Gli zuccheri complessi possono essere classificati in base a caratteristiche strutturali chiave.
Scopo dello studio
- Isolare molecole e analizzare i profili di mobilità dei loro frammenti.
- Distinguere in modo efficace tra strutture isomeriche.
- Fornire informazioni difficili da ottenere mediante spettrometria di massa esclusivamente.
Metodi Utilizzati
- Registrazione dei profili di mobilità ionica di molecole attivate.
- Discriminazione di strutture isomeriche in base ai dati di mobilità.
- Classificazione dei glicani in 11 gruppi.
- Costruzione di reti molecolari per varie applicazioni di ricerca.
Risultati principali
- Il protocollo isola ed analizza con successo frammenti molecolari.
- Permette una classificazione efficace dei glicani.
- Il metodo migliora la capacità di discriminare tra strutture simili.
- È adattabile a diverse famiglie molecolari, inclusi metaboliti e farmaci.
Conclusioni
- L'approccio tandem IMS/IMS è uno strumento prezioso nell'analisi biomolecolare.
- Fornisce informazioni che la spettrometria di massa tradizionale potrebbe non rilevare.
- Il metodo è accessibile seguendo con attenzione i passaggi del protocollo.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La spettrometria di mobilità ionica ciclica (IMS/IMS) consente una discriminazione strutturale ad alta risoluzione di biomolecole isomeriche, colmando una lacuna critica nell'affidabilità analitica per la glicomica e il profilo di metaboliti complessi. Questa capacità rafforza la scoperta precoce e la validazione degli obiettivi fornendo impronte molecolari che la spettrometria di massa da sola non riesce a risolvere, sostenendo decisioni ponderate sui portafogli. La riproducibilità e la specificità strutturale del metodo lo posizionano come un asset strategico per i flussi di R&S biofarmaceutici che affrontano complessità isomeriche.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente una classificazione strutturale precisa di glicani e metaboliti isomerici, supportando la riduzione dei rischi meccanicistici.
- Fornisce impronte molecolari per la chiarificazione dei percorsi metabolici e la validazione degli obiettivi in campioni biologici complessi.
- Facilita una triage affidabile di molecole candidate in base a caratteristiche strutturali non accessibili mediante spettrometria di massa (MS) da sola.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce spettri riproducibili e calibrati in base al CCS per la standardizzazione dei saggi e i flussi di lavoro di screening successivi.
- Supporta lo sviluppo di set di dati di riferimento validati per la valutazione ad alto rendimento di composti.
- Migliora la prontezza allo screening consentendo la discriminazione di composti strutturalmente simili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea la classificazione molecolare alla scoperta di biomarcatori rilevanti per la malattia quando è richiesta la risoluzione isomerica.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica fornendo dati strutturali robusti per la selezione dei candidati.
- Riduce il rischio di traduzione confermando l'identità molecolare in matrici biologiche complesse.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
L'IMS ciclica/IMS si integra nel percorso analitico della scoperta, collegando la fase iniziale di scoperta, l'identificazione dei composti promettenti e i flussi di lavoro preclinici in cui la discriminazione degli isomeri è essenziale.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio biologico risolvendo le strutture isomeriche nei pool di candidati.
- Screening: Fornisce profili di mobilità quantitativi e riproducibili, nonché output calibrati in base al CCS, per lo sviluppo di saggi.
- Analisi: Consente l'analisi di dati multidimensionali, inclusi il raggruppamento molecolare e la ricerca in banche dati per l'annotazione strutturale.
- Ricerca Translazionale: Facilita l'allineamento dei biomarcatori e la conferma dell'identità molecolare negli studi traslazionali.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma analitica riutilizzabile per diverse famiglie molecolari, inclusi glicani, metaboliti e farmaci.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella caratterizzazione molecolare.
- Valore operativo: Fornisce flussi di lavoro standardizzati e riproducibili per l'analisi strutturale ad alta risoluzione.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di avanzamento o interruzione e un progresso capital-efficiente di candidati strutturalmente complessi.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione corretta rispetto al rischio fornendo prove strutturali solide per la selezione dei candidati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nell'uso della spettrometria di massa e nell'operazione e interpretazione dei dati di mobilità ionica.
- Necessita di accesso a strumentazione avanzata di IMS ciclica e a standard di calibrazione del CCS.
- Richiede una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro per garantire acquisizione e analisi riproducibili.
- L'adattamento a diverse classi molecolari potrebbe richiedere un'ottimizzazione del protocollo per tipi di campione specifici.
- La qualità dell'isolamento e il controllo delle contaminazioni sono fondamentali per assegnazioni strutturali affidabili.
