Un approccio in vitro per studiare la disfunzione mitocondriale: un modello di cibridi
9 marzo 2022
I cibridi transmitocondriali sono cellule ibride ottenute fondendo cellule impoverite di DNA mitocondriale (mtDNA) (cellule rho0 ) con citoplasti (cellule enucleate) derivati da pazienti affetti da disturbi mitocondriali. Consentono la determinazione dell'origine nucleare o mitocondriale della malattia, la valutazione dell'attività biochimica e la conferma del ruolo patogenetico delle varianti correlate al mtDNA.
La cyber generation è ancora il protocollo all'avanguardia per comprendere il ruolo patogenetico di qualsiasi nuova mutazione del DNA mitocondriale e per correlare la percentuale di atriplasmia con la gravità della malattia. Questa tecnica consente di eseguire indagini biochimiche in un sistema nucleare omogeneo, in cui è assente il contributo del background nucleare del paziente. Questa tecnica consente di convalidare la patogenicità di una mutazione del DNA mitocondriale.
e permette di studiarne l'impatto a livello biochimico Lavare due volte le piastre da 35 millimetri contenenti i fibroblasti utilizzando due millilitri di 1X PBS senza calcio e magnesio. Pulire la superficie esterna dei piatti con etanolo al 70% e attendere che l'alcol evapori. Rimuovere i coperchi dai piatti e i tappi a vite dalle bottiglie.
Posizionare ogni piatto senza coperchio capovolto sul fondo di ogni flacone di centrifuga da 250 millilitri. Aggiungere lentamente 32 millilitri di un mezzo di nucleazione a ciascuna bottiglia permettendo al mezzo di entrare nel piatto e di entrare in contatto con le cellule. Rimuovere eventuali bolle dai piatti usando una lunga pipetta di pascolo di vetro, curvando la punta in una fiamma bunsen.
Chiudere ogni flacone con il tappo a vite e trasferirle nella centrifuga. Centrifugare per 20 minuti a 37 gradi Celsius e 8.000 x G.Aspirare il mezzo dalle bottiglie e scartarlo. Rimuovere i piatti invertendo le bottiglie su una garza sterile precedentemente spruzzata con etanolo al 70%.
Pulire la superficie esterna dei piatti e i loro coperchi con il 70% di etanolo e chiudere i piatti dopo che l'etanolo è evaporato. Prima di procedere controllare la formazione di citoplasti utilizzando un microscopio invertito per cellule vive. Cerca fibroblasti estremamente allungati a causa dell'estrusione dei loro nuclei indotta dalla citocalasina.
Ad ogni piatto da 35 millimetri aggiungere 1.000, 143 celle zero riga. Ri-sospeso in due millilitri di terreno di coltura integrato con il 5% FBS. Lasciare i piatti per tre ore in un incubatore di anidride carbonica umidificata per sistemare le 143 celle zero file sui fantasmi.
Dopo tre ore di incubazione, aspirare e scartare il mezzo. Lavare le cellule di aderenza due volte con due millilitri di mezzo ad alto contenuto di glucosio DMEM senza siero o MEM, quindi aspirare e scartare il mezzo. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di polietilenglicole alle cellule e incubare per esattamente un minuto.
Aspirare ed eliminare la soluzione di polietilenglicole. Lavare le cellule tre volte con due millilitri di DMEM ad alto glucosio senza siero o con MEM. Aggiungere due millilitri di mezzo di fusione e incubare durante la notte nell'incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Tripsinizzare le cellule nei restanti piatti di coltura Contarle e seminarle in una o più piastre di Petri Aggiungi da 50 a 100 cellule per piatto nella coltura integrata fino a quando non compaiono i cloni. Quindi lasciali crescere per diversi giorni. Usando uno stereomicroscopio, raccogli i cloni dalla capsula di Petri con cilindri di clonazione o una punta di pipetta.
Cerca di evitare di raggruppare diversi cloni e trasferirli in una piastra da 96 pozzi, ciascuno contenente 200 microlitri di terreno di coltura integrato. I cibridi sono stati generati a partire da fibroblasti derivati da un paziente portatore dell'eteroplasmatico M2343A2G Una delle più comuni mutazioni del DNA mitocondriale associate a miopatia mitocondriale, acidosi lattica da encefalopatia ed episodi simili a ictus. L'analisi di un numero variabile di ripetizioni in tandem ha mostrato che il DNA informatico è identico alle cellule della riga zero confermando la sostituzione del DNA informatico del paziente con il genoma 143 B.
Il polimorfismo di lunghezza del frammento di restrizione, o analisi di sequenziamento, può essere utilizzato per valutare la presenza della mutazione del DNA mitocondriale e la percentuale di eteroplasmia. Quando si tenta questo protocollo è importante verificare il corretto patrimonio genetico del NUCLEONE e del DNA mitocondriale, nonché la quantità di DNA mitocondriale nei cibridi ripopolati.
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Panoramica
I citoplasmiotri trasmitocondriali sono cellule ibride create fondendo cellule prive di mtDNA con citoplasti di pazienti affetti da disturbi mitocondriali. Questo approccio aiuta a determinare l'origine delle malattie e a valutare le attività biochimiche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Genetica mitocondriale
Sfondo
- I citoplasmioti trasmitocondriali sono essenziali per lo studio dei disturbi mitocondriali.
- Permettono l'analisi del contributo nucleare e mitocondriale alla malattia.
- Questa tecnica è fondamentale per validare la patogenicità delle mutazioni del DNA mitocondriale.
- Comprendere l'impatto biochimico delle mutazioni è fondamentale per la gestione della malattia.
Scopo dello studio
- Studiare il ruolo patogenetico di nuove mutazioni del DNA mitocondriale.
- Correlare la percentuale di eteroplasmia con la gravità della malattia.
- Eseguire indagini biochimiche in un ambiente nucleare controllato.
Metodi Utilizzati
- Fusione di cellule rho 0 con citoplasti enucleati.
- Test biochimici per valutare la funzione mitocondriale.
- Convalida delle mutazioni del mtDNA mediante analisi di citobridi.
- Uso di PBS ed etanolo per la preparazione delle cellule.
Risultati principali
- Creazione con successo di citoplasmi trasmitocondriali.
- Identificazione di attività biochimiche associate a mutazioni del DNA mitocondriale.
- Stabilimento di una correlazione tra livelli di eteroplasmia e esiti della malattia.
- Conferma del ruolo patogeno di specifiche varianti del DNA mitocondriale.
Conclusioni
- I citoplasmi trasmitocondriali sono efficaci per lo studio delle malattie mitocondriali.
- Questo metodo migliora la comprensione delle mutazioni del DNA mitocondriale e dei loro effetti.
- La ricerca futura potrà basarsi su questi risultati per sviluppare terapie mirate.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
I modelli citoplasmatici transmitocondriali consentono un'analisi precisa del contributo genetico mitocondriale rispetto a quello nucleare nella disfunzione del sistema OXPHOS, un punto critico nella ricerca sulle malattie mitocondriali. Questo approccio fornisce una riduzione del rischio meccanicistica e la validazione degli obiettivi per le mutazioni del DNA mitocondriale, sostenendo una maggiore affidabilità predittiva nella scoperta e nella ricerca traslazionale nelle fasi iniziali. La capacità del sistema citoplasmatico di isolare e caratterizzare la patogenicità costituisce la base per decisioni ponderate sul portafoglio di programmi per i disturbi mitocondriali.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Permette un'analisi diretta della patogenicità delle mutazioni del DNA mitocondriale in un contesto nucleare controllato.
- Supporta la validazione funzionale degli obiettivi distinguendo i difetti del sistema OXPHOS causati dal DNA mitocondriale da quelli causati dal DNA nucleare.
- Semplifica la riduzione del rischio meccanicistico per nuove varianti mitocondriali prima di investimenti successivi.
- Fornisce una piattaforma per correlare i livelli di eteroplasmia con fenotipi rilevanti per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Stabilisce linee di citobridi validate per saggi biochimici e genetici riproducibili.
- Consente la misurazione quantitativa dell'attività OXPHOS e dell'impatto delle mutazioni.
- Permette la standardizzazione dei saggi e la riproducibilità tra laboratori nella ricerca mitocondriale.
- Prepara sistemi cellulari robusti per lo screening di composti mirati alla disfunzione mitocondriale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea modelli citoplasmatici pertinenti alle malattie allo sviluppo traslazionale di biomarcatori.
- Garantisce continuità dalla scoperta genetica alla validazione preclinica di bersagli mitocondriali.
- Permette un avanzamento dei trattamenti sperimentali aggiustato in base al rischio, basato su evidenze meccanicistiche.
- Supporta la riduzione predittiva del rischio per portafogli di malattie mitocondriali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello citobrido si integra nel percorso dalla scoperta alla fase preclinica permettendo la verifica delle ipotesi, la validazione dei bersagli e la chiarificazione dei meccanismi nei disturbi mitocondriali.
- Biologia della Scoperta: Supporta il test dell'ipotesi nulla per la patogenicità delle mutazioni del mtDNA e chiarisce i fattori genetici responsabili del malfunzionamento della catena respiratoria.
- Screening: Fornisce linee cellulari citoplasmatiche standardizzate e riproducibili per saggi biochimici quantitativi.
- Analisi: Fornisce letture quantitative dell'eteroplasmia e dell'attività della catena respiratoria per analisi comparative.
- Ricerca Translazionale: Collega le scoperte genetiche alla validazione in modelli preclinici e all'allineamento dei biomarcatori.
- Riutilizzo Aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per la scoperta continua di nuovi bersagli mitocondriali e biomarcatori.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella ricerca sulle malattie mitocondriali.
- Valore operativo: Standardizza la generazione e la caratterizzazione di citoblasti per garantire riproducibilità e scalabilità.
- Valore strategico: Permette decisioni informate di prosecuzione o interruzione e una gestione efficiente del portafoglio in termini di capitale.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento di programmi per i disturbi mitocondriali con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche nella fusione cellulare, nella genetica mitocondriale e nello sviluppo di saggi biochimici.
- Richiede l'accesso a infrastrutture specializzate per la coltura cellulare, la centrifugazione e l'analisi molecolare.
- Necessita di una rigorosa standardizzazione tra i diversi gruppi di lavoro dei protocolli di generazione e validazione dei citibridi.
- Potrebbe richiedere adattamenti per diversi tipi cellulari o contesti genetici rilevanti per la malattia.
- La verifica del patrimonio genetico nucleare e mitocondriale è essenziale per la fedeltà del modello.
